湖南中医药大学第二附属医院泌尿外科 湖南长沙 410005
【摘 要】根据雄激素受体（AR)信号通路探究中药复方PC-SPESⅡ抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖及其对AR、PSA表达的影响。采用MTT法检测PC-SPESⅡ对LNCaP细胞增殖的影响，表明PC-SPESⅡ质量浓度为180-1440 mg/L范围内能明显抑制LNCaP细胞增殖，PC-SPESⅡ作用24、48 h的IC50值分别为312.84、200.13 mg/L；流式细胞仪检测细胞周期分布的变化显示240 mg/L PCSPESⅡ使细胞阻滞于G2/M期，并在G0/G1峰前出现显著的凋亡峰，随着作用时间的增加而上升；同时采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测凋亡细胞比例，480 mg/L PC-SPESⅡ作用时细胞比凋亡率增加，作用效果均呈现一定剂量依赖性；采用ELISA检测LNCaP细胞PSA分泌水平，以25 mg/L的Bic作为阳性对照发现480 mg/L PC-SPESⅡ能明显降低细胞PSA分泌；通过qRT-PCR与Western blot方法检测AR和PSA mRNA和蛋白表达变化显示以25μg/L R1881诱导LNCaP细胞后，240-480 mg/L PC-SPESⅡ明显下调AR和PSA mRNA和蛋白表达。结论：中药复方PC-SPESⅡ抑制LNCaP细胞体外增殖作用，阻滞细胞周期于G2/M期并会诱导细胞凋亡，机制可能与下调AR、PSA的表达有关。
【关键词】中药复方PC-SPESⅡ；前列腺癌；LNCa P增殖；AR、PSA
近年来，前列腺癌（Prostate Cancer，PCa)发病率不断上升，现已跃居泌尿生殖类恶性肿瘤的第三位[1]。中草药疗法现已被广泛应用于肿瘤患者，有数据表明采用该疗法的人数在确诊肿瘤后从5.3% 迅速增至13.9%[2]。中药复方PC-SPES是由灵芝、菊花、大青叶、三七、甘草、黄芩、冬凌草和棕榈子8味中药组成，只有棕榈子产于美洲，其余的7 味中药均来自于中国[3]。PC-SPES可明显降低前列腺癌（PCa)患者的血清睾酮与前列腺特异性抗原（PSA)水平，在体内外均具有显著的抗前列腺癌活性[4]。
为探究PC-SPES药效物质基础与作用机制，本文以PC-SPES为母体，除去棕榈子，将剩余的7味中药组方，故成为PC-SPES Ⅱ[5]。PC-SPES Ⅱ以灵芝为君药，配以菊花、大青叶、黄芩、冬凌草共为臣药，以三七为佐药，以甘草调和诸药即为佐使药，共奏清热解毒、活血化瘀、补养气血之功。本文在前期研究基础上，探讨PC-SPES Ⅱ抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖的作用，以及对雄激素受体（AR)信号通路的相关分子mRNA与蛋白表达的影响，以进一步揭示 PC-SPES Ⅱ的作用机制。
1 材料
1.1 细胞
人前列腺癌细胞 LNCaP购自中国科学院上海细胞库。
1.2 药物与试剂
PC-SPES Ⅱ（上海中耀生物科技有限公司，棕褐色干膏粉，批号 20120530)，美曲勃龙（R1881)（纯度≥99%，上海波以尔化工有限公司，批号 20130602)，比卡鲁胺（Bic)（纯度≥98%，上海波以尔化工有限公司，批号 20120825)。RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS)（Hyclone)，胰蛋白酶、EDTA（国药集团化学试剂有限公司)，噻唑兰（MTT)、DMSO（Sigma)，PI/RNase Staining Buffer、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒（BD)，Trizol（Invitrogen)，M-MLV（RNase H-)，GAPDH一抗（杭州贤至生物科技有限公司)，AR一抗、PSA一抗（CST)，anti-Rabbit IgG二抗（LI-COR)，PSA ELISA 检测试剂盒。
1.3 仪器
超低温冰箱、CO2培养箱（Thermo)，冷冻离心机（Sigma)，多功能酶标仪（Bio-tech)，流式细胞仪（BD)，PCR仪（Applied Biosystems)，实时荧光定量 PCR仪（Qiagen)，电泳及转印装置（Bio-Rad)，红外激光成像系统（LI-COR)。
2 方法
2.1 溶液配制
称量3.6 g PC-SPES Ⅱ，溶于10 mL 的70% 乙醇中，配制成 360 g/L储备液；37℃恒温孵育1 h，离心取上清，0.22 μm微孔滤膜过滤[6]。Bic、R1881分别溶于无菌DMSO中，配制成 2.5、100 g/L储备液，于-80 ℃保存。
2.2 细胞培养
LNCaP 细胞采用含10% FBS，100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素RPMI-1640培养液进行常规培养，置于5% CO2、37 ℃培养箱中，0.25%胰酶（含0.02% EDTA) 消化传代，每 5-6 d 传代1次。
2.3 MTT 法检测细胞活力
对数生长期的LNCaP 细胞经过胰酶进行消化后，以1×104个/孔细胞数传于96孔板，100 L/孔。待细胞贴壁，于对照组加入含 0.5% 乙醇的培养液，实验组加入终浓度分别为180、360、720、1440 mg/L PCSPES Ⅱ，每组4个复孔。分别在37 ℃、5% CO2培养箱中培养 12、24、48和72 h 后，弃上清，每孔分别加入RPMI-1640 培养液（不含FBS）100 μL，MTT（5 g/L)10 μL，培养4 h后吸去培养液，每孔加 DMSO 150 μL，振荡10 min，蓝紫色的甲臜结晶至完全溶解，用多功能酶标仪于490 nm下检测吸光值OD。细胞活力 =（OD实验组-OD空白组 ) /（OD阴性对照组-OD空白组 ) ×100%。
2.4 流式细胞仪观察细胞周期的分布
对数生长期的LNCaP 细胞经胰酶消化后，以5×105个/孔细胞数传于6 孔板中，2 mL/孔。待细胞贴壁，于对照组加入含0.1% 乙醇培养液，实验组加入终浓度为240 mg/L PC-SPES Ⅱ，分别在37 ℃、5% CO2培养箱中培养0、12、24和48 h后，收集细胞，预冷PBS洗1次，再加入预冷70%乙醇固定细胞，于4 ℃过夜。收集细胞，预冷PBS洗1次，再加入0.5 mL PI/RNase Staining Buffer，室温孵育 15 min。采用流式细胞仪来观察细胞周期分布。
2.5 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞预处理同2.4，根据试剂盒说明操作，应用流式细胞仪来检测细胞凋亡率，其中，Annexin V（+)、PI（-)表示早期凋亡细胞，Annexin V（+)，PI（+)表示晚期凋亡细胞。
2.6 ELISA 法测定细胞分泌 PSA 水平
对数生长期LNCaP 细胞经过胰酶消化后，以1×104个/孔细胞数传于24孔板，1 mL /孔。待细胞贴壁后，对照组加入终浓度25 mg/L 的Bic，实验组加入终浓度480 mg/L PC-SPES Ⅱ，分别0、12、24和48 h 后，分别收集每孔细胞上清，按照PSA的ELISA 试剂盒说明操作，使用多功能酶标仪于450 nm下检测吸光度OD。
2.7 qRT-PCR检测细胞AR、PSA 的mRNA表达
细胞预处理同2.4，对照组加入含 0.1% 乙醇的培养液，实验组均加入终质量浓度 25 μg/L R1881，分别加入终质量浓度240、480 mg/L PC-SPES Ⅱ或 25 mg/L Bic，培养24h后，消化收集细胞。根据Trizol试剂说明来提取细胞总RNA，根据RNA浓度取1 μg逆转录合成 cDNA，所得cDNA用于PCR扩增。通过 Primer-Blast 和 Primer Premier 5.0设计引物详见表1。β-actin作内参基因，目的基因相对表达量按照2-ΔΔCt计算，并参照溶解曲线以确保扩增产物特异性。
2.9 Western blot 检测 AR、PSA 蛋白的表达
细胞预处理及药剂添加同2.8，培养 24 h 后，提取细胞总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度，使样品达到相同浓度，处理后取20 μL蛋白上样，10% SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转印至PVDF膜；操作步骤参照文献[6]。红外激光成像系统扫描图像，对灰度进行分析，用目的蛋白/GAPDH 代表各蛋白相对表达强度。
2.10 统计学分析
所有实验均进行3次重复，数据采用 x± s表示。采用Flowjo软件对流式细胞仪检测数据进行分析，LI-COR Image Studio软件对Western blot结果进行灰度分析，GraphPad Prism 5软件作图，使用SPSS 19.0 软件进行数据统计分析。符组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表明差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 PC-SPES Ⅱ对LNCaP 细胞增殖的影响
采用MTT法检测PC-SPES Ⅱ对LNCaP细胞增殖的影响，表明PC-SPES Ⅱ的质量浓度在180-1440 mg/L范围内，随着浓度升高，细胞活力下降，同对照组比较，能明显抑制细胞增殖，并呈现显著浓度依赖性；PC-SPES Ⅱ作用24、48 h 的 IC50分别是312.84、200.13 mg/L（如图 1)。
图1 PC-SPES Ⅱ对LNCaP 细胞增殖抑制作用
3.2 PC-SPES Ⅱ对 LNCaP 细胞周期分布的影响
流式细胞仪检测数据表明，240 mg/L PC-SPES Ⅱ阻滞了LNCaP细胞的G2/M 期，组织作用在0-48 h范围内随作用时间增加而上升，并呈现一定的时间依赖性。与对照组相比，实验组G0 /G1峰前出现了亚二倍体峰（Sub G1，即凋亡峰)，Sub G1峰随药物的作用时间增加而上升，在PC-SPES Ⅱ（240 mg/L)作用LNCaP 细胞48 h后，Sub G1峰值最高，细胞比例为 35.10%（P <0.001)（如图 2)。
图2 PC-SPES Ⅱ对LNAaP细胞周期分布的影响
3.3 PC-SPES Ⅱ对LNCaP 细胞凋亡的影响
应用Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞仪检测凋亡细胞的比例发现：240、480 mg/L PC-SPES Ⅱ作用于LNCaP 细胞24 h后，凋亡细胞的比例明显增加，主要表现是早期凋亡细胞比例升高，与对照组0.55% 比较，分别上升至19.6%、36.1%。
3.4 PC-SPES Ⅱ对 LNCaP 细胞PSA分泌的影响
LNCaP细胞是激素依赖性的人前列腺癌细胞系，能高表达AR、PSA，PC-SPES Ⅱ为480 mg/L时作用于LNCaP能显著降低细胞PSA的分泌水平，与对照组PSA 114.36 μg/L相比，作用48 h后PSA下降最为明显，浓度为16.17 μg/L（P<0.001)。本文以25 mg/L Bic作阳性对照，作用于LNCaP 48 h后，480 mg/L PC-SPES Ⅱ降低细胞PSA分泌的效果与25 mg/L Bic的作用效果相当（如图3)。
图3 PC-SPES Ⅱ对 LNCaP 细胞PSA分泌的影响
3.5 PC-SPES Ⅱ对 LNCaP 细胞 AR、PSA mRNA 表达的影响
通过qRT-PCR检测PC-SPES Ⅱ作用LNCaP 细胞24 h后AR、PSA的mRNA 表达情况。结果显示，在25 μg/L R1881诱导下LNCaP 细胞AR、PSA表达均明显上调，分别为空白对照组的1.4、8.1倍（P<0.05)；在240-480 mg/L PC-SPES Ⅱ作用下对AR、PSA的下调作用明显，480 mg/L PC-SPES Ⅱ作用24 h后，与单用R1881诱导组比较，对AR、PSA分别下调表达约76%，85%（P<0.05)，和25 mg/L Bic作用相当，将二者和内参基因β-actin相比后相对表达量的数据进行分析，将空白对照组的相对表达量设为1.0（如图4)。
图4 PC-SPES Ⅱ对 LNCaP 细胞AR和PSA 的mRNA 表达影响
3.6 PC-SPESⅡ对LNCaP 细胞AR和PSA蛋白表达的影响
Western blot显示，在25 μg/L R1881诱导下，细胞AR、PSA的蛋白表达明显增高，25 μg/ L R1881作用24 h 后，AR与PSA 蛋白相对表达量分别均为空白对照组的2.0倍；在240-480 mg/L PC-SPESⅡ的作用下能抑制AR和PSA蛋白表达量的上调，并且呈剂量依赖性（如图5)，该结果与AR和PSA mRNA的表达变化一致。
4 讨论
前列腺癌是男性生殖系统中最为常见与高发的恶性肿瘤[7]。有报道称AR对PSA表达起正调控作用，同时，PSA可反馈激活AR，是调控AR表达的活化因素，可直接关系前列腺癌发展[8]，因此，寻找靶向AR药物治疗前列腺癌具有一定的研究前景与应用价值。
图5 PC-SPESⅡ对LNCaP 细胞AR和PSA蛋白表达的影响
本文发现PC-SPES Ⅱ可明显抑制LNCaP细胞增殖，使细胞周期阻滞于G2/M 期，进而诱导细胞凋亡，而且体外抑制LNCaP细胞作用效果尤为显著。LNCaP细胞为来源于人前列腺癌淋巴结转移灶的细胞，其具有管腔上皮样的细胞特征，其表型是CK5-/CK8 + /AR + /PSA +，研究表明，AR对该肿瘤细胞增殖有促进的作用[9]。同时研究报道AR参与调节多个与细胞凋亡有关的信号分子，包括p21、p53、Bcl-2与Caspase家族等，PCa细胞凋亡中AR主要表现为抑制作用，相反地，下调AR表达即可诱导PCa的细胞凋亡[10]。因此，为了探究中药复方PC-SPES Ⅱ抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖的机制，假设 PC-SPES Ⅱ抑制LNCaP增殖作用，阻滞细胞周期与诱导细胞凋亡作用和调控AR 分子有关，本研究进一步考察了PC-SPES Ⅱ对LNCaP细胞AR表达的影响。结果表明，通过25 μg/L R1881来诱导LNCaP细胞高表达AR，PC-SPES Ⅱ质量浓度在240-480 mg/L可显著下调AR的mRNA、蛋白表达量。表明PC-SPES Ⅱ抑制 LNCaP增殖机制可能与阻断AR信号有关。同时，还发现240-480 mg/L PC-SPES Ⅱ能明显降低LNCaP细胞PSA的分泌水平、R1881 诱导下PSA 的mRNA与蛋白表达，由于AR分子直接调控PSA表达，该结果验证了PC-SPES Ⅱ对AR表达的抑制作用。
综上，中药复方PC-SPES Ⅱ有抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖、阻滞细胞周期并会诱导细胞凋亡的作用，其机制可能通过阻断AR信号、下调 PSA 表达实现的。
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作者简介：
杨邵波，1966年3月生，本科学历，副主任医师，联系电话：18674860373
论文作者:杨邵波
论文发表刊物:《航空军医》2016年2期
论文发表时间:2016/5/24
标签：细胞论文; 作用论文; 浓度论文; 凋亡论文; 蛋白论文; 抑制论文; 诱导论文; 《航空军医》2016年2期论文;