湖南邵阳医学高等专科学校附属医院 422000
【摘 要】目的：调查分析湖南邵阳地区医院2012-2015年临床分离的210株肠杆科细菌中69株携带KPC-2型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌分子流行病学及耐药基因周围环境。方法：采用E试验法测定10种常用抗菌药物的MIc值。利用PCR扩增筛选碳青霉烯酶基因。利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术进行菌株的同源性分析。结果：69株临床菌株均对厄他培南耐药，除了8株菌株外，也均对美罗培南和亚胺培南耐药，而这8株菌株对这2种碳青霉烯类药物的敏感性也下降到2 mg／L。同时所有的菌株对头孢他啶、头孢西丁、哌拉西林一他唑巴坦表现为耐药性，虽然替加环素与多黏菌素存在较好的敏感性，但MIC值均＜2ml/L，在这些菌株中，对阿米卡星药敏试验MIC值具有较大差异性，23株菌株相对较为敏感，其MIC值在4mg/L以下，其余38株的耐药水平非常高，MIC值在128 mg／L以上。结论：研究表明，就本研究中含有KPC-2基因的肠杆菌科细菌而言，尽管菌株克隆播散是这种耐药基因传播过程中的关键因素，然而，归根结底还是K PC-2基因周边片段转移性比较高，此为肠杆菌科细菌在世界内传播迅速的根本原因。我国比较流行的KPC-2转移原件其实就是Tn3-Tn4401整合的一种复杂嵌合体，监控其流行状况，是对该耐药基因传播进行有效控制的前提与基础。
【关键词】碳青霉烯酶；KPC；接合；质粒；转座子；基因环境
碳青霉烯类抗生素是临床治疗多重耐药性革兰阴性菌感染的最有效药物之一，但是近年来碳青霉烯水解酶的出现使得此类抗生素的耐药现象日趋严重，其中最典型的就是近来报道比较多的KPC型碳青霉烯酶。KPC酶在Ambler分类中属于A类酶，最初是在美国纽约地区被发现，而现在已经流行到全球很多国家和地区。除西方发达国家的一些区域存在大规模散播外，哥伦比亚、以色列、阿根廷、中国等国家也先后报道了KPC酶，尽管关于各区域散播KPC酶的报道比较多，然而研究KPC酶本身所具有的遗传环境却很少。国外代表性报道表明，由于KPC酶处于Tn4401转座子中，通过Tn4401转座子发生转移。我国内地所流行的KPC酶菌株与西方发达国家存在明显差异性，而且KPC酶菌株的基因遗传环境还比较模糊。为此，本研究基于对国内KPC酶流行予以关注，深入研究KPC酶的基因环境。
1材料与方法
1.1一般资料
210株肠杆菌科细菌来自湖南邵阳地区医院自 2012年3月至2015年7月临床分离的非重复菌株，其中69株对碳青霉烯类抗生素表现敏感性降低或者耐药。包括3株产酸克雷伯菌，60株肺炎克雷伯菌，3株大肠杆菌、3株阴沟肠杆菌。菌种鉴定采用的方法是法国梅里埃APl20E系统。
1.2药物敏感性实验
利用E试验条方法测定了美罗培南、亚胺培南、厄他培南、黏菌素、替加环素、头孢他啶、环丙沙星、哌拉西林一他唑巴坦、头孢西丁和阿米卡星10种药物的MIC值。大肠埃希菌ATCC25922和ATCC35218作为质控菌株。
1.3碳青霉烯酶基因的筛选
将大肠埃希菌 ATCC25922 菌液调成0.5个麦氏单位，作1：10 稀释，均匀涂布在MH 琼脂上，在平皿中央贴上一张厄他培南纸片（10μg），分别取2～3个待检菌菌落，沿纸片边缘向外呈放射状划线，在有氧环境下，35℃孵育16～18 h，观察细菌有无向内生长的情况。如有向内生长，则判读为产碳青霉烯酶。69株菌株中58株筛选出KPC基因，其中21株为大肠埃希菌（ECO），25株为肺炎克雷伯菌（KPN），3株为产酸克雷伯菌（KOX），7株为阴沟肠杆菌（ECL），2株为产气肠杆菌（EAE），序列分析表明其属于KPC一2型。而包括金属酶在内的其他碳青霉烯酶基因在这些菌株中尚未发现。
2结果
结果显示，69株临床菌株均对厄他培南耐药，除了8株菌株外，也均对美罗培南和亚胺培南耐药，而这8株菌株对这2种碳青霉烯药物的敏感性也下降到2 mg／L。同时所有的菌株对头孢他啶、头孢西丁、哌拉西林一他唑巴坦都具有耐药性，替加环素与黏菌素存在较好的菌株敏感性，而且MIC值均小于2ml/L，在这些菌株中，阿米卡星MIC值具有较大差异性，23株菌株相对较为敏感，而且MIC值在4mg/L以下，其余38株的耐药水平非常高，MIC值在128 mg／L以上，见表1。
3讨论
近些年关于KPC酶流行的研究报道大量存在，KPC-3型耐药基因与KPC-2型耐药基因以转移基因水平与克隆传播的方式向世界各地传播。本研究对湖南邵阳地区医院临床分离的210株肠杆科细菌69株所携带的KPC-2型酶本身所具有的流行状况与型别特征进行研究报道。69株细菌药物敏感试验结果发现，碳青霉烯非敏感菌株在其它抗菌药物中的耐药性非常强。比如：哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶、头孢西丁以及环丙沙星等。但是，以上菌株对替加环索、黏菌素相对较为敏感，该研究结果和国外一些研究结果相一致。一些菌株具有非常强的阿米卡星耐药性，而且MIC已经超过128 mg／L。深入研究，结果发现，出现该现象的主要因素在于，这些菌株内部存在16sRNA甲蓦化酶基因armA。通过分析60株肺炎克雷伯菌本身所具有的同源性发现，各个医院中只有两种或一种克隆型，由此表明，邵阳地区医院内KPc菌株的主要流行方式为院内克隆播散，但是也不能将医院与医院间的克隆散播排除在外。临床中，肠杆菌科细菌培养结果阳性并不一定说明存在肠杆菌科细菌感染，也有可能是污染菌或仅仅是定植菌，但却有过半肠杆菌科细菌培养定植而非感染的患者接受了多黏菌素类和氨基糖苷类药物等有神经和肾脏毒性的抗生素治疗，而且经常使用这些药物有可能导致细菌耐药的风险。多黏菌素与替加环素非本地区常规使用药物，故未做统计。相关药敏研究结果显示，肠杆菌科细菌培养对氨基糖苷类药物庆大霉素、阿米卡星和磺胺类药物复方新诺明敏感性尚可，与相关报道一致。头孢吡肟的敏感率22%左右，临床也可考虑。
本研究所分析与探讨69株菌株中的42株KPC-2基因结构不同于pKP048，由此可见，其基因环境存在多样性。同时本研究发现，69株菌株中有8株细菌的结构中存在一个TEM基因，一般TEM基因是Tn3转座结构的关键组成部分，由此表明Tn3结构属于后期插入的最终结果。多数菌株都可以结合作用的方式转移碳青霉烯耐药基因至受体菌中。由此可以看出，KPC-2基因属于质粒编码，尽管这些质粒中的基因片段较为相似，然而，就电泳图谱中分析可见，其大小存在很大差异性，40-180 kb的大小不等明确说明，这些质粒基因环境具有非常明显的多样性。此外，本研究通过实施质粒不相容分组实验结果发现，质粒不相容分组同样具有多样性。很多菌株的PFGE克隆分型条带基本相同，然而，其所携带的质粒却存在很大差异性，由此可见，质粒可转移性非常高。
总而言之，就本研究中含有KPC-2基因的肠杆菌科细菌而言，尽管菌株克隆播散是这种耐药基因传播过程中的关键因素，然而，归根结底还是K PC-2基因周边片段转移性比较高，此为肠杆菌科细菌在世界内传播迅速的根本原因。我国比较流行的KPC-2转移原件其实就是Tn3-Tn4401整合的一种复杂嵌合体，监控其流行状况，是对该耐药基因传播进行有效控制的前提与基础。
参考文献：
[1] 陈金云，傅鹰，杨青等.KPC-2及 IMP-4酶介导肠杆菌科细菌碳青霉烯类耐药研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2015，（6）：419-426.
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论文作者:唐翠连,杨晓春,史顺杨
论文发表刊物:《航空军医》2016年第14期
论文发表时间:2016/9/5
标签：菌株论文; 基因论文; 杆菌论文; 细菌论文; 质粒论文; 头孢论文; 西林论文; 《航空军医》2016年第14期论文;