庞全海[1]2005年在《山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究》文中进行了进一步梳理骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来自于骨髓的两种干细胞之一,在人、小鼠、大鼠、兔、猪等许多物种的研究证明了该类干细胞具有体外分化为多种细胞表型的能力,有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今未见关于山羊,特别是成年山羊骨髓间充质干细胞分离、培养、分化等方面的系统研究报道。本研究目的在于阐明山羊骨髓间充质干细胞的生物学性能及其分化潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型,以及利用该类细胞作为细胞生物反应器体外生产生物活性物质,进而建立山羊骨髓间充质干细胞细胞系。为此,本试验利用成年关中奶山羊为对象,较为系统全面地研究了其骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、细胞表面标志,以及体外诱导分化能力。结果如下:1. 本试验应用贴壁分离法或密度梯度离心法成功分离获得关中奶山羊髂骨骨髓间充质干细胞,体外培养到第21 代,仍然保持其干细胞的特性,并已扩增到2.8×108细胞。2. 本试验所分离的关中奶山羊骨髓间充质干细胞呈多角形、叁角形或长梭形,类似于人和其他物种的间充质干细胞。3. 扫描电镜下,山羊骨髓间充质干细胞表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突,当多个细胞同时存在时,这些丝突相互搭接成网状。透射电镜下,山羊骨髓间充质干细胞的结构与其他物种基本相似,即表现为细胞内有大量扩张的粗面内质网、线粒体,分泌功能旺盛,具有该类细胞的典型特征:细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显处于功能静息期。4. 免疫细胞化学分析表明,山羊骨髓间充质干细胞能够表达间充质干细胞的表面标志CD29、CD44、CD105、CD106 以及CD166(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34、CD45、c-kit (阴性),和其他物种的骨髓间充质干细胞相似。这些标志的检测有助于鉴定间充质干细胞。但本试验还发现,山羊骨髓间充质干细胞也表达TGF-α,其意义需要进一步阐明。5. 山羊骨髓间充质干细胞可以在体外用5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞表型,能够表达α-actin 抗原,呈PAS 染色阳性,并分泌糖原,从而为未来利用这种细胞进行心脏疾病细胞/基因治疗的模型研究提供了科学依据。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。6. 用HGF 和尼克酰胺向胰岛β-细胞诱导后,山羊骨髓间充质干细胞能够变为较典
林砚铭[2]2013年在《中药复方诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究》文中指出目的：本研究旨在通过补肾填精的中药复方(左归丸)诱导骨髓间充质干细胞分化,并通过免疫组化鉴定诱导分化后的细胞为神经元样细胞,从而为“肾藏精、生髓”的传统中医理论提供相应的实验依据。方法：实验一利用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,并在体外扩增、纯化,倒置显微镜下观察其形态,利用左归丸药液对分离后的细胞进行诱导分化,通过阿利新蓝染色、改良钙钴法碱性磷酸酶染色、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色以鉴定分化后的细胞是否为成骨细胞、软骨细胞、神经元样细胞。实验二利用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,利用左归丸拆药后的各组药液分别对获得的细胞进行诱导分化,并进行神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色,计其阳性表达的细胞。结果：实验一显示,分离纯化后的细胞,经倒置显微镜观察其形态,再左归丸药液诱导分化后,经阿利新蓝染色、改良钙钴法磷酸酶染色、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色,证明获得的细胞向软骨细胞、成骨细胞、神经元样细胞进行了分化,获得的细胞的形态符合骨髓间充质干细胞的形态表现。实验二将获得的骨髓间充质干细胞,用左归丸拆药后的各组药液对其进行诱导分化,经NSE染色后计阳性表达细胞,结果显示撤出熟地NSE表达明显增高；撤除枸杞后阳性表达率下降最多,其次是山茱萸、山药、牛膝；撤出菟丝子不影响该酶的表达。结论：实验一：采用全骨髓贴壁法获得的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞；中药复方左归丸对大鼠骨髓间充质干细胞有多向诱导分化作用。实验二：撤出熟地神经元烯醇化酶表达增高,提示熟地可能对BMSC向神经元样细胞方向分化有一定抑制作用(或调控作用)；枸杞对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导作用最强,其次是山茱萸、山药、牛膝：菟丝子对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化无明显的促进作用。
姜红[3]2003年在《成年小鼠骨髓间充质干细胞培养及体外诱导分化为神经元样细胞》文中研究说明目的 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC_s)又称为骨髓基质细胞，是存在于成年骨髓中的一种干细胞。它不仅可诱导分化为中胚层来源的各种细胞，还可以分化为神经胶质细胞和神经元样细胞。骨髓间充质干细胞取材方便，扩增迅速，可通过血脑屏障在脑内广泛迁移，无免疫排斥反应。这使其成为神经系统疾病细胞移植治疗的合适的供体细胞。 目前，国内关于骨髓间充质干细胞在神经系统疾病应用方面的研究还很少见。本文旨在建立一种稳定可靠的成年小鼠骨髓间充质干细胞的培养及诱导分化为神经元样细胞的方法，为进一步的研究奠定基础。 实验方法 1．6～8周成年昆明小鼠，无菌条件下取双侧股骨，获取骨髓细胞，通过弃去未贴壁的细胞，可分离获取MSC_s进行培养。倒置相差显微镜每日观察原代、传代细胞的形态变化，生长状态。HE染色观察细胞形态。 2．采用含有1mmol／L β巯基乙醇，10％胎牛血清的DMEM培养液预诱导MSC_s24h，再用含8mmol／L β巯基乙醇无血清的DMEM培养液诱导6h，倒置相差显微镜观察诱导前后细胞形态变化，免疫组化测定诱导前后神经元特异性烯醇化酶(NSE)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达，记数诱导前后阳性细胞数，诱导后NSE中等强度阳性和强阳性的细胞数，计算均值和标准差。 3．为证明培养的细胞具有多向分化潜能，采用含 IX 10一mol／L地塞米松、10％胎牛血清的 DMEM培养液诱导 MSC＊2天，油红O染色以鉴定脂肪细胞形成。 结 果 1．培养细胞各代形态稳定，以成纤维状细胞为主。前五代细胞7－9天可达到融合。 2．pat基乙醇诱导后MSCs形态变化明显，胞体收缩成锥形、球形，突起增多。免疫组化染色未诱导的MSCs大部分细胞NSE成微弱的阳性表达，少数细胞为阴性。诱导后NSE表达明显增高，中等强度阳性和强阳性的细胞数占细胞总数的百分比为71．4ill．l％。诱导前后都未发现 GFAP阳性细胞。 3．地塞米松诱导12天后油红O染色，可见含红色脂滴的脂肪细胞。未诱导的MSCs油红O染色为阴性。 讨 论 至今还没有用于鉴定骨髓间充质干细胞的特异性标志物。通常的鉴定方法是通过其易于贴壁生长的性质，反复换液奔去未贴壁的造血细胞，使其得以纯化，形态学上观察细胞以成纤维样细胞为主，并具有多向分化潜能。我们培养的细胞遵循经典的培养方法，具有典型的形态特点，并证明其可以同时向神经元样细胞及脂肪细胞分化。所以说，我们所培养的细胞即为骨髓间充质干细胞。 实验中我们采用了最简单的接种方法，骨髓直接稀释法，即将所取细胞直接接种于培养瓶内。这样既提高了接种数量，又减 ·2·少了污染机会以及对细胞的损伤与破坏，提高了原代培养的成功率。 我们观察到MSCS可分为叁类：一类是大而扁平的细胞，一类是较小的梭形细胞，在对数生长期初期还大量存在一种具有高度折光性的小圆形细胞。这与David等人的看法相一致。David等人用流式细胞仪分析后认为，这种小圆形细胞在对数生长期转化为成熟的MSCS细胞。而且，将小圆形细胞和成熟的MSCS细胞分别培养，小圆形细胞表现出更强的分化潜能。 NSE（神经元特异性烯醇化酶）和 GFAP（胶质纤维酸性蛋白）分另是神经元和神经胶质细胞的特异性的标志物。p流基乙醇诱导后NSE表达明显升高，而诱导前后都没有检测到GFAP的表达，这说明我们的诱导方法仅使MSCS向神经元样细胞分化。这与WOOdbmp等人的实验结果一致。由于我们没有证明诱导分化后的细胞有神经元的功能活动，我们仅称之为神经元样细胞。诱导后的细胞是否具有功能活动需要进一步研究。 尽管骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞的机理目前还不清楚，骨髓间充质干细胞移植治疗神经系统疾病缺血性脑血管病、帕金森、创伤性脑损伤、坐骨神经再生，在动物实验中取得了明显的疗效。而且，Dezawa等人发现，将MSCs细胞体外诱导为具有Schwann细胞特点的细胞，再将其移人截断的坐骨神经末端，移植诱导后细胞的坐骨神经再生更显着，与移植未诱导MSCS组相比有显着性意义。那么，是否诱导分化为神经元样细胞的MSCS移植会更有助于中枢神经系统疾病的恢复值得继续研究。 结 论 1．在本实验培养条件下，原代接种成活率高，生长稳定， ·3·增殖迅速，培养细胞形态以成纤维样细胞为主，并具有多向分化潜能，培养细胞即为骨髓间充质于细胞。 2．pat基乙醇可诱导骨髓间充质于细胞体外分化为神经元样细胞，但不能诱导其分化为星形胶质细胞。
刘敬霞[4]2007年在《脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响》文中认为背景与目的缺血性脑血管疾病的高致残率严重影响患者的生存质量，脑缺血损伤引起的神经元结构破坏和缺失是引起功能障碍的病理关键。针对脑缺血损伤引起的生化、代谢改变，保护神经元免于受损，或促进脑缺血损伤后神经细胞再生成为干预损伤、恢复功能的重要策略。目前药物性的神经保护研究和临床应用仍欠理想。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)具有较强的增殖能力和多向分化潜能，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经细胞，成为脑缺血损伤后神经细胞再生理想的种子来源。鉴于骨髓间充质干细胞体外诱导剂的毒副作用和体外分化后移植脑内较弱的存活能力，近年来，对体外纯化、扩增培养的骨髓间充质干细胞移植脑内以治疗脑缺血损伤成为研究的热点。因此，开展骨髓间充质干细胞移植在神经细胞再生和神经功能修复方面的研究对脑缺血损伤具有重要意义。近年来渐有中医药在骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的报道，但研究多集中于对其体外的诱导分化方面，所选药物以单味中药或提取物为主，而中药复方对BMSCs移植后在活体内影响其存活、分化方面的研究少见。脑梗死属中医“中风”范畴，其病机复杂，以浊毒、血瘀和气虚表现尤为突出：气虚血瘀、毒损脑络为脑梗死的主要病机。解毒降浊、益气化瘀为脑梗死的主要治法。据此研制的中药复方脑脉通(大黄川芎人参葛根)具有解毒降浊、益气活血通络功效，可对脑缺血损伤发挥保护作用。动物实验和临床观察表明，脑脉通治疗脑梗死的效果肯定，可显着改善患者的生存质量。鉴于上述，开展中医药联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤研究具有重要意义。本研究从脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生方面评价脑脉通、BMSCs移植及其联合的脑保护作用，并从脑脉通对BMSCs移植后脑组织神经营养因子水平、向神经细胞分化的比率及对促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的影响方面探讨其可能的作用机制。方法本研究以SD大鼠为研究对象，体外全骨髓贴壁筛选培养法获取骨髓间充质干细胞；移植前48 h用Brdu对骨髓间充质干细胞进行体外标记；栓线阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血再灌注动物模型；脑缺血3 h再灌注24 h由颈内动脉移植骨髓间充质干细胞悬液。动态观察移植后早期(7 d)、中期(14 d)、后期(28 d)大鼠的神经功能和生存状况变化；采用病理形态学、免疫组织化学法以及免疫组织化学双标法，从神经功能综合评分、脑组织含水量、脑梗塞灶、神经细胞超微结构变化方面观察脑脉通对骨髓间充质干细胞移植保护脑缺血损伤的影响；从神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白以及与之相关的神经营养因子表达的变化方面探讨脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对神经细胞的保护作用及可能的作用机制；观察骨髓间充质干细胞移植后在脑内的存活、迁移和分化特点以及脑脉通对其的影响；进一步从神经元突触标志性蛋白表达的变化方面观察骨髓间充质干细胞移植后对神经元突触重建的作用以及脑脉通对其作用的影响。主要研究结果如下：结果1．脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用1．1体外全骨髓贴壁筛选培养法纯化骨髓的效果理想，可在短期内获取移植所需的骨髓间充质干细胞；颈动脉移植骨髓间充质干细胞操作易行，细胞悬液少有外漏，移植途径可取。1．2脑缺血再灌注损伤后大鼠体重变化呈现由减轻到增加的趋势，且体重的变化与大鼠全身状况一致；大鼠神经功能随脑缺血再灌注时间的延长逐渐恢复；脑组织水肿程度、梗塞灶的大小及神经细胞超微结构的改变随脑缺血再灌注时间的延长出现由加重到减轻的改变。1．3骨髓间充质干细胞由颈内动脉移植对脑缺血损伤的保护作用与其移植脑内后的时间相关，BMSCs移植后早期未显出明显的保护作用；移植中期的神经功能恢复，脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构有改善趋势；移植后期的神经功能恢复和神经细胞超微结构的改善明显。1．4脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同时间的均有不同程度的改善作用；BMSCs移植联合脑脉通对脑缺血再灌注损伤的保护作用较单纯BMSCs移植的作用提前，联合应用对神经功能的修复和对神经细胞病理损伤的改善作用明显增强，且随移植后BMSCs在脑内时间的延长，联合应用的保护作用更为显着。2脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞再生及神经营养因子的影响2．1随着脑缺血再灌注时间的延长，脑组织神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达减弱；神经生长因子和胶质源性神经营养因子的变化随脑缺血再灌注时间的延长呈现先增高再降低特点。2．2 BMSCs移植后早期神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白无明显增高；随BMSCs移植脑内时间的延长，神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达增强，其中神经元特异性烯醇化酶的增强较胶质纤维酸性蛋白明显，以移植后期的增强更为显着。BMSCs移植后早期对神经生长因子和胶质源性神经营养因子的水平变化无明显影响，随移植后时间的延长，其上调神经营养因子的作用增强。2．3脑脉通联合BMSCs移植后早期神经元特异性烯醇化酶的表达较单纯移植组增强；联合组后期的神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达均有增强。脑脉通联合BMSCs可明显提高移植中期胶质源性神经营养因子水平，并使移植后期神经生长因子的表达明显增强。3．脑脉通对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓间充质干细胞移植后向神经细胞分化的影响3．1 BMSCs移植后在脑实质内和血管腔内的分布比例随移植后时间的延长而增加。移植后早期，大多BMSCs位于血管腔内，黏附血管内皮呈丛簇样聚集，脑实质内有少量散在的BMSCs，分布未见明显规律；移植后中期，BMSCs大多从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内，并向缺血侧部位迁移，血管腔内可见到少数标记的BMSCs；移植后期，血管腔内未见Brdu细胞，存活的BMSCs全部由血管进入脑实质，并迁移至缺血侧，对侧少有Brdu细胞；联合脑脉通可使OBMSCs移植后在脑实质内存活的数量明显增多，但脑实质和血管腔内BMSCs的比例及进入脑实质后的迁移方向未见明显改变。3．2 BMSCs移植后向神经细胞的分化随植入时间的延长出现分化率和分化方向的改变。BMSCs移植后早期在脑实质内的分化率低，未显示出分化方向的差异性；移植后中期的分化率明显增高，以向神经胶质细胞的分化明显；移植后期，BMSCs向神经元细胞的分化明显增强，而向神经胶质细胞的分化相对减弱；脑脉通对BMSCs移植后不同阶段在促进BMSCs向神经细胞分化方面的作用具有差异性，表现为在移植中期促进神经胶质细胞分化，而移植后期则使BMSCs向神经元方向的分化增强。4．脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的影响4．1脑缺血再灌注损伤后神经元结构破坏，神经丝排列紊乱，变短，数量减少，稀疏，分布不均匀，且随脑缺血再灌注时间的延长而加重；促进受损后神经元突触重建的生长相关蛋白-43和标志神经元突触重建的蛋白表达减弱，且随脑缺血再灌注时间的延长呈现递减趋势。脑脉通对脑缺血再灌注早期的神经元结构受损具有保护作用，神经元突触素蛋白的表达增强，但对生长相关蛋白-43的表达无显着影响。4．2 BMSCs移植后早期对神经元结构受损未显出明显的保护作用；移植后中期，神经元突触重建特异性标志蛋白显示增加趋势；移植后期神经丝蛋白、促突触重建的生长相关蛋白-43和神经元突触素蛋白的表达增强。BMSCs对脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的促进作用与移植脑内存活的时间相关，该作用随移植后时间的延长而增强。4．3脑脉通联合BMSCs移植可使早期神经丝蛋白表达增强、神经元结构破坏减轻；神经生长相关蛋白-43的表达提前，并增强其后期的表达；移植后期神经元突触素蛋白的表达增强。结论综合上述研究，结果提示，①体外全骨髓贴壁筛选纯化、培养和扩增BMSCs的方法可行，Brdu标记BMSCs的效果理想，由颈内动脉移植BMSCs悬液易于操作，移植后的BMSCs可在脑内存活、迁移，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。②脑缺血再灌注损伤后神经功能、脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构改变可随脑缺血再灌注时间延长有不同程度恢复；脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同阶段具有不同程度的保护作用，以早期的作用明显；BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用与其移植后的时间相关，移植后早期未显出明显的脑保护作用，但随着BMSCs移植脑内时间的延长，其保护作用逐渐增强。③神经细胞随脑缺血再灌注损伤时间的延长持续受损、数量减少，神经营养因子出现先增高再降低特点，其在早期的升高对神经细胞受损具有保护作用，后期水平降低则不利于神经细胞的再生和修复；脑脉通对神经细胞的保护作用与其早期和中期上调胶质源性神经营养因子、后期上调神经生长因子表达有关；BMSCs移植对保护神经细胞和上调神经营养因子表达的作用随移植后时间的延长而增强；脑脉通联合BMSCs移植可使其对神经细胞的保护作用提前，并使后期的作用增强，以对神经元的作用尤为明显，这可能与脑脉通促进BMSCs移植后上调神经营养因子表达的作用有关。④随移植后时间的延长，BMSCs逐渐从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内存活、向缺血侧迁移，出现神经细胞分化，但未显示出分化方向的差异性；脑脉通可使移植后BMSCs在脑内的存活增强，并在促进其向神经细胞分化方面显示出差异性，表现为促进中期BMSCs向神经胶质细胞分化和后期向神经元细胞分化。⑤神经元突触重塑是其结构重建与功能修复的基础，神经元突触重塑功能随脑缺血再灌注时间的延长有减弱趋势，这可能与促进神经元突触重建生长相关蛋白的表达下调有关；脑脉通在脑缺血再灌注早期可保护神经元结构受损，后期可增强神经元突触重建；BMSCs对神经元突触重建作用随移植后时间的延长逐渐增强；脑脉通联合BMSCs可使脑缺血再灌注损伤后早期神经元突触重建提前，并可增强中期与后期的神经元突触重建，其作用可能是通过上调促神经元突触重建的生长相关蛋白-43的表达实现。因此认为，脑脉通联合BMSCs移植对脑缺血再灌注神经细胞再生具有促进作用，其作用与脑脉通使BMSCs移植后上调神经营养因子、促进向神经细胞分化及增强促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的作用在早期提前和在后期增强有关。研究可为BMSCs移植治疗脑缺血损伤以及相关领域中药的深入研究提供科学依据，并对进一步中医药学及其与细胞治疗学应用的研究具有重要价值。
刘霞, 单伟, 曾瑞霞, 房艳, 李德华[5]2009年在《枸杞多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化》文中进行了进一步梳理背景:近年研究表明,枸杞多糖具有很强的抗氧化作用,可以清除超氧阴离子(O2-?)和羟自由基(?OH),具备诱导剂的基本条件,但将其用作诱导剂的报道甚少。目的:以枸杞多糖作为诱导剂,探讨其体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-09/12在辽宁医学院解剖实验室完成。材料:SD大鼠8只,由锦州医学院动物中心提供。枸杞多糖为宁夏杞瑞康有限公司产品。方法:无菌条件下取出大鼠股骨,利用贴壁筛选法体外分离培养骨髓间充质干细胞。取生长状态良好的第2代细胞进行诱导实验,将1×107L-1细胞悬液1mL接种于预先放置盖玻片的24孔板内,每孔加入1mL预诱导液(含枸杞多糖1g/L、体积分数为15%胎牛血清的DMEM完全培养基),置37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内继续培养,24h后更换诱导液(含1g/L枸杞多糖的无血清DMEM培养基),于上述CO2孵箱内诱导。并设立添加全反式维甲酸的阳性对照组,以及空白对照组。主要观察指标:诱导过程中镜下动态观察细胞形态学变化。诱导第8,24h采用免疫组织化学技术检测细胞内nestin,NF,GFAP的表达。结果:骨髓间充质干细胞原代培养24h大部分贴壁生长,第3天进入指数生长期,细胞增殖加速,7～9d接近汇合。传代细胞较原代细胞生长加快,第3代细胞纯度较高且增殖活跃,传至12代细胞仍然存活。预诱导后骨髓间充质干细胞形态无明显变化,诱导4h后细胞变凸,从胞体伸出突起;24h后细胞突起明显,突起相互连接呈网状,表现出典型的神经细胞形态。免疫组织化学检测结果显示,诱导后细胞浆内nestin,NF均呈阳性表达,GFAP呈阴性。结论:在体外枸杞多糖能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化神经元样细胞。
高月彩, 李蒙, 李瑞玉, 孙艳孚[6]2013年在《补肾中药在干细胞培养与移植中的干预作用》文中提出背景:干细胞移植的不断改进和对传统中医理论认识的不断深入,促进了补肾中药干预干细胞分化的研究。目的:探讨补肾中药在干细胞培养与移植中的干预作用。方法:收集干细胞移植治疗疾病过程加入不同类别单味或复方补肾中药起到的促进干细胞增殖分化、诱导分化的作用等相关研究,进行实验数据分析,应用血清药理学原理评估补肾中药在干细胞培养与移植中的干预作用。结果与结论:加强补肾中药与干细胞的基础研究,在现有新理论基础上,继续深化相关的基础理论研究,使补肾中药与干细胞研究有科学的理论指导,在干细胞增殖、分化及转分化机制研究的基础上,筛选能调节干细胞不同发育阶段的补肾中药。在此初步筛选的基础上,结合临床应用中已经取得的成果,才能有针对性地选定相关的单味或复方补肾中药,研究其对干细胞移植治疗重大疾病的干预作用。
姜红[7]2006年在《人脐血间充质干细胞移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤的研究》文中指出研究背景 新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是造成儿童智能伤残的主要原因之一。目前对缺氧缺血性脑损伤后修复治疗是一个尚未解决的世界性难题。源于胚胎组织的神经干细胞(neural stem cells，NSC)曾被认为是治疗中枢神经系统疾病的希望，但因其利用来源的缺乏和伦理道德的约束而受到明显的限制。近期文献报道，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymM stem cells，BM-MSCs)作为一种多潜能干细胞，在体外一定条件下可向骨、肌肉、肝脏、神经胶质细胞和神经元分化，骨髓MSCs移植已用于多种疾病的实验研究。但是，骨髓来源的MSCs因其有被病毒污染的可能和随着年龄的增长细胞数量及扩增和分化的能力均明显下降等特点，它作为种子细胞用于移植治疗的能力也因此受到极大的限制。故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的干细胞来源是非常必要的。 已有研究表明，人脐血(human umbilical cord blood，HUCB)中含有丰富的造血干细胞/祖细胞(hematopoietie stem cell/hematopoietic progenitor cell，HSC/HPC)，脐血中的造血干细胞/祖细胞已成功的用于临床的异体细胞移植治疗。但有关脐血中是否含有MSCs目前仍有争议。有一些学者认为在正常足月生产的胎儿脐血中不存在MSCs，或认为在足月分娩的脐带血中MSCs的含量极低，而不能满足实验和临床的需要。近年来许多研究证实，从脐血中可成功培养出MSCs，且脐血MSCs具有与骨髓MSCs相似的性质，具有较强的可塑性和多向分化潜能，脐血MSCs在体外特定的条件下可定向分化为神经元和神经胶质细
屈长青[8]2006年在《猪脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究》文中研究表明在动物体内,脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和赋形组织,还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此,脂肪细胞分化的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之一。2001年Zuk等发现脂肪中存在脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells, AMSCs)以来,在人、小鼠、大鼠和兔等多个物种上的研究证明其具有体外分化为多种细胞表型的能力。脂肪组织与骨髓相比,具有易分离,干细胞含量高等优点,在体外培养条件下,AMSCs要比骨髓MSCs具有更高的增殖速率,因此其有望成为未来细胞/基因治疗和组织工程的主要种子细胞之一。猪沉积脂肪能力强,是研究脂肪组织形成与发育较为理想的动物模型。近年来的研究也证明,猪在遗传上比通常使用的其他实验动物如小鼠和大鼠等更接近人类。但是,迄今为止,国内外尚未见关于猪AMSCs分离、培养和多向分化等方面的系统研究报道。本文以1-3日龄仔猪为实验动物,采集颈部及肩胛部皮下脂肪组织,胶原酶消化法获得AMSCs,传代培养,利用免疫组化、流式细胞仪和扫描电镜分析等实验技术研究了猪AMSCs的基本特性;运用免疫组化和RT-PCR法研究了AMSCs在不同因子诱导作用下向成骨细胞、成肌细胞及脂肪细胞分化能力。在此基础上,对比研究了AMSCs成脂诱导与原代培养的基质微管(sromal vascular fraction,SVF)细胞增殖与分化模式,为利用AMSCs研究脂肪细胞形成与分化早期事件奠定了基础。主要结果如下:1.应用胶原酶消化法分离获得猪脂肪基质微管成份(Stromal vascular fraction,SVF),进行原代培养,其中的AMSCs可形成集落。已传21代,并已扩增到1.0×108个细胞。2.本实验所分离的猪AMSCs呈叁角形或长梭形,易形成集落,类似于从人和其他物种所分离获得的AMSCs。3.扫描电镜下,猪AMSCs表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突。4.免疫细胞化学与流式细胞仪检测分析表明,猪AMSCs能够表达间充质干细胞的表面标志CD44和CD105(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34和CD106 (阴性),也不表达成纤维细胞表面标记HLA-DR和前体脂肪细胞与脂肪细胞特异表面标记S-100。5.在体外可诱导猪AMSCs分化为成骨细胞。诱导后,碱性磷酸酶活性提高而呈现阳性反应,产生茜素红染色阳性的矿化结节。RT-PCR在诱导第7天检测到成骨特异基因骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)的表达,随诱导时间的延长,两者mRNA水平均呈上升趋势。
李光凤[9]2008年在《梅花鹿鹿茸的组织学及间充质层细胞体外诱导分化研究》文中研究说明本实验以梅花鹿鹿茸为研究对象,通过光学显微镜和透射电镜观察梅花鹿鹿茸生长顶端的组织结构,建立梅花鹿鹿茸间充质层细胞的体外短期培养及保存方法,对体外培养的梅花鹿鹿茸间充质细胞进行生物学检查,并对鹿茸间充质细胞进行体外诱导向软骨细胞分化,以期对梅花鹿鹿茸生长机制进行初步研究。结果显示,梅花鹿鹿茸生长顶端从远端到基部分为真皮层、间充质层、前成软骨层、过渡层和软骨层。各层组织之间细胞形态和结构差异明显,间充质层、前成软骨层、过渡层和软骨层之间没有明显界限。从间充质层向下依次出现前成软骨细胞、成软骨细胞及软骨细胞;细胞间质内胶原纤维逐渐增加,交织排列;组织内血管沟由细到粗、由不连续变为连续、由稀疏变为密集。梅花鹿鹿茸间充质层细胞较小,细胞为梭形,细胞核呈椭圆形,胞质内细胞器含量极少,呈典型的幼稚性细胞形态。过渡层细胞成分多样,存在着从间充质层细胞到软骨细胞之间的各种过渡态细胞。其中包括前成软骨细胞和成软骨细胞。软骨层细胞形态极不规则,胞质内的细胞器主要为大量的粗面内质网,线粒体较少,细胞间质主要成分为胶原纤维,大量的胶原纤维交织成网。建立了梅花鹿鹿茸间充质层细胞的体外培养方法及梅花鹿鹿茸间充质层组织的保存方法。梅花鹿鹿茸间充质层细胞能经组织块预消化培养法,在含10%FBS的DMEM培养基中进行短期体外培养。以5%DMSO + 10%FBS + 85%DMEM为冻存液,经过梯度降温冷却后进行冻存的细胞复苏后存活率最高。鹿茸间充质层组织在4℃完全培养基中能够进行为期7d的短期保存。培养得到的细胞为成纤维样细胞,甲苯胺蓝染色阴性,II型胶原蛋白表达阴性,细胞在5代以内保持其生物学特性的稳定。经TGF-β1体外诱导后,梅花鹿鹿茸间充质层细胞可向软骨细胞方向分化,具有向软骨细胞方向分化的潜能。
崔践英[10]2010年在《大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化神经元样细胞的实验研究》文中指出目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)是目前备受关注的一类多向分化潜能组织干细胞,在特定的条件下,MSCs可以跨胚层分化成神经细胞,骨髓间充质干细胞能被诱导分化为神经元样细胞。多种原因致面神经损伤成为口腔颌面部最常见疾病,因神经纤维的不可再生性,严重影响疾病治疗和患者预后,成为人们面临的难题。如何进行疾病治疗,改善患者预后是各国学者广泛研究的焦点,人们将眼光投向干细胞移植治疗,细胞替代治疗成为神经系统疾病治疗的新途径。本实验探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养条件,体外定向诱导传代骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化并进一步向神经细胞分化,对分化后的神经元样细胞进行鉴定。实验方法1、选用健康SD大鼠,分离纯化并培养大鼠骨髓间充质干细胞。2、应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,通过免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞。3、贴壁培养诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,分为对照组和诱导剂组。对照组中不加诱导剂；诱导剂组分两步诱导：首先加入不同浓度表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子诱导分化剂,连续培养6d；然后应用脑源性神经营养因子和全反式维甲酸继续诱导6d,分别收集诱导后第3d、6d、9d的细胞进行细胞免疫荧光鉴定和免疫组化鉴定。实验结果1、传代第3代骨髓间充质干细胞为梭形成纤维样细胞,均一稳定的表达与间充质干细胞相关的表面抗原标记物CD29,CD44,CD90,阳性率分别为98.76%,98.41%,96.58%,但极少表达CD34,CD45。2、经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)共同诱导6d后,诱导剂组巢蛋白(NESTIN)阳性表达率约为83%,而对照组细胞未表达巢蛋白。3、经脑源性神经营养因子(BDNF)和全反式维甲酸(ATRA)联合诱导6d后,诱导剂组均可见微管相关蛋白2阳性细胞(MAP2),神经丝(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞,大部分细胞转变为神经元样细胞形态,与对照组相比有显着差异(P<0.05),对照组细胞形态仍为梭形成纤维样细胞。结论1、实验采用改良的全骨髓贴壁法,操作简单快速,细胞活性好,是一种较为理想的分离和纯化骨髓间充质干细胞的方法。2、bFGF和EGF两种预诱导剂同时用比bFGF和EGF单一使用效果好。3、bFGF和EGF联合用的3种浓度(50ug/l、100ug/l、150ug/l)中,100ug/l浓度预诱导效果为最佳,诱导出神经干细胞数量多。4、经过ATRA和BDNF联合诱导分化的细胞,能够将大部分神经干细胞分化为神经元样细胞。5、鉴定细胞方法多,本实验应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞,免疫组化和免疫荧光鉴定诱导后神经元样细胞。6、鉴定细胞试剂种类多,本实验应用CD29、CD90、CD45、CD44、CD34、CD90(鉴定骨髓间充质干细胞),NSE、NF、MAP-2, NESTIN(鉴定诱导后神经元样细胞)。
参考文献：
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[3]. 成年小鼠骨髓间充质干细胞培养及体外诱导分化为神经元样细胞[D]. 姜红. 中国医科大学. 2003
[4]. 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响[D]. 刘敬霞. 北京中医药大学. 2007
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[6]. 补肾中药在干细胞培养与移植中的干预作用[J]. 高月彩, 李蒙, 李瑞玉, 孙艳孚. 中国组织工程研究. 2013
[7]. 人脐血间充质干细胞移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤的研究[D]. 姜红. 山东大学. 2006
[8]. 猪脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究[D]. 屈长青. 西北农林科技大学. 2006
[9]. 梅花鹿鹿茸的组织学及间充质层细胞体外诱导分化研究[D]. 李光凤. 吉林大学. 2008
[10]. 大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化神经元样细胞的实验研究[D]. 崔践英. 中国医科大学. 2010