济源职业技术学院护理系 河南 济源 459000
摘要： 目的 观察IL-1β抑制大鼠离体幽门括约肌自发收缩的影响因素，初步探讨其作用机制，为IL-1β在平滑肌舒张方面的作用机制作进一步补充，为其临床应用提供实验室的依据。方法 成年SD大鼠（雌雄不拘）随机分为正常组、IL-1β组、格列苯脲组、吲哚美辛组。采用离体组织灌流的方法，用RM6240C生物信号采集系统观察IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩作用的影响；通过应用不同信号途径的特异性阻断剂，探讨IL-1β的作用机制；所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析。结果 1．IL-1β组：IL-1β（终浓度为2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml）能抑制大鼠离体幽门括约肌自发收缩的振幅、频率和张力（P＜0.05，n=9）。2．格列苯脲（5μM）对IL-1β抑制大鼠离体幽门括约肌的自发收缩作用无影响（P＞0.05，n=6）。3．吲哚美辛（10μM）能部分抵消IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的抑制作用，与IL-1β单独作用相比，振幅、频率和张力均较高（P＜0.05，n=6）。小结 IL-1β能抑制大鼠离体幽门括约肌的自发收缩，其作用可被吲哚美辛部分阻断，而不受格列苯脲影响，说明其机制很可能与前列环素有关，而与KATP通道无关。
关键词： IL-1β Ca2+ 幽门括约肌 KATP 前列环素
【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0317-02
Influence factor of IL-1β on spontaneous contraction of isolated rats’ pyloric sphincter
Fan Shuangli
（Nursing department, Jiyuan Vocational and Technical College , Henan Jiyuan,459000）
Abstract Objective This study was planned to investigate the effect and mechanism of IL-1β on the spontaneous contractions of isolated rats’ pyloric sphincter in order to replenish the pharmacological effect of IL-1β.Methods Male or female Sprague-Dawley rats were divided into four groups randomly: normal group, IL-1β group, indomethacin group and glibenclamide group, then killed by cervical dislocation to excise the pyloric sphincter. Perfusion of isolated rat pyloric sphincter was used to evaluate the effect of each group. Results 1. IL-1β group:Addition of the IL-1β induced an inhibition of the spontaneous contractions. The amplitude, frequency and tension were decreased.2. Pretreatment of the tissues with glyburide (5μM) was without significant effects on the spontaneous contractions responses to IL-1β (P> 0.05, n = 6).3. Pretreatment of the tissues with indomethacin (10μM) attenuated the inhibitory effects of IL-1β. The amplitude, frequency and tension were increased compared with indomethacin absented (P <0.05, n = 6).Conclusion IL-1β can inhibit spontaneous contractions on rats’ isolated pyloric sphincter. The inhibitory effects of IL-1β has a certain relationship with KATP channel and prostacyclin.
Key words: IL-1β; Ca2+; pyloric sphincter;KATP channel;prostacyclin
胃肌层由三层平滑肌构成：外层纵形肌，中层环形肌，内层斜行肌，其中环形肌最为发达，在幽门处特别增厚形成幽门括约肌。幽门括约肌的运动受多种因素的调控, 包括神经因素, 体液因素和局部激素等。其中主要因素是神经因素和体液因素, 有文献报道，影响平滑肌张力的因素有：DAG/PKC信号系统、IP3/Ca2+信号系统、细胞内cAMP和cGMP的含量以及钾离子通道的开放状态[1，2]。
资料表明，IL-1能够促进前列环素的生成，而IL-1β通过PGE途径增强兔子宫平滑肌收缩幅度和振幅，吲哚美辛可阻断此效应[3]。IL-1β通过抑制蛋白质的合成同时激活ATP敏感性K+通道，进而抑制去甲肾上腺素诱导的大鼠主动脉收缩[4]。由此推断，IL-1β也可能抑制幽门括约肌的自发收缩，其机制又是如何？IL-1β能抑制大鼠离体幽门括约肌的自发收缩，其作用可被亚甲基蓝、L-NAME部分阻断，说明其机制很可能与cGMP、NO有关[5]。
本研究采用离体组织灌流的方法，观察IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的影响，为IL-1β在平滑肌舒张方面的作用机制作进一步补充，为其临床应用提供实验室的依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1主要试剂
白介素-1β，ProSpec；格列本脲，上海莱枫生物科技有限公司；吲哚美辛，Sigma。
1.1.2主要仪器设备
RM6240B/C生物信号采集处理系统，成都仪器厂；换能器，成都仪器厂；恒温浴槽，成都仪器厂；灌流槽，成都仪器厂；倒置解剖显微镜，LeicaDMIL。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物
SPF级成年SD大鼠（河南省实验动物中心提供，许可证号SCXK (豫) (2010-0002），体重（200-250）g，雌雄不拘。
1.2.2 大鼠离体幽门括约肌标本制备
SPF级成年SD大鼠，雌雄兼可，实验前禁食24h，饮水自由。实验时颈椎脱臼快速处死，打开腹腔，暴露胃底，分离幽门周围组织，立即离体幽门括约肌，放入有Krebs液的培养皿中洗去内容物。在解剖显微镜下清除周围组织，制备成幽门括约肌条，长10mm，宽2mm[6]。在肌条两端分别穿双股棉线，一端棉线悬挂于不锈钢钩，固定在灌流槽的底部，另一端棉线与张力换能器相连，连接到RM6240C型生物信号采集系统，记录张力-效应曲线。根据长度-张力曲线，给予1 g前负荷，使肌条拉伸至最适长度。标本在灌流槽中稳定40 min，10 min换Krebs液一次，肌条出现自发收缩，观察自发收缩曲线，待标本活动稳定后，进行实验。实验过程中，肌条所在溶液中持续供应95%O2和5%CO2的混合气体，同时，灌流槽内温度维持在37℃[5]。
1.2.3 实验分组与处理
标本分为：正常组、IL-1β组、无钙液组、格列苯脲组、吲哚美辛组。
1.2.3.1 正常组实验处理
离体肌条在灌流槽中稳定40 min后，持续记录张力-效应曲线，观察无任何处理时，幽门括约肌的收缩振幅、频率、张力的变化，此为正常对照组。
1.2.3.2 IL-1β组实验处理：观察不同浓度IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的影响
离体肌条在灌流槽中稳定40 min后，自发收缩基本平稳，分别加入终浓度为2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的IL-1β溶液，观察不同浓度的IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的作用，记录浓度-效应曲线。IL-1β作用60min后，Krebs液冲洗标本3次，每次10 min，直至标本自发收缩回复至稳定状态。
比较各浓度IL-1β对离体幽门括约肌自发收缩的振幅、频率、张力的作用。
1.2.3.3 无钙液—IL-1β组处理：观察IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的影响与细胞外钙离子的关系
离体肌条在灌流槽中稳定40 min后，更换无钙Krebs液，平衡30 min（10 min换无钙Krebs液一次），分别加入终浓度为2ng/ml、20ng/mL、200 ng/mL的IL-1β溶液，持续记录张力-效应曲线60 min，此为实验组。
离体肌条在正常克氏液中孵育70 min（10 min换Krebs液一次）后，分别加入终浓度为2ng/ml、20ng/mL、200 ng/ml的IL-1β溶液，持续记录张力-效应曲线60 min，此为对照组。
观察并比较实验组与对照组中，IL-1β对离体幽门括约肌自发收缩的振幅、频率、张力的影响。
1.2.3.4 吲哚美辛组、格列本脲组实验处理：观察IL-1β对大鼠离体幽门括约肌的作用与前列环素、KATP通道的关系
离体肌条在灌流槽中稳定70 min后，分别加入终浓度分别为2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的IL-1β溶液，孵育60min，记录张力-效应曲线，此为对照组。实验结束后，Krebs液冲洗标本3次，每次10 min，直至肌条恢复至稳定水平。实验组分别为吲哚美辛组、格列本脲组，处理如下：各组离体肌条在灌流槽中稳定40 min后，分别加入终浓度为2×10-6 mol/L的吲哚美辛、5×10-6 mol/L的格列本脲，孵育30 min，每组中分别加入终浓度为2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的IL-1β溶液，记录各组张力-效应曲线60 min。观察不同药物孵育后，IL-1β对离体幽门括约肌自发收缩的影响。实验结束后，Krebs液冲洗标本3次，每次10 min，直至肌条回复至稳定水平。
1.2.4 数据分析
IL-1β的效应曲线由RM6240C型生物信号采集处理系统获得，所有实验数据均用平均数士标准差（mean±S.E.M.）表示，t，检验进行组间、组内的显著性差异比较。P<0.05表示有差异，P<0.01有显著差异。所有统计分析采用SPSS 17.0统计软件完成。
2.结果
2.1 大鼠离体幽门括约肌自发收缩
大鼠离体幽门括约肌肌条在浴槽中平衡一段时间后，肌条开始出现自发收缩，将无自发收缩波或自发收缩张力较小（＜1g）的标本舍弃，持续记录大鼠离体幽门括约肌自发收缩曲线60min，其收缩的振幅为：0.44±0.01g，频率为：3.91±0.08cpm，张力为：1.27±0.02g，（n=10）。
2.2 不同浓度的IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的作用
肌条在浴槽中稳定40min后，自发收缩基本稳定，分别加入终浓度为2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的IL-1β，孵育60min，大鼠离体幽门括约肌自发收缩的振幅、频率和张力均被抑制，与给药前相比出现不同程度的下降，且差异显著。（见图1）。
图1 IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的影响（a、IL-1β终浓度为2ng/ml，b、IL-1β终浓度为20ng/ml，c、IL-1β终浓度为200ng/ml）。
由表1可见，与给药前相比，终浓度为2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的IL-1β均能抑制大鼠离体幽门括约肌的自发收缩（n=9）。
表1 不同浓度的IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的作用
2.4 吲哚美辛作用下IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的作用
离体肌条在Krebs液中平衡40 min后，加入终浓度为2×10-6 mol/L的吲哚美辛，孵育30 min，分别加入终浓度为2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的IL-1β溶液，与IL-1β单独作用组相比，大鼠离体幽门括约肌自发收缩的振幅、频率和张力均不同程度地增加，即IL-1β对大鼠离体幽门括约肌自发收缩的抑制作用被吲哚美辛部分抵消，两组相比有差异但不显著（P＜0.05，n=6）。结果见图6-8。
3.讨论
为了确定IL-1β是否通过前列环素抑制幽门括约肌自发收缩，本研究选择前列环素合成酶的抑制药——吲哚美辛，阻断前列环素的合成，结果显示吲哚美辛能够部分抵消IL-1β抑制幽门括约肌自发收缩的作用。前列环素与其受体P结合后，通过激活腺苷酸环化酶（AC）增加cAMP的生成，cAMP进一步激活蛋白激酶A（PKA），而PKA能够使钙通道磷酸化，使钙通道的活性下降，最终引起平滑肌舒张[13]。其中，腺苷酸环化酶的激活是由活化的G蛋白来完成的。G蛋白耦联的受体信号系统是细胞中最常见的信号传递方式，主要由四部分构成：G蛋白、受体、第二信使以及效应物。G蛋白的失活是由于其α亚单位与GDP结合所致。当受体与信号分子结合后，活化的受体与G蛋白的α亚单位结合，构象改变，α亚单位与GDP解离进而与胞质中的GTP结合，激活G蛋白[7]。因此， IL-1β抑制幽门括约肌自发收缩被吲哚美辛部分抵消，说明其作用机制很可能与前列环素有关，但具体是如何发挥作用的尚待进一步研究。
对于可兴奋细胞，兴奋后复极化的关键是膜上的钾离子通道的开放状态，它能使细胞膜的静息电位与阈电位之间保持一定的水平。研究表明，当平滑肌细胞膜上的钾离子通道开放时，细胞膜超极化[8]，从而抑制细胞内钙库中钙离子的释放，导致细胞内的游离钙离子浓度下降，平滑肌舒张[9]。目前认为，幽门括约肌细胞上存在的钾离子通道有四种：即ATP 敏感性钾离子通道（KATP通道）、高电导钙激活性钾离子通道、低电导钙激活性钾离子通道以及延迟整流性钾离子通道，其中调节幽门括约肌自发收缩的主要钾离子通道是ATP 敏感性钾离子通道[10，11]。目前的研究发现，格列苯脲是KATP通道的特异性拮抗药，它能够拮抗此通道开放所引起的平滑肌的舒张作用，但是，格列本脲本身并不能改变幽门括约肌的静息膜电位和肌肉张力，可能与静息状态下ATP 敏感性钾离子通道处于关闭状态有关[12、13]。为了确定IL-1β抑制幽门括约肌自发收缩是否与钾离子通道的开放状态有关，本研究用格列本脲进行阻断，结果显示格列本脲对IL-1β抑制幽门括约肌自发收缩作用的影响不明显，无统计学意义，说明IL-1β抑制幽门括约肌自发收缩与KATP的开放状态无关。
综上所述，IL-1β能够抑制大鼠离体幽门括约肌的自发收缩，表现为浓度依赖性，其作用机制可能与前列环素有关，而与KATP通道无关。
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论文作者:范双莉 任亚丽
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/26
标签：幽门论文; 括约肌论文; 离体论文; 大鼠论文; 吲哚论文; 浓度论文; 作用论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;