苏州大学附属第一医院 苏州 215000
[摘要] 目的：研究C-反应蛋白（CRP）基因rs3093059多态性与脑梗死的相关性。方法：采用酶联免疫吸附法测定CRP水平；用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测CRP基因rs3093059多态性。结果：病例组CRP水平高于对照组；各基因型之间的CRP水平无明显差异。结论： CRP基因rs3093059多态性与脑梗死无关。
[关键词] C-反应蛋白；脑梗死；基因多态性；rs3093059
[Abstract] Objective: To investigate the association of C-reactive protein (CRP) gene polymorphism and cerebral infarction. Methods: The serum CRP level was measured by enzyme linked immunosorbent assay and the CRP gene polymorphism was genotyped by Polymerase reaction restriction-fragment length polymorphism. Results:The serum CRP level was higher in case group thanthe control group and serum CRP level was not influenced by the CRP gene polymorphism. Conclusions: The CRP gene rs3093059 polymorphism does not affect the cerebral infarction.
[Key words] C-reactive protein; cerebral infarction; gene polymorphism; rs3093059
脑梗死发展的病理基础为动脉粥样硬化，炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用。CRP作为一种急性炎症反应蛋白近年越来越多的受到心脑血管研究者的关注。有研究表明，血清 CRP 水平可能是判断急性脑梗死患者短期死亡率的一个预测因素[1]，而遗传因素能解释个体间35-40％CRP水平的差异[2]，因此，本文就CRP基因多态性与脑梗死的相关性做进一步研究。
1 研究对象
病例组选取我院2012年至2014住院脑梗死者150例，其中男性85例，女性65例，发病时间均≤3d。诊断符合全国第四届脑血管病会议修订的诊断标准[3]，并经MRI证实。对照组选出经MRI检查排除脑梗死者150例，男82例，女68例。所有入选者均排除有炎症性、肝肾功能不全、肿瘤等可能会影响CRP水平的疾病。
2研究方法
2.1 标本采集：所有被检查者均隔夜禁食 12 h，次日清晨抽取肘静脉血 5ml。
2.2 采用酶联免疫吸附法测定CRP的含量。
2.3 以经典酚-氯仿提取白细胞基因组DNA。
2.4 PCR扩增：根据GENEBANK的CRP基因全DNA序列rs3093059设计引物，上游引物：5'-GTAGTAAGATTGACAGACAG-3'，下游引物：5'-TTCTCATTGTTCAATTCCCA-3'。PCR扩增反应体系（50μl）：Ex Taq酶12μl、上游引物（浓度20μM）1μl、下游引物（浓度20μM）1μl、去离子水35μl、模板DNA1μl。反应条件：首先：94℃预变性5min；其次：94℃变性1min，53℃退火48s，72℃延伸48s，共35个循环；最后：72℃延伸10min。
2.5 酶切：PCR产物由限制性内切酶MfeⅠ进行酶切，反应体系20μl：PCR产物10μl，10×缓冲液2μl，BSA2μl，内切酶MfeⅠ0.5μl，去离子水5.8μl，37℃水浴过夜。PCR扩增获得314bp的特异性片段，该片段经酶切后显示CC（314bp）、TC（314bp、234bp和80bp）和TT（234bp和80bp）三种基因型（图1）。
2.6 测序：PCR产物经测序进一步验证。
3 统计方法
采用SPSS 17.0软件分析数据。计量资料为正态分布者以均数±标准差表示，采用t检验；CRP呈偏态分布，将其转换为log CRP，通过Kolmogorov-Smirnov检验近似正态分布再进行检验。基因型频率与Hardy-Weinberg平衡的符合程度和计数资料比较采用χ2检验。本研究人群经χ2检验符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律（P>0.05），具有群体代表性。
4 结果
4.1 临床资料
病例组与对照组相比，年龄、吸烟、高血压、糖尿病、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白及log CRP均有明显差异（表1）。
4.2 CRP rs3093059各基因型比较（表2）
病例组及对照组各基因型及等位基因分布基本相同，无统计学意义（P>0.05）。
4.3 CRP rs3093059各基因型之间的血清水平比较
病例组及对照组中各基因型之间CRP水平无显著差异（表3）。
5 讨论
心脑血管疾病是严重威胁人类健康的疾病之一，近年来，我国脑卒中的发病率逐年升高。脑梗死是多种原因导致的脑组织缺血缺氧而坏死的一种疾病，其具有 发 病 率、病 死率、复发率、致残率高的特点，但具体的发病机制仍未完全阐明[4]。因此，深入研究其病因、发病机制并制定相应的防治对策已成为当前研究者的迫切任务之一。目前多种研究发现其受遗传、环境及自身免疫等影响。因此，基因多态性与脑梗死的相关性逐渐成为研究的热点。
目前相关报道中，载脂蛋白基因多态性与脑梗死的研究较多，如张斌[5]等人对多个报道进行了Meta分析，提出相关基因多态性与脑梗死的相关性。另外，还有胆固醇酯转运蛋白[6]、氧化固醇结合蛋白相关蛋白[7]、谷胱甘肽硫转移酶[8]等多种蛋白基因多态性与脑梗死的相关报道。而CRP基因多态性的相关研究也有部分报道，如Miller[9]等调整年龄、吸烟和体重指数等因素后，显示三个不同人群（WHS、PRINCE、PHS）rs3093059的次等位基因与CRP高水平有关。Morita [10]等检测CRP 基因rs1341665、rs1800947、rs1130864及rs1205 后发现 ，仅 rs1800947 与缺血性卒中有显著关联。Kuhlenbaeumer [11]等研究发现 ( rs3093075，rs1130864 和rs1800947) 与微血管中风相关。而对于CRP基因rs3093059多态性与脑梗死的相关性报道较少，本研究对脑梗死患者的CRP基因rs3093059多态性进行了相关研究，未发现该基因对此类患者有任何影响，并进一步证实CRP基因rs3093059多态性与其血清水平无任何相关性。分析原因，笔者认为，CRP 的含量不仅受疾病本身，也可能受其他基因多态性甚至是未被发现的基因及地域差异、生活方式、遗传背景及环境等多种因素影响。
综上所述，本研究进一步证实脑梗死的发病与高龄、吸烟、高血压、糖尿病及高血脂及CRP水平升高密切相关；而CRP基因rs3093059多态性与脑梗死无关，种族、地区限制及研究对象数量偏少是本研究不足之处，因此，我们仍将扩大标本量，并进行多种族、地区人群来进行研究。
[参考文献]
1.Terruzzi A，Valente L，Mariani R，et al． C-reactive protein and aeti-ological subtypes of cerebral infarction [J]． Neurol Sci,2008,29( 4) : 245-249.
2.Pankow JS, Folsom AR, Cushman M, et al. Familial and genetic determinants of systemic markers of inflammation: the NHLBI family heart study [J]. Atherosclerosis, 2001, 154 (3) : 681-689.
3.卫生部疾病控制司，中华医学会神经科分会． 中国脑血管病防治指南( 节选) [J]． 中国现代神经疾病杂志，2007，7( 2) : 200-209．
4. 段春梅，邹飒枫．脑梗死危险因素研究进展 [J]．中国实用神经疾病杂志，2012，15（3）：93－95．
5.张斌，李蔚，徐芳等. 中国人载脂蛋白 E基因多态性与脑梗死的Meta分析 [J]．中国实用神经疾病杂志，2015，18（1）：21－23．
6.王贵喜，张佳. 胆固醇酯转运蛋白D442G 基因多态性与脑梗死的关系 [J]．包头医学院学报，2015，31（11）：1－2．
7.代杰，张世亮，田蕊等. 氧化固醇结合蛋白相关蛋白 -9 基因多态性与脑梗死的相关性研究 [J]．中国现代医学杂志，2015，25（22）：41－45.
8.陈兰英，刘仁斌. 谷胱甘肽硫转移酶Pi 基因多态性与急性脑梗死的关系研究 [J]．实用心脑肺血管病杂志，2015，23（5）：28－30.
9.Miller DT, Zee RY, Suk DJ, et al. Association of common CRP gene variants with CRP levels and cardiovascular events [J]. Ann Intern Med, 2005, 69 (Pt 6) : 623-638.
10.Morita A,Nakayama T,Soma M. Association study between C-reactive protein genes and ischemic stroke in Japanese subjects[J]. Am J Hypertens,2006,19: 593-600.
11.Kuhlenbaeumer G,Huge A,Berger K,et al. Genetic variants in the C-reactive protein gene are associated with microangiopathic ischemic stroke [J]. Cerebrovasc Dis,2010,30: 476-482.
论文作者:董万利
论文发表刊物:《临床医学教育》2017年10月
论文发表时间:2017/11/17
标签：多态性论文; 基因论文; 脑梗死论文; 蛋白论文; 相关性论文; 引物论文; 水平论文; 《临床医学教育》2017年10月论文;