刘运强[1]2001年在《家蚕线粒体基因组全序列测定及分析》文中研究说明线粒体基因组作为一种核外遗传系统，具有小型性，自主性和多态性等特点。有关线粒体基因组的研究将有利于研究诸如基因结构与功能、基因表达的时空调控、核质互作、分子进化规律、物种的起源与分化以及线粒体的起源等生物学重要课题。 家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目绢丝昆虫，也是一种重要的传统遗传学和分子生物学研究模式生物。开展家蚕线粒体基因组研究，一方面可以丰富线粒体基因组数据库，另一方面，通过线粒体基因组比较研究，可以阐明其基因组成、基因排列和基因结构特点以及其进化特点，并且进一步可以探讨物种间线粒体DNA（mtDNA）系统演化关系。 本论文主要测定和分析了家蚕线粒体全序列，并且对物种间mtDNA的进化特点和系统演化等进行了研究。1 家蚕线粒体基因组基因组成与基因排列 家蚕线粒体基因组全序列长度为15644bp，包含13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和一段498bp的AT富集区（图1），AT含量为81％，与果蝇D.melanogaster的相同。 基因排列与果蝇D.melanogaster的相比，tRNA的位置发生了变化，家蚕线粒体基因组中，其位于AT富集区与tRNA基因之间，而在果蝇mtDNA中，位于tRNA基因与ND2基因之间，其他基因排列一致。2 家蚕线粒体基因组tRNA基因结构 推测了家蚕线粒体DNA编码的22个tRNA基因二级结构，发现8个基因的二级结构中，在氨基酸接受臂，二氢尿嘧啶（DHU）臂和反密码子臂有错配和不匹配现象。另外，各tRNA除反密码子环为标准的7个碱基外，DHU环和TΨC环的核苷酸数量变化都较大。3 家蚕线粒体基因组rRNA基因序列 家蚕线粒体DNA编码的16S rRNA基因比进行比较的其他10个节肢动物的长，12SrRNA基因较进行比较的其他昆虫的短。家蚕rRNA序列与果蝇和蚊子的相似性最高。4 家蚕线粒体基因组蛋白编码基因结构 家蚕线粒体DNA蛋白编码基因较多使用富含AT的密码子，密码子第3位碱基序列AT含量高达92.8％，这与序列富含AT碱基相一致。另外，多数情况下，密码子的第3位碱基与反密码子的第1位碱基不匹配。这种现象在其他昆虫mtDNA中也普遍存在，反映了其蛋白质基因编码偏好性。 家蚕线粒体蛋白编码基因序列以及其氨基酸序列与果蝇D.melanogaster相应序列最相似。 M rawe．． 图1 家蚕线粒体基因组基因组成l－22：tR＼A‘”，tRNA’I’；tRNA“‘“tRKA””tRNA‘’”tRNAT”’tRNA‘””tRNA‘’”tRNA‘“‘tRNA’tRyAl“tRNA”‘tR＊丫－”t＊＊＊一tRN矿“t yy人’－iRk”‘－，t＊＊人”『，t＊＊”’‘’止＊＼矿－’．tRV矿－，tR＊”；＊DI、6．＊D4 L：烟进氨腺0＄吟盼氢酶（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase）l—6 W单位和 4L W单位基冈：ml－111：细胞色素氧化酶（。歹t。。M。＊e。h湘＊e）卜3 W单位基冈；厂h＊的，8：川”P酶夏合物6，8亚单位基因：Otb：细胞色素b基因；kRkA：165 YRkA：Sd＼A：125 rRNI：《T rich 灯哀钳c；环外基因为H链编码，环内基冈为L链编码。slZ个物种线粒体 DNA系统进化分析 分别利用线粒体CO门基因序列，氨基酸序列以及密码子第1，2位碱基序列和第2位碱基序列对8种单肢亚门昆虫纲动物（家蚕和凤蝶，2种果蝇．2种蚊子，蝗虫，蜜蜂），2种甲壳亚门动物（卤虫和水蚤），2种鳖肢亚门动物（六角硬婢和血红扇头蝉）进行系统进化分析。基因序列和氨基酸序列通过邻接法获得的系统进化树枝型结构一致，进化树如图2所示。其中，除蜜蜂外，上述系统分化关系基本反映了3个亚门的关系。蜜蜂位于螫肢亚 I”］动物的进化枝上，可能是由于蜜螂线粒体 DNA异常的变异类型，模糊了其进化信号。一 囱虹间垒＠ Wy‘if ti N＼ ／．” 卜一一一一一——逐虫 波子2———－J。 一、。‘J 卜－ j ＼ t． 臼子11＼－ 皿问2上’ —一’月间lA问 一 MZ ggtl：：：＃“””列”““ 阉主下角标尺为地传曰离革位 由密码于第1，2位碱基序列和第2位碱基序列分别获得的系统进化树与上述进化
鲁成, 刘运强, 廖顺尧, 李斌, 向仲怀[2]2002年在《家蚕线粒体基因组全序列测定与分析》文中研究指明家蚕(Bombyxmori )线粒体基因组全序列为15664bp,AT含量较高,为81.3%,包括13个蛋白质编码基因,2个rRNA基因,22个tRNA基因和一段498bp的A+T富集区域。与其它10种节肢动物线粒体基因组全序列相比,家蚕与果蝇(Drosophilamelanogaster )在核苷酸组成、编码偏好性、以及氨基酸组成上较相近,只是在基因排列上,tRNAMet的位置发生了重排,在家蚕线粒体基因组中,tRNAMet位于AT富集区与tRNAIle之间,而在果蝇中,其位于tRNAGln与ND2基因之间。
夏玉玲[3]2003年在《中国野桑蚕线粒体基因组研究》文中研究表明线粒体基因组作为细胞核外的一种遗传系统，具有完整性、多态性、自主性和小型性等独特的优点。对线粒体基因组的研究主要体现在对基因的结构和功能、基因表达的时空调控、核质互作、分子进化规律、物种的起源进化以及线粒体的起源等生物学领域的研究。但是对野桑蚕线粒体基因组的研究目前还处于初级阶段，对中国野桑蚕线粒体方面研究的报道更少。 许多研究证明，“家蚕起源于中国野桑蚕”。目前已经公布了四个家蚕品种和一个日本野桑蚕的线粒体基因组全序列，但中国野桑蚕线粒体基因组的全序列还未见报道，它们之间的系统分析也少有文献。开展中国野桑蚕线粒体基因组的研究，一方面可以丰富线粒体基因组数据库，另一方面通过线粒体基因组比较分析，可以阐明其基因组成、基因排列和基因结构特点及其进化特点，通过系统分析，可以进一步探讨中国野桑蚕与家蚕不同品种、日本野桑蚕的系统演化关系和基因标记的特征。 本论文主要测定和分析了中国野桑蚕线粒体基因组全序列，并且对物种间、品种间mtDNA的进化特点和系统演化等进行了研究。 1．中国野桑蚕线粒体DNA提取方法的建立：由于野外环境的进一步恶化，野生材料越来越少。介于此，为解决材料的时空影响限制。本研究探讨了不同的保存方法和不同细胞破碎方法中国野桑蚕线粒体DNA提取影响，从而建立了一套优化方法。这种方法是先将材料置于-80℃下长期冻存，提取时取出来解冻，研磨与匀浆相结合来破碎细胞，再用常规方法提取线粒体DNA。用这种方法获得的mtDNA既解决了时空限制，又能用于扩增、酶切、克隆和测序。 2．引物的筛选与分析：37个昆虫通用引物中有81％能用于扩增和测序，设计其他区域的引物12个并将其扩增，最终可以完成全序列测定。 3．中国野桑蚕线粒体基因组的分析结果： (1)全序列及其结构分析：通过扩增、克隆、测序和拼接，获得了中国野桑蚕线粒体全基因组序列，全长为15688bp，由13个蛋白质编码基因，2个rRNA基因、24个tRNA基因和AT富集区构成。较4个家蚕品种和1个日本野桑蚕线粒体基因组多2个tRNA，其他组成和排列与这5个序列相同。与其它物种组成和排列都有不同。 （2）酶切图谱：用15种限制酶酶切获得52个位点，其中有24个Taql和互个Pstl酶切位点．与日本野桑蚕和“夏芳”比较，有较大的数目多态性和长度多态性。 （3）突变的比较：与日本野桑蚕比较，有23个编码基因序列发生了突变，共349个突变位点，其中非编码区占277个。与“夏芳”比较，有25个编码基因序列发生了突变，共285个突变位点，其中非编码区136个突变。与日本野桑蚕和“夏芳”的转换／颠换分别为 1．93和 1．84。 川核昔酸的组成及碱基使用偏好性：基因组的碱基组成位于中等，AT含挝较高。 4．中国野桑蚕mtDNA中各类基因的分析： 山蛋白质编码基因：共编码了13个疏水蛋白质，3715个氨基酸。5个起始子为ATG。，7个ATA，1个不明；12个终止子为TAA，l个不明。非极性氨基酸占主导地位，其次是极性不带电的氮基酸。编码线粒体DNA的基因时存在较大的AT偏好性，且更偏好使用T碱基。密码子的各位置组成中T和A含量较高，G和C含量较低。 （2）tRNA的组成及H级结构预测：中国野桑蚕线粒体DNA序列与所比较的其他物种有所不同，包含了24个tRNA，有3个tRNA－Ser，2个tRNA－lie和2个tRNA－Leu，其他17种tRNA都只有一个，并推测出各种H级结构。有17对碱基错配，3对难以匹配，还有1种有四个茎环结构的tRNA（见图13）。大多数密码子序列与相应的反密码子不完全匹配。 （3）rRNA基因及其二级结构预测：有大小两个rRNA，LrRNA和SrRNA，其长度分别是1350hp和784hP。这两个基因与家蚕蛾科的其它各序列相比相似性最高，其次是果蝇和蚊子与人的相似性较低。在自由能最低时，LrRNA基因二级结构有68个主干和69个环状结构组成；SrRNA基因二级结构有9个主干和 10个环状结构组成。 5．中国野桑蚕线粒体基因组的系统分析： O）基于COI部分基因的系统分析发现：日本野桑蚕聚为一类，再与中国安康地区野桑蚕和韩国野桑蚕聚为一类。中国镇江的野桑蚕与家蚕品种C－108聚在一起。其他家蚕品种聚为一类。 （2）基于线粒体基因组和基因的基因树构建与分析发现：分别对6个材料（4个家蚕品种和2个野桑蚕）的线粒体基因组全序列、13个蛋白质编码基因、2个 rRNA基因和 1个非编码区（即 AT富集区）进行了分析，并用 NJ法构建了基因树。从构建的基因树中可知，COI、COil、ATPases、AT宫集区、ND、ND3、ND4L、NDS、COlll、ATPase6的基因树与全基因组的系统树树型基本一致，但在家蚕中也存在品种间的差异；在基因树中还有一些基因，如 cytb、NDZ、ND4、ND6、LrRNA fi SrRNA中野桑蚕和家蚕之间进化规律不太清楚。 由此而知，从线粒体角度可以证明家蚕与中国野桑蚕亲缘关系较近。由于线粒体基因的遗传具有母性遗传的特点，又由于野桑蚕只受自然环境作用，家蚕品种受囱然选择和人工选择的双重作用，从而系统演化过程表现出一定的差异。
史妍茹[4]2012年在《洁波水螟线粒体基因组全序列测定及蛾类系统发育分析》文中指出鳞翅目是昆虫纲中的第二大目,包括蛾和蝶两类昆虫,其中蛾类约占鳞翅目昆虫的90%。蛾类有如此巨大的多样性,许多类群传统的形态学分类很难给出一种准确的分类与界定,鳞翅目的系统发育关系更是没有统一的观点,因此,系统学工作者一直在探寻形态学特征以外的可靠证据解决这些问题。线粒体基因组作为核外遗传物质有许多区别于核基因的特点,所以自发现以来便作为重要的分子标记迅速用于各项生物学研究,特别是系统分类学研究。截止2011年10月为止,在Genbank数据库中仅可以检索到39种鳞翅目昆虫线粒体基因组的全序列或接近完全的序列,相对于物种丰富的鳞翅目而言,现有信息还远远不足。新增加的鳞翅目线粒体基因组可以让我们对鳞翅目的多样性与进化有更进一步的认识。为了填补鳞翅目昆虫线粒体基因组数据库的不足,以便进一步了解鳞翅目总科间的系统发育关系,本实验采用较长片段的PCR扩增以及引物步移法对洁波水螟Paracymoriza prodigalis (Leech,1889)线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)的全序列进行了测定。并利用测定的洁波水螟mtDNA序列,结合从GenBank数据库中获得的22种蛾类和3种蝶类的mtDNA数据,重建鳞翅目昆虫间的系统发育关系。结果显示：1.洁波水螟线粒体基因组基因组成及排列洁波水螟线粒体基因组全长15326bp,同其他已测序的鳞翅目昆虫mtDNA有着相同的基因组成与排列。基因间排列紧密,存在3处基因重迭,总长度为18bp。除了A+T富集区这个最大的非编码区外,基因间还存在17处的间隔,总长度为184bp。洁波水螟线粒体基因组及其各区域的碱基组成都有很强的AT偏向性,其中全基因组(J链)的AT含量达81.54%,远大于GC含量,而A+T富集区拥有全基因组中各区域最高的AT含量。与其他已测定的鳞翅目昆虫不同,COI基因也以典型的ATN密码子起始,这是很罕见的。在终止密码子的使用上,除了COⅡ和ND5基因使用不完整的T以外,其余11个蛋白编码基因都以TAA终止。除了tRNASer(AGN)基因外,所有的tRNA都能形成典型的叁叶草形二级结构。洁波水螟的tRNA基因存在26个碱基错配,这些错配分散存在于22个tRNA基因中的15个,且其中的20个都为G-U错配。在lrRNA基因的非编码链上发现了一个tRNALys类似结构。洁波水螟线粒体基因组A+T富集区存在以下特点：5’末端存在基序'ATAGA'引导一个19bp多聚T的保守结构；在靠近3’末端处有一个微卫星(AT)8结构,其前还有一个标志性基序'ATTTA';3’末端处有一个长9bp的多聚A结构,其间由T隔开,这叁种结构在已测定的鳞翅目昆虫中也有发现。2.蛾类线粒体基因组基因组成及排列22种蛾类线粒体基因组的基因组成以及排列顺序与洁波水螟的相同。与昆虫的原始排列顺序相比,仅tRNAMet基因发生了易位,由原始昆虫中tRNAIle-tRNAGln-tRNAMet的tRNA簇变成了tRNAMet-tRNAIle-tRNAGln。全基因组及各区域的碱基组成也同洁波水螟类似,都有明显的AT偏向性,全基因组的碱基组成中草原毛虫Ochrogaster lunifer的最低为77.8%。而在AT和GC偏斜值方面,不同蛾类是有差别的。除COI基因外,蛋白编码基因大都使用典型的ATN(包括ATA, ATT, ATG和ATC)作为起始密码子。COI基因的起始密码子多变,大都为假定起始密码子,其中以密码子CGA的使用最多。蛋白编码基因大都使用完整的TAA或TAG作为终止密码子,其中TAA的使用要远多于TAG,也有少数以不完全的T或TA终止。大多数蛾类的tRNASer(AGN)基因都缺乏稳定的茎环结构,但这并不是蛾类mtDNA的一般特征,茶小卷叶蛾Adoxophyes honmai就是一个例外。在这些蛾类的tRNA基因中都存在数目不等的错配,常见的为G-U和U-U错配,且同洁波水螟的相同,其二级结构中的错配大都位于接受臂、反密码臂以及DHU臂。通过比较蛾类的A+T富集区,发现该区域的序列有一些共同的特点,主要包括四个部分：(1)N链复制起点(ON)(2)重复序列以及茎环结构区(3)微卫星序列(4) poly(A)结构。3.蛾类系统发育关系分别以13个蛋白编码基因和rRNA基因(srRNA和lrRNA)核苷酸序列的联合数据集为基础,用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯推理法(BI)叁种方法重建蛾类的系统发育关系。结果显示,PCGs联合数据集的分析结果远比rRNA联合数据集的分析可靠。在构建的6种系统发育树中,螟蛾总科的7种、卷蛾总科的3种各自稳定的聚为一分支,这与传统的形态学分类的结果一致。蚕蛾总科、尺蛾总科和夜蛾总科3个总科内物种的归属以及总科间的关系有明显差异,但是3个总科总是稳定的聚在一个大的分支上,这说明蚕蛾总科、尺蛾总科和夜蛾总科叁者间的关系较近。
陈丽媛[5]2008年在《绢丝昆虫线粒体DNA A+T丰富区序列的克隆与分子进化分析》文中认为家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目的一种重要模式昆虫,对其起源和分化的研究一直受到蚕业科学界的高度重视,并随着科学技术的进步和考古发现而不断推向深入,取得了很大的进展。家蚕的中国起源学说已经成为学界的共识,然而对于家蚕起源的地域性和化性分化却一直存在着争论,形成了两种不同的学说:家蚕起源黄河流域的“一中心”学说和多地域起源的“多中心”学说。动物线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)具有分子量小、便于实验操作、变异速度快和母性遗传等特点,被广泛用于种群遗传和物种分子进化分析。mtDNA控制区(D-环)因富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T),被称为A + T丰富区,是动物线粒体基因组序列和长度变异最大的区域。利用线粒体DNA基因组中保守性的蛋白质编码基因或rRNA基因等序列分析家蚕和蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)等绢丝昆虫系统发育和分子进化已有较多报道,但是鲜见用线粒体基因组A+T丰富区分析家蚕等绢丝昆虫的进化。本研究选择12个家蚕品种以及镇江野桑蚕(Bombyx mandarina Zhenjiang strain)、蓖麻蚕、樗蚕(Philosamia cynthia cynthia)和柳蚕(Actias selene ningdoana)为材料,分别从蛹体中提取线粒体DNA。家蚕品种分别为:叁四、大草、邯郸种、迈索尔、大造、萨尼斯、余杭二化、沿河1号、新昌12号、安康4号、甘肃种、兰5,从化性上分包括一化性、二化性和多化性品种,从地理系统上划分包括中国系统、日本系统、欧洲系统和热带系统,从茧色上划分包括白色、橘红色、淡橘红色、金黄色、淡黄绿色。根据已发表的家蚕和野桑蚕mtDNA控制区及其侧翼序列,设计1对PCR引物,用PCR方法克隆线粒体A + T丰富区及其侧翼序列,并进行序列测定。序列分析表明,家蚕品种克隆片段平均长度约1.1 kb,镇江野桑蚕的克隆片段为1085 bp,蓖麻蚕、樗蚕和柳蚕该区段长度分别为951 bp、952 bp和930 bp,它们的基因排列顺序均与家蚕品种C108相同,依次为12S rRNA基因3′端、A+T丰富区、tRNA-Met、tRNA-Ile、tRNA-Gln和ND2基因5′端,在tRNA-Gln和ND2基因之间有一段非编码区。家蚕品种的克隆片段及C108和青熟(Aojuku)间核苷酸序列的同源性均在99%以上,其中C108、兰5和青熟叁者完全一致;沿河1号和大造与C108相比,只在控制区的T-串(Thymine-stretch)和A-串(Adenine-stretch)长度上有1-2个碱基的差异;在14个品种中,共检测到19个碱基替换(15个转换,4个颠换)和6个碱基缺失,主要分布在A + T丰富区。为了研究家蚕品种的起源以及家蚕和大蚕蛾科绢丝昆虫的亲缘关系,我们以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)线粒体DNA为外群,分别采用Phylip3.66软件包的邻位相连法(DNA NJ)和最大可能性法(DNA ML),构建了基于14个家蚕品种和4个野桑蚕品系mtDNA A + T丰富区及其侧翼序列的进化树和基于2个家蚕品种和柞蚕(Antheraea pernyi)、蓖麻蚕、樗蚕、柳蚕4种5个品系的大蚕蛾科绢丝昆虫mtDNA A + T丰富区序列的进化树。在前一进化树中,14个家蚕品种与2个中国野桑蚕聚为一亚群,而2个日本野桑蚕单独聚为另一亚群,说明家蚕品种与中国野桑蚕的亲缘关系更近、与日本野桑蚕(Japanese Bombyx mandarina)较远;在14个家蚕品种中,甘肃种的进化早于其它品种,说明甘肃种是本试验研究中进化最早的家蚕品种。在后一进化树中,柳蚕与蓖麻蚕、樗蚕叁者的亲缘关系较近,与柞蚕的亲缘关系较远,与家蚕的亲缘关系更远;在所研究的绢丝昆虫中蓖麻蚕和樗蚕的亲缘关系最近。本研究结果在线粒体基因组水平上为家蚕起源于中国古野桑蚕和黄河流域是家蚕品种的发祥地之一,提供了新的证据。
廖顺尧, 刘运强, 鲁成, 周泽扬, 向仲怀[6]2002年在《家蚕线粒体基因组1.8kb片段的克隆及序列分析》文中研究指明克隆并测定了家蚕 (Bombyxmori)线粒体基因组 1781bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切片段序列 ,根据序列同源性比较 ,推测该DNA片段包括 :ND1基因、16SrRNA基因 3′端、tRNALeu(UAG)基因和一个尚待确定的tRNA基因。家蚕与果蝇ND1基因序列同源性约为 81 85 % ,16SrRNA基因 3′端序列同源性约为 74 5 %。在家蚕、果蝇、蜜蜂、蝗虫、卤虫和人 6个物种中 ,线粒体ND1编码的疏水性氨基酸比例较稳定 ,显示了ND1基因的保守性。对上述 6个物种ND1基因序列和 16SrRNA基因 3′端序列进行系统进化分析 ,构建了系统进化树。
廖顺尧, 刘运强, 鲁成, 周泽扬, 向仲怀[7]2002年在《家蚕线粒体ND2、COⅠ和若干tRNA基因的克隆及序列分析》文中认为克隆并测定了家蚕 (Bombyxmori)线粒体基因组 34 6 8bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切片段序列 ,根据序列同源性比较 ,该DNA片段包括 3个蛋白质编码基因 :ND2基因、COⅠ基因和COⅡ基因 5′端 399bp的序列 ,以及 6个tRNA基因和一个尚待确定的tRNAMet基因。家蚕与果蝇的ND2基因序列同源性约 6 9 7% ,COⅠ基因的同源性约 83 8% ,COⅡ基因 5′端的同源性约 80 % ,这表明细胞色素氧化酶基因在物种间比烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶基因保守。 6个推定的tRNA基因序列与果蝇相应tRNA基因序列差异较大。另外 ,除tRNAGln基因的二级结构相似外 ,其它tRNA基因的二级结构与果蝇相应tRNA基因的二级结构也有较大差异。
尚娜, 周志军[8]2008年在《动物线粒体基因组全序列测定的研究策略》文中研究指明动物线粒体基因组全序列测定是近年来生物学研究中的一个热点。科学技术的发展,对动物线粒体基因组全序列测定的研究策略也产生了深远的影响。在此对几种在动物线粒体基因组全序列测定中常用的几种策略进行了综述,并对其优缺点进行了比较分析。
李鹏飞[9]2013年在《叁种鳞翅目昆虫线粒体基因组序列的测定及系统发育分析》文中研究表明动物线粒体基因组由于其结构简单、进化速率快、母系遗传和发生重组率低等特点,己被广泛用于群体遗传学、系统发育重组、比较和进化基因组学以及基因组水平分子进化等领域的研究。本研究利用Sub-PCR技术,测定了太白虎凤蝶Luehdorfia taibai, Chou,1994、断纹波水螟Paracymoriza distinctalis,(Leech,1889)和长臂彩丛螟Listaharaldusalis,(Walker,1859)的线粒体基因组序列,利用相关软件进行了组装拼接、注释和分析。联合已公开的部分鳞翅目线粒体基因组,基于线粒体基因组2个rRNA基因和13个蛋白质编码基因全序列数据,分别采用最大简约法(maximum parsimony, MP)、最大似然法(maximum-likelihood, ML)和贝叶斯推论法(bayesian inference, BI)构建了6种鳞翅目物种的系统发生树。主要结论如下：1.本研究所测定的3种鳞翅目昆虫线粒体基因组全长分别为：太白虎凤蝶15553bp,断纹波水螟15355bp,长臂彩丛螟15213bp。线粒体基因组都由37个基因(13个蛋白质编码基因,22个tRNA基因和2个rRNA基因)和1个A+T富集区构成。2.太白虎凤蝶、断纹波水螟和长臂彩丛螟线粒体基因组的碱基组成具有明显的AT偏向性,它们的A+T含量(J链)分别为：太白虎凤蝶81.47%,断纹波水螟82.14%,长臂彩丛螟81.51%。3.本研究中COⅠ基因除长臂彩丛螟以特殊的四联体TTAG作为起始密码子外,太白虎凤蝶和断纹波水螟的COⅠ基因都以CGA作为起始密码子,而其它的蛋白质编码基因均以典型的ATN作为起始信号。断纹波水螟的COⅡ基因与长臂彩丛螟的COⅡ和ND6基因均以不完全的终止密码子T作为终止信号,其它蛋白质编码基因的终止密码子为TAA或TAG。4.线粒体基因组的22个tRNA基因,除了太白虎凤蝶和断纹波水螟的tRNASer(AGN)基因外,其余均可折迭成典型的叁叶草型二级结构,tRNA二级结构均存在一定数目的碱基错配现象。太白虎凤蝶线粒体基因组在191-259bp的位置还存在1个额外的tRNALeu,功能未知。5.本研究3种昆虫的A+T富集区长度分别为太白虎凤蝶939bp,断纹波水螟344bp,长臂彩丛螟310bp。A+T含量分别为94.56%、95.06%和96.13%。A+T富集区内部有一些典型的结构,其中包括类似微卫星的重复序列(AT)。和(ATT)n,以及poly-A和poly-T结构等。6.系统发育关系结果显示,(夜蛾总科+(尺蛾总科+蚕蛾总科))聚为姊妹群；梳翅弄蝶作为弄蝶总科唯一的数据集代表,在进化关系上显示与凤蝶总科有更近的亲缘关系；天蚕蛾科和天蛾科聚为一个与其它科昆虫平行的单系支。
杜周和[10]2009年在《基于Bmamy2基因的家蚕起源与分化研究》文中进行了进一步梳理家蚕的起源与分化不仅是基础科学问题,也是有关蚕业发生历史和产业发展的重大实践问题,其研究不仅具有重要的理论价值,而且对家蚕的品种鉴定、基因资源利用、杂种育种等产业实践具有重要指导意义。自印度昆虫学家霍顿提出家蚕的种源问题后,逐渐引起各国学者的注意。自1915年日本学者青木清首先用血清沉淀反应研究家蚕与野蚕的亲缘关系始,近一个世纪以来,中外学者,特别是中日学者从文献学、气候学、古生物学、生态地理学、考古学、遗传学、生理生化学、细胞学、分子标记(RAPD、AFLP、SSR等)、DNA序列分析等多角度、多层次进行了广泛、深入的探索,取得重要研究成果。首先明确并达成一致共识:家蚕来源于野桑蚕,中国野蚕是家蚕的直系祖先,日本野蚕与中国野蚕存在较大的遗传分化,对家蚕的起源没有直接贡献;家蚕最早起源于中国,野蚕在中国被驯化成家蚕后向世界各地传播,各地地理气候和人文社会环境不同,经过长期的生殖隔离、自然选择和人工定向选育,逐渐形成了不同的地理系统和生态类型。但是,在家蚕的起源地域和分化模式上,不同学者使用不同的技术手段、实验材料和分析方法,得出不同的结论,影响较大的主要有叁种观点:一是以日本学者吉武成美教授为代表,基于家蚕地方品种多种酶系的同工酶多态性提出的“一化性一中心学说”;二是以我国学者蒋猷龙教授为代表的“多化性多中心学说”,其学术依据主要是古生物学、古气候学和考古学资料:叁是西南大学鲁成教授依据现代分子标记研究提出的“混化性起源学说”。DNA是直接的遗传物质,所提供的遗传信息比其它形态标记、生化标记更加准确可靠。DNA序列分析通过测定核酸一级结构中核苷酸组成和排列顺序来比较同源分子之间的相关性,其揭示的遗传信息比其它分子标记更加丰富和详细,在生物的起源进化研究特别是短期驯化物种的起源进化研究上具有明显的优势,是目前分子进化及系统发育研究最有效、最可靠的方法。家蚕驯化时间短,且研究的是物种内不同类型间的亲缘关系,特别需要一个快速进化的基因作为检测标记。淀粉酶在猪、绵羊、家蚕及果蝇等多个物种中表现出较高的同工酶谱多样性及核苷酸多态性,广泛用于进化研究。本研究通过生物信息学分析、文献研究和序列测定确证Bmamy2是一个快速进化、多态性丰富的基因,且具有合适的基因结构,便于同时利用外显子和内含子携带的遗传信息进行综合分析,结论更加全面、可靠。实验以大量典型家蚕地方品种和有代表性的野蚕地理类型为材料,以Bmamy2基因为标记,通过DNA序列多态性探索家蚕的起源与分化模式,获得的主要结果如下:1.α-淀粉酶基因的生物信息学分析α-淀粉酶是一个与生命活动紧密相关的多基因家族,在不同物种中具有不同的基因结构和分布特点。在叁刺鱼、非洲爪蟾、鸡以及人等脊椎动物中,物种间和物种内不同基因拷贝间具有保守的基因结构,分布在一条染色体上,存在较多的重迭基因;物种内不同基因拷贝间氨基酸序列相似性极高,物种间序列相似性低。而在果蝇、蚊子和家蚕等昆虫中,α-淀粉酶基因没有类似的保守结构和重迭基因,不同拷贝以串连形式分布在多条染色体上:物种内和物种间不同基因拷贝间序列相似性较低。在秀丽隐杆线虫等低等生物基因组中只有一个α-淀粉酶基因拷贝,在昆虫、哺乳动物等高等生物中发生了显着的基因扩增,基因数量明显增加。脊椎动物中各淀粉酶基因严格按物种聚类,物种间没有交叉,推测基因扩增发生在物种分化之后。昆虫中,α-淀粉酶基因起源进化关系复杂,蚊子和果蝇同属双翅目,但基因拷贝数相差很多,表明两物种分化形成后蚊子中发生了显着的基因扩增;嗜凤梨果蝇和黑腹果蝇同属果蝇科,亲缘关系很近,在两物种分化形成后,嗜凤梨果蝇又发生了基因扩增,形成相对较多的基因拷贝。蚊子和家蚕虽然分属不同的目,但两者的α-淀粉酶基因却表现出较为相似的分化模式;各物种中α-淀粉酶基因都聚类成彼此间遗传差异较大的两族,其中一族与细菌具有较近的遗传距离;物种分化形成后发生了基因扩增事件,形成较多的基因拷贝。家蚕Bmamy2、Bmamy3、Bmamy4叁个基因在同一染色体上紧邻着串连排列,且具有及其相似的基因结构,可能通过基因重复而产生,但叁个基因的核苷酸序列差异显着,推测叁基因经受了不同的进化选择。2.家蚕Bmamy2基因的克隆、表达及序列分析克隆测序了家蚕Bmamy2基因编码区序列,是家蚕基因组中第一个有实验证据的淀粉酶基因序列。家蚕Bmamy2基因CDS全长1752bp,除起始密码子外,编码583个氨基酸,有8个内含子,其中第一、第六、第七和第八内含子较长,分别为393bp、505bp、647bp和1828bp,其余均在100bp左右;除第四外显子较长外(582bp),其余外显子均小于100bp;外显子/内含子边界符合GT-AG规则。芯片数据和RT-PCR检测一致表明Bmamy2在家蚕幼虫中肠和脂肪体中表达,且中肠中表达量极高,脂肪体中表达量较低,在头部、表皮、血液、丝腺、精巢和卵巢等组织中不表达。功能结构域预测发现催化中心的两个关键氨基酸发生突变(D258Y,D423P),该酶可能已失去催化水解碳水化合物的功能。Bmamy2基因在细菌等微生物中存在直系同源基因,碱基变异丰富,家蚕地方品种中碱基突变率5.6%,野蚕中碱基突变率8.3%,遗传多样性高,没有明显的碱基使用偏好和特别长的内含子间隔,是家蚕多样性检测较好的标志基因。3.家蚕的种群结构及遗传分化虽然按地理系统和生态类型取样,但系统发育分析并未检测到按系统或生态类型聚类的结果,分子方差分析也未检测到按系统或生态类型归类的组群结构。90个家蚕地方品种聚类成叁大簇群,每一簇群均由来自不同系统和生态类型的品种构成,归属同一地理系统或生态类型的品种分布在不同的聚类枝上。叁大簇群间存在较大的遗传距离,簇群内不同品种间遗传差异小。推测叁大簇群分别来自叁个独立的驯化起源。4.野蚕的多样性及地理种群结构野蚕是一个在东南亚地区尤其是中国广泛分布的物种,具有一化性、二化性及多化性等多种生态类型,在眠性上有叁眠蚕、四眠蚕及少数的五眠蚕。野蚕的多样性在形态特征、生态类型、发育生理、食性、抗性及多种分子标记等各个方面和层次得到充分体现。基于Bmamy2基因部分区段的序列分析,不同个体间碱基突变率高达8.3%,内含子区域更高达10.8%,单倍型多样度h=0.987±0.023,核苷酸多样性π=0.02281±0.0034。野蚕的生态学特征之一是群体发育极不整齐,典型的现象是越年卵孵化的长期化和蛹期发育的多样化,发育早的已完成一个世代,而发育迟的尚未出壳,造成世代重迭。分子方差分析显示,野蚕没有形成稳定的地理组群结构,彼此间亲缘关系的疏密与空间距离的远近没有必然联系。聚类分析中,来自不同地区的野蚕同聚在相同的聚类枝上,表现较近的亲缘关系;而同一地区的个体却分布于不同聚类枝上,亲缘关系较远。各地野蚕是多种眠性和生态类型混栖的混杂群体。5.家蚕的起源与分化基于Bmamy2基因的序列多态性,应用系统发育分析、Network分析、AMOVA分析等多种分析方法,检测到一致的系统发育模式。90个家蚕和野蚕样本混合聚集成不同的聚类簇群,每一簇群都同时由家蚕和野蚕组成,家蚕来自不同的地理系统和生态类型;簇群间具有较大的遗传距离,簇群内的不同品种间遗传差异较小。不同系统或生态类型的家蚕品种具有相似的分化程度,与野蚕间具有相似的遗传距离,应当具有相似的驯化起源时间,经历了相似的分化历程,而各地野蚕又是多种类型的混杂群体,推测从野蚕到家蚕的驯化当是由多种类型的野蚕同时开始的。聚类簇群间较大的遗传距离表明不同簇群可能具有不同的起源背景和进化经历,来源于不同的地理区域。即,家蚕很可能是在几个不同地域由多种生态类型混杂的野蚕驯化而成的,起源之初就有多种化性的遗传背景,家蚕的起源为“混化性多地域”模式。多种化性的家蚕向世界各地传播,适应当地的自然气候和人工选择,逐渐分化形成不同的地理系统和生态类型。
参考文献：
[1]. 家蚕线粒体基因组全序列测定及分析[D]. 刘运强. 西南农业大学. 2001
[2]. 家蚕线粒体基因组全序列测定与分析[J]. 鲁成, 刘运强, 廖顺尧, 李斌, 向仲怀. 农业生物技术学报. 2002
[3]. 中国野桑蚕线粒体基因组研究[D]. 夏玉玲. 西南农业大学. 2003
[4]. 洁波水螟线粒体基因组全序列测定及蛾类系统发育分析[D]. 史妍茹. 陕西师范大学. 2012
[5]. 绢丝昆虫线粒体DNA A+T丰富区序列的克隆与分子进化分析[D]. 陈丽媛. 江苏科技大学. 2008
[6]. 家蚕线粒体基因组1.8kb片段的克隆及序列分析[J]. 廖顺尧, 刘运强, 鲁成, 周泽扬, 向仲怀. 蚕业科学. 2002
[7]. 家蚕线粒体ND2、COⅠ和若干tRNA基因的克隆及序列分析[J]. 廖顺尧, 刘运强, 鲁成, 周泽扬, 向仲怀. 动物学报. 2002
[8]. 动物线粒体基因组全序列测定的研究策略[J]. 尚娜, 周志军. 河池学院学报. 2008
[9]. 叁种鳞翅目昆虫线粒体基因组序列的测定及系统发育分析[D]. 李鹏飞. 陕西师范大学. 2013
[10]. 基于Bmamy2基因的家蚕起源与分化研究[D]. 杜周和. 西南大学. 2009
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