高川[1]2004年在《小鼠胚胎早期发育过程中Xist基因的转录模式》文中研究表明雌性动物的剂量补偿效应是通过细胞中一条X染色体的转录失活来实现的。失活的染色体上面往往发生一系列的修饰，导致产生非常稳定的异染色质且能在细胞复制的过程中稳定遗传。X染色体失活与位于“X染色体失活中心”(XIC)上Xist基因息息相关，主要表现在Xist的转录产物通过包围一条X染色体使其沉默。由于其在X染色体失活中的重要作用，对Xist的研究一直是近几年的研究热点。其中很重要的一点就是试图建立Xist染色体在发育过程中的时空转录模式。但是由于胚胎发育早期Xist转录本数量的稀少而难以达到很好的效果。本实验采用巢氏RT-PCR方法，对来自体外培养的处于各个发育时期的小鼠胚胎进行了分析和性别鉴定。首先提取了6周龄昆明白小鼠几个组织的RNA，用普通反转录法扩增Xist和Sry以确定RT-PCR的条件，Sry的主要作用是用来做性别鉴定。最终将其反应条件确定为退火温度55℃，Sry和Xist可以置于同一体系中扩增。然后利用实验一确定的PCR条件，以Hprt为阳性对照，用巢式RT-PCR对小鼠早期胚胎进行Xist基因的转录分析，结果发现，转录Sry基因的睾丸组织以及雄性胚胎，从受精卵发育到囊胚的过程中，基本上不转录Xist基因；不转录Sry基因的雌性卵母细胞和雌性胚胎，从出现原核开始，到发育至2-细胞期的过程中，Xist基因一直不转录，但是，从4-细胞期开始，一直到孵化前囊胚阶段，雌性胚胎都转录Xist基因。实验结果说明，X染色体的失活最早出现在胚胎发育的4-细胞阶段。同时由于从原核时期扩增到了Sry，本文认为胚胎的性别鉴定取单个细胞即可。本论文不仅建立了Xist基因在小鼠胚胎早期发育过程中的转录模式，为解释X染色体的失活提供了理论依据，而且，也为体细胞克隆胚胎的重新编程和早期胚胎的发育提供了有益参考。
贾若欣[2]2015年在《转基因克隆山羊印记基因、DNA甲基化结合蛋白与组蛋白去乙酰化酶表达的研究》文中指出转基因克隆山羊在医药、畜牧业和生物材料等领域具有广泛的应用前景。虽然制备转基因克隆动物的方法很多,但体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)方法由于可以在细胞水平上进行基因修饰和阳性细胞筛选,是目前最常用的一种方法。近年来,本实验室采用SCNT方法获得了批量转人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)基因的克隆山羊,但总体效率仍然不高。转基因克隆胎儿在附植期或围产期容易发生流产,部分活产的克隆动物也表现出发育异常而导致存活率低。目前普遍认为,转基因克隆效率低下主要是由于供体细胞核不能被卵胞质完全重编程所致。因此,本研究拟由表观重编程入手,从印记基因、DNA甲基化结合蛋白以及组蛋白去乙酰化酶等多个角度研究和分析引起转基因克隆山羊发育异常的原因,为提高转基因克隆效率提供理论参考。1.转基因克隆山羊肺脏组织中发育相关基因表达的研究新生死亡的转基因克隆山羊多表现出肺脏发育异常。因此,本试验采用HE染色法对流产及出生后死亡的转基因克隆山羊的肺脏组织进行了病理分析,并通过荧光定量PCR检测了15个发育相关基因的表达情况。结果表明,流产及新生死亡的转基因克隆山羊的肺脏组织出现了广泛的炎症细胞浸润。与对照组Ⅰ(自然繁殖的1日龄奶山羊)肺脏组织相比,死亡组Ⅰ(出生3日龄内死亡的转hLF基因山羊)肺脏组织中BMP4、FGF10、GHR、HGFR、PDGFR、RABP、VEGF、H19、CDKNIC、PCAF、MeCP2、HDAC1和Dnmt3b等13个基因的表达量显着降低(P<0.05);流产组肺脏组织中的FGF10、PDGFR、RABP、VEGF、PCAF、HDAC1、MeCP2和Dnmt3b等8个基因显着降低(P<0.05)。与对照组Ⅱ(自然交配产生1月龄、2月龄和5月龄的奶山羊)肺脏组织相比,死亡组Ⅱ(出生后26日龄、61日龄和145日龄死亡的转hLF基因山羊)肺脏组织中PCAF和Dnmt3b基因的表达量显着降低(P<0.05)。综上所述,流产及出生后死亡的转基因克隆山羊均出现肺脏病理变化,并伴随有发育相关基因的表达异常,反映了表观遗传修饰的改变可能与转基因克隆山羊肺脏组织的发育异常密切相关。2.转基因克隆山羊心、肝、脾和肾脏组织中印记基因表达的研究本试验以流产组以及新生死亡组转基因克隆山羊为对象,通过HE染色观察了其心、肝、脾和肾脏组织的形态结构变化,并采用荧光定量PCR方法检测了8个印记基因在这些组织中的相对表达量,分析印记基因对转基因克隆山羊发育异常的影响。结果表明,流产组心脏和脾脏组织形态结构未发生明显的变化,肝脏组织有炎症细胞浸润,肾脏呈现肾小球肾炎的组织形态特征;死亡组肝脏组织出现炎症细胞,心、脾和肾脏组织未出现明显的结构变化。同时,与对照组相比,在心脏组织中,流产组CDKN1C、H19、IGF2R和SNRPN等基因的表达水平显着升高(P<0.05),XIST基因的表达水平显着降低(P<0.05),死亡组SNRPN和XIST基因的表达水平显着降低(P<0.05);在肝脏组织中,流产组CDKN1C和DLK1基因的表达水平显着降低(P<0.05),GNAS、H19、IGF2R、PEG3和XIST等基因的表达水平显着升高(P<0.05),死亡组CDKN1C基因的表达水平显着降低(P<0.05),GNAS和PEG3基因的表达显着升高(P<0.05);在脾脏组织中,流产组DLK1基因的表达水平显着升高(P<0.05),GNAS、H19、IGF2R、PEG3、SNRPN和XIST等基因的表达水平显着降低(P<0.05),死亡组DLK1,H19,IGF2R,PEG3,SNRPN和XIST等基因的表达水平显着降低(P<0.05);在肾脏组织中,流产组CDKN1C、DLK1、GNAS、IGF2R和PEG3等基因的表达水平显着升高(P<0.05),H19和XIST基因的表达水平显着降低(P<0.05);死亡组PEG3基因的表达水平显着降低(P<0.05)。以上结果表明,在流产及新生死亡的转基因克隆山羊心、肝、脾和肾脏组织中存在异常的基因组印记;流产组印记基因表达的异常程度显着高于死亡组。提示:印记基因的表达异常可能会引起转基克隆山羊发育缺陷,同时暗示了转基因克隆山羊的供体细胞在重编程过程中存在异常的表观遗传修饰。3.转基因克隆山羊胚胎、胎盘和内脏组织中DNA甲基化结合蛋白表达的研究本试验通过荧光定量PCR和免疫组织化学的方法,分析了MBD1和MeCP2在转基因克隆山羊的胚胎、胎盘、心、肝、脾、肾、胃和肠道组织中基因的表达和蛋白定位。结果表明,与对照组胚胎(自然交配产生的体内受精卵,n=20/时期)相应发育阶段(1-细胞期、2-4细胞期、8-16细胞期、桑椹胚期以及嚢胚期)相比,MBD1基因在转基因克隆山羊胚胎发育的2-4、8-16细胞期的表达水平显着升高(P<0.05),而在桑椹胚和囊胚阶段,其表达水平显着降低(P<0.05);MeCP2基因的表达水平在转基因克隆山羊胚胎发育的2-4细胞期显着降低(P<0.05),在8-16细胞期显着升高(P<0.05)。对转基因克隆山羊胎盘组织形态学分析发现,死亡组胎盘子叶数显着低于对照组和存活组(P<0.05)。同时免疫组化分析显示MBD1和MeCP2蛋白在各组山羊的胎盘滋养层双核细胞以及胃肠道黏膜上皮细胞中均有明显的表达。MBD1和MeCP2基因在死亡组胎盘子叶中的表达水平显着高于对照组和存活组(P<0.05)。此外,与对照组相比,MBD1基因在死亡组心脏、肝脏中的表达水平显着提高(P<0.05);MeCP2基因在死亡组肝脏、脾脏、瘤胃、皱胃、小肠、结肠和直肠中的表达水平显着降低(P<0.05)。以上结果初步表明,在转基因克隆山羊胚胎发育的多个阶段以及多个组织器官中,曱基化CpG结合蛋白MBD1和MeCP2均出现不同程度异常表达,说明转基因克隆山羊发育过程中MBD1和MeCP2参与的转录调控和DNA甲基化的异常可能与转基因克隆山羊发育异常有关。4.转基因克隆山羊胚胎、胎盘和内脏组织中组蛋白去乙酰化酶表达的研究本试验通过荧光定量PCR和免疫组织化学的方法,检测HDAC1、HDAC2和HDAC3在转基因克隆山羊的胚胎、胎盘和内脏组织中的基因表达和蛋白定位,分析组蛋白去乙酰化酶对转基因克隆山羊胚胎发育以及组织器官功能的影响。结果表明,与体内受精卵相对应的各个发育阶段相比,HDAC1和HDAC3基因在转基因克隆山羊胚胎发育的2-细胞期、桑椹胚和囊胚阶段的表达水平显着降低(P<0.05),8-16细胞期表达水平显着升高(P<0.05)。免疫组化分析发现,HDAC1、HDAC2和HDAC3蛋白在转基因克隆山羊胎盘滋养层上皮细胞以及胃肠道黏膜上皮细胞均有表达。荧光定量结果显示,HDAC1和HDAC3基因在死亡组胎盘子叶中的表达水平显着高于对照组和存活组(P<0.05)。此外,与对照组相比,HDAC1基因在转基因克隆山羊心脏组织中的表达水平显着升高(P<0.05),在肝脏、脾脏、瘤胃、网胃、瓣胃、十二指肠、空肠和结肠组织中表达水平显着下降(P<0.05);HDAC2基因在心脏和盲肠组织中的表达水平显着升高(P<0.05),在肝脏、脾脏、网胃、瓣胃、十二指肠和结肠组织中表达水平显着下降(P<0.05);HDAC3基因在心脏、肝脏、脾脏、瘤胃、瓣胃、十二指肠、空肠、结肠和直肠组织中表达水平显着下降(P<0.05),在网胃和盲肠组织中表达水平显着升高(P<0.05)。以上结果表明,在转基因克隆山羊整个发育过程中,组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3都存在异常的表达,而这种异常可能会引起转基克隆山羊胚胎以及组织器官发育异常。
苏建民[3]2012年在《牛体细胞克隆中异常重编程的分析及提高重编程效率的研究》文中指出体细胞克隆技术（也称为体细胞核移植技术）具有重要的理论研究价值和生产实践价值，可应用于治疗性克隆、高价值药用蛋白的生产、抗病转基因家畜的生产、频临灭绝品种的保护、优良品种家畜的扩增繁殖、人类器官移植和疾病模型的构建等研究。但至今体细胞克隆的效率仍然不高，大量体细胞克隆胎儿在附植期或围产期死亡，出生存活的克隆动物也表现各种发育异常。目前认为，体细胞克隆效率低下的主要原因是供体细胞核不能被卵胞质完全的重编程。本文研究了体细胞克隆动物发育异常和死亡的重编程机理，以及探索通过促进重编程来提高体细胞克隆效率的方法，主要研究的内容和结果如下：1.在发育异常体细胞克隆牛各组织上分析多个印迹基因的表达和DNA甲基化水平。巨胎症死亡组体细胞克隆牛的体重、胎盘重和单个胎盘子叶重都显着性高于对照组，但胎盘子叶数显着少于对照组。印迹基因XIST、PEG3和IGF2在巨胎症死亡组克隆牛的胎盘等多个组织上表达水平显着高于对照组；而印迹基因H19和IGF2R在巨胎症死亡组克隆牛的胎盘等多个组织上的表达水平显着低于对照组。H19甲基化差异区（DMR）的DNA甲基化水平在巨胎症死亡组牛胎盘等多个组织上显着高于对照组，呈现异常的超甲基化修饰；而XIST DMR和IGF2R DMR的DNA甲基化水平在巨胎症死亡组牛的胎盘等多个组织上显着低于对照组。体细胞克隆中这些异常的重编程（印迹基因的表达和DNA甲基化水平异常）可能和体细胞克隆牛发育异常以及死亡相关。2.用深度测序技术高通量分析死亡体细胞克隆牛胎盘（克隆组）和正常繁殖生产牛胎盘（对照组）的差异基因表达谱、microRNA信息和全基因组甲基化信息，研究体细胞克隆牛死亡的分子机理。（1）用RNA-seq (Q)深度测序技术高通量分析克隆组与对照组胎盘的基因表达谱，结果发现相比对照组，克隆组胎盘上有664个基因上调，有1948个基因下调。对这些差异基因进行GO显着性富集分析，发现分子功能上的催化活性、细胞位置上的组织相容性复合体及细胞表面是差异基因显着富集的项。在参与的生物过程上，差异基因有13个显着富集的项，其中大部分项都和免疫相关。差异表达基因显着富集的通路一共有25条，其中14条通路和免疫相关。（2）用small RNA-seq深度测序技术高通量分析克隆组与对照组胎盘的microRNA信息。在克隆组和对照组胎盘上分别鉴定出了328种和344种已知的成熟microRNA，并发现169种牛的候选新microRNA。对照组和克隆组间共有135个表达显着差异的已知microRNA，其中克隆组有18个已知microRNA的表达上调，117个已知microRNA下调。两样品间有49个表达显着性差异的候选新microRNA，其中克隆组有35个microRNA的表达上调，有14个microRNA下调。（3）用MeDIP-seq深度测序技术高通量分析克隆组与对照组胎盘上全基因组水平的DNA甲基化信息。本研究首次绘制出反刍动物（牛）的全基因组水平的DNA甲基化图谱。总体上，牛的全基因甲基化模式和其他物种动物和植物的相似。DNA甲基化主要富集在基因内（特别是内含子）和重复序列，而转录起始位点和转录终止位点的DNA甲基化水平较低。牛上大部分CpG岛为非甲基化状态。两样品间有大量差异甲基化水平的基因。共发现37191个CpG岛，甲基化的CpG岛在对照组和克隆租上分别有7482个和5461个。基因表达水平和甲基化水平反相关，转录起始位点附近更为显着，说明启动子甲基化修饰调控基因转录。3.牛体细胞克隆胚胎上存在异常的重编程。多个基因位点在牛克隆胚胎上存在异常的甲基化修饰，XIST、OCT4、SOX2、NANOG、Rex1和Fgf4基因5’端区域的DMR的甲基化水平在牛体细胞克隆囊胚上都显着低于对照组体外受精囊胚。XIST在体细胞克隆囊胚上的表达水平显着高于对照组体外受精囊胚。H3K27me3在牛体细胞克隆囊胚上的表达异常。4.用基因芯片高通量分析克隆效率高的细胞系获得的克隆囊胚（高效克隆组组）、克隆效率低下的细胞系获得的克隆囊胚（低效克隆组）以及孤雌囊胚叁种类型的囊胚和体外受精囊胚之间的差异基因表达谱。相比体外受精组囊胚，TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2和NEK6等基因在低效克隆组囊胚上表达异常，但在高效克隆组囊胚上表达正常。这些基因的异常表达可能与低效克隆组细胞系克隆效率低下有关。孤雌囊胚和体外受精囊胚间有240个显着性差异基因。PEG3和SNRPN等多个父源表达的印迹基因在孤雌囊胚上异常下调。5.分析亮甲酚蓝（BCB）筛选不同核重编程能力的卵母细胞。结果显示用BCB筛选出的不同生长期卵母细胞具有不同的核重编程能力。来自生长完全的卵母细胞(finished growth phase)的牛体细胞克隆胚胎（BCB+）的卵裂率、囊胚发育率、以及移植后胚胎妊娠率和出生率都显着高于来自生长中的卵母细胞(growing oocytes)的克隆胚胎（BCB），说明生长完全的卵母细胞能更好地支持牛克隆胚胎体外和体内发育。BCB+组克隆胚胎上组蛋白乙酰化水平（AcH3K9和AcH3K18）以及H3K4位点的组蛋白甲基化水平高于BCB克隆胚胎，BCB+组克隆胚胎的胚胎质量（胚胎细胞数和胚胎凋亡率）也显着高于BCB克隆胚胎。BCB筛选的不同生长期的卵母细胞也影响克隆胚胎的基因表达。通过BCB筛选出的生长完全的卵母细胞具有更高的体细胞核的重编程能力，将其用于牛体细胞核移植，可提高牛体细胞克隆效率。6.分析表观修饰药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂Oxamflatin对体细胞克隆胚胎的重编程的影响。结果发现1μM Oxamflatin处理牛重构胚12h可提高牛克隆胚胎的AcH3K9和AcH3K18组蛋白乙酰化水平和H3K4me2组蛋白甲基化水平，下调H3K9me3组蛋白甲基化水平，降低体细胞克隆囊胚期胚胎上satellite I的DNA甲基化水平，提高克隆胚胎的质量（胚胎细胞数和胚胎凋亡率），改变克隆胚胎上基因的表达，促进牛体细胞克隆胚胎的体外发育。说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂Oxamflatin可促进体细胞核的重编程和克隆胚胎的质量，对牛体细胞克隆胚胎的发育有显着的促进作用。7.相比体外受精囊胚，TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R这些基因在克隆囊胚上表达正常的细胞系作为核供体获得的克隆胚胎比两个异常表达组的细胞系（异常表达组1是上述4.中的低效克隆组中叁株已知遗传背景差的细胞系，用于供体细胞后，在克隆囊胚上TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2和NEK6等大部分基因表达异常；异常表达组2是叁株细胞系，用于供体细胞后，在克隆囊胚上OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R等几个多能性基因和印迹基因大部分表达异常）获得的克隆胚胎具有更高的体外和体内发育能力，其克隆效率显着高于两个异常表达组。依据这些基因在克隆囊胚上的表达是否正常可以作为筛选供体细胞系的依据。本研究发现牛体细胞克隆中存在异常的重编程，表现为早期胚胎上有大量异常表达的基因、异常的DNA甲基化修饰和组蛋白修饰以及新生克隆牛上有大量异常表达的基因、microRNAs和异常的DNA甲基化修饰等。通过筛选易于重编程的供体细胞系、筛选核重编程能力较强的卵母细胞以及通过表观遗传修饰药物处理克隆胚胎，可提高体细胞克隆中的重编程效率，进而提高体细胞克隆效率。
刘维强[4]2009年在《人类胚胎干细胞X染色体倾斜性失活及印迹、X连锁基因表达状态》文中研究表明人类胚胎干细胞(hESC)因具有自我更新并分化成为叁个胚层不同类型细胞的潜能,在再生医学和细胞替代治疗中具有重要的作用。体外培养过程中遗传和表观遗传的稳定是评价hESC治疗前景的重要条件。尽管对hESC分化过程中的遗传改变已有所了解,但对其表观遗传变化却依然知之甚少。本研究利用表观遗传修饰的一个重要组成部分--X染色体失活(XCI)及印迹、甲基化现象,通过甲基化特异性PCR、荧光实时定量PCR、免疫荧光染色等方法,对hESC的表观遗传调控机制进行了初步研究,对其XCI、相关印迹基因和部分X连锁基因的表达状态进行了分析。对本实验室建立的六株女性hESC的研究表明,和小鼠胚胎干细胞XCI状态不一样,hESC在未分化阶段就已出现了X染色体失活。正常二倍体hESC在分化后能稳定的保持XCI状态。同时本研究发现,五株杂合子hESC的XCI具有两种不同的状态:四株hESC具有极度倾斜性XCI状态,一株hESC的XCI却是随机的。有意思的是,对叁倍体hESC (核型69,XXX)的研究发现,这种细胞具有两条活性X染色体,其XCI状态随着体外的长时间培养发生了变化。对印迹基因及X连锁基因的研究表明,hESC能维持正常的表达状态。本研究还对一株人类孤雌胚胎干细胞(hpESC)的以上特性进行了探讨,发现这种细胞具有遗传和表观遗传的不稳定性。本研究表明,在安全应用hESC于再生医学前,必须进行更深入的表观机制及细胞功能分析。第一部分人类受精卵来源胚胎干细胞的培养及其生物学特征鉴定【研究目的】对前期利用废弃的低质量胚胎建立的hESC系进行培养,为后续研究提供实验材料。对所建立hESC系进行干细胞特性鉴定,掌握不同细胞系的生物学特性。【材料方法】1、利用本实验室前期建立的hESC系,体外培养传代。进行hESC表面抗原SSEA-1,SSEA-4, TRA-1-60,TRA-1-81等染色鉴定。2、每隔10代进行一次染色体核型鉴定,每次计数20个分裂像。3、体外培养保持未分化状态,收集不同代次间的细胞,提取基因组DNA和总RNA。4、对以上细胞体外进行自体分化,分别收集分化第零天及第叁、七和第二十天的细胞,提取基因组DNA和总RNA。5、RT-PCR反应检测经典的Ⅰ类未分化分子标记物基因的表达情况。6、体内外分化能力检测:悬浮培养hESC细胞,形成拟胚体,进行分化标记物基因RT-PCR检测;将hESC团块接种到SCID小鼠的腹股沟皮下,观察是否有肿瘤生长。7、对各株hESC细胞进行16个STR位点鉴别。【结果】1、核型分析,四株hESC为正常核型:46, XX (FY-hES-7,-8,-10,-11);一株为平衡易位13叁体核型(FY-hES-5):46, XX,+13,der(13;13) (q10;q10);一株为叁倍体细胞(FY-3PN):69,XXX。2、六株hESC系均具有典型的hESC克隆形态,表达hESC细胞表面抗原SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81;不表达SSEA-1。3、经典的Ⅰ类未分化分子标记物基因OCT4,NANOG,TDGF1,SOX 2,EBAF, THY-1,FGF4,REX-1等在六株hESC系中均表达阳性。4、六株hESC系均具有体外自发分化形成囊性拟胚体的能力,分化标记物基因AFP,NEUROD1,HBZ等表达阳性。六株hESC均能形成畸胎瘤。5、每株hESC系的STR图谱都不一样,证明其来自于不同的胚胎。【结论】1、采用本实验室最佳培养体系,确保各细胞具有相同的培养条件,为后续实验提供可靠的细胞资源。2、六株hESC系在体外长期传代中,能够维持hESC细胞的生物学特性,具有自我更新、分化的能力。3、STR位点分析用于hESC系的鉴定,可以为其提供相应的“身份证”,区分不同的细胞株,为干细胞将来的临床应用建立完善的档案资料。4、利用废胚的胚胎进行hESC细胞的建系,可能导致异常核型干细胞的产生。核型分析证实罗伯逊易位和叁倍体的hESC在体外培养过程中没有发生自我修复的现象,能保持遗传性质的稳定。第二部分人类胚胎干细胞X染色体失活及印迹、X连锁基因表达状态第一章正常与异常核型人类胚胎干细胞X染色体失活状态分析【研究目的】以XCI为重点,对正常与异常核型人类受精卵来源hESC在自我更新与分化过程中的表观遗传调控机制进行研究,初步了解正常与异常核型hESC在体外培养过程中的XCI状态,并探讨异常核型hESC的XCI状态与正常核型hESC的异同。【材料方法】1、对各细胞DNA进行人雄激素受体基因(HUMARA)多态性片断分析,判断其纯合性,选择HUMARA基因杂合子进行XCI倾斜性分析。2、使用EpiTect Bisulfite Kit试剂盒(QIGEN),将基因组DNA进行用重亚硫酸盐处理,随后行引物特异性PCR反应,并对产物进行多态性片段分析。3、实时荧光定量PCR检测XCI相关基因XIST在不同时期的表达情况。4、细胞低密度种于四孔板内,保持未分化状态,行组蛋白H3赖氨酸27叁甲基化(H3K27me3)免疫荧光染色(Cell Signaling, USA)。【结果】1、正常核型细胞中,叁株细胞HUMARA位点为杂合子,一株细胞为纯合子。二株异常核型的女性hESC的HUMARA位点也为杂合子。叁倍体细胞HUMARA位点表现出叁个不同的位点。2、对六株hESC的XCI失活分析表明,所有细胞在未分化阶段均已开始启动XCI。3、对五株HUMARA位点杂合子的hESC进行XCI倾斜性失活分析,四株细胞具有极度倾斜性失活状态,一株细胞表现为随机失活状态。失活状态在细胞分化后可以稳定的维持。叁倍体细胞具有两条活性X染色体,失活状态在体外长期培养过程中发生了变化,从随机失活逐渐变为极度倾斜性X失活。4、XIST基因伴随XCI的出现在未分化阶段已可检出。在不同的分化时期,不同的细胞系有不同的XIST基因的表达情况。5、组蛋白H3K27叁甲基化免疫荧光染色证实未分化状态细胞的确启动了XCI。【结论】1、基于HUMARA的甲基化特异性PCR是研究hESC倾斜性XCI的一个好方法。2、hESC的XCI具有两种不同的类型:一种为极度倾斜性失活,一种为随机失活。3、和小鼠胚胎干细胞不同,hESC在未分化阶段就已开始启动XCI。正常核型二倍体hESC的倾斜性或随机XCI可以在细胞传代、分化过程中保持稳定。4、分化前后XIST基因表达的变化表明不同的hESC表达XCI标记的能力不一致。大部分细胞系在分化前启动了XCI,但在分化过程中逐渐完成XCI。5、H3K27me3表达证实未分化细胞的确进行了XCI。6、异常核型hESC具有和正常hESC相似的XCI状态,在未分化阶段已启动XCI。7、体外培养条件也许能影响叁倍体hESC的XCI稳定性,导致倾斜性XCI的发生。8、叁倍体细胞因为具有叁条X染色体,在进行X失活时,由于只有一条倾斜性失活,而另两条则全为活性,这将导致其比正常细胞多一倍的基因表达活性,这可能是叁倍体胚胎容易流产的一个表观遗传学原因。第二章人类胚胎干细胞印迹基因及X连锁基因表达和启动子区域DNA甲基化状态研究【研究目的】对具有倾斜性XCI的hESC的X连锁基因PGK1、X染色体上抑癌基因及癌症基因和常染色体印迹基因的表达情况分析,研究这些基因是否随着X染色体的倾斜性失活而发生变化。检测X染色体及常染色体上重要基因的启动子区域DNA甲基化状态随着细胞分化是否产生改变。【材料方法】1、实时荧光定量PCR检测X连锁基因PGK1、X染色体上抑癌基因RBBP7及癌症基因GPC4在不同时期的表达情况。2、选取常染色体上父系印迹基因H19、IGF2R,母系印迹基因SNRPN进行实时荧光定量PCR检测,比较不同时期、不同核型对印迹基因的影响情况。3、实时荧光定量PCR检测正常和异常核型hESC体外自体分化过程中,多能性调控基因OCT4、NANOG的表达情况。4、将不同细胞不同时期的基因组DNA进行重亚硫酸盐处理,随后行引物特异性PCR反应。凝胶电泳分析产物。【结果】1、正常和异常核型hESC的PGK1基因随着分化时间的增加呈现上调表达的趋势。2、异常核型hESC抑癌基因RBBP7及癌症基因GPC4随着分化时间的增加呈现上调表达的趋势,而在正常核型hESC中则下调。3、正常和异常核型hESC中印迹基因表达基本一致:父系印迹基因H19、IGF2R上调而母系印迹基因SNRPN表达则下调。4、正常核型hESC随着分化时间的增加,多能性调控基因OCT4、NANOG表达明显下降,而异常核型hESC中OCT4、NANOG则下降相对没有正常细胞显着。5、正常和异常核型胚胎干细胞XIST基因、SNRPN基因在未分化状态可检出甲基化和未甲基化两种状态,并能在体外分化过程中保持稳定。【结论】1、X连锁基因PGK1、印迹基因在正常和异常核型hESC中表达基本一致,证明检测基因在hESC的发育过程中能维持正常调节。2、正常和异常核型干细胞XIST基因、SNRPN基因启动子区域有正常的DNA甲基化状态,并能随着细胞分化维持稳定的甲基化状态。3、异常核型hESC抑癌基因、癌症基因表达相对正常核型hESC的增加表明此种细胞具有更危险的应用前景,同时多能性基因在分化后仍能检出表明此种细胞分化能力较正常细胞弱。第叁部分孤雌人类胚胎干细胞的遗传和表观遗传稳定性初步研究【研究目的】1、培养本实验室建立的一株人孤雌胚胎干细胞(hpESC) ,并在其培养过程中进行核型分析,了解这种细胞的遗传稳定性。2、对父系基因缺乏的hpESC的XCI状态、印迹基因、多能性调控基因表达情况进行研究,了解其表观遗传学特性及相关生物学特性。【材料方法】1、体外培养hpESC,与捐卵者DNA比较,检测其STR、HLA,证实其孤雌来源。2、每10代进行一次核型分析,每次计数20个分裂像。3、提取孤雌细胞DNA进行HUMARA多态性片断分析。4、将基因组DNA进行重亚硫酸盐处理并行引物特异性PCR反应。5、选取常染色体上父系印迹基因H19,母系印迹基因SNRPN、IGF2进行PCR检测。6、实时荧光定量PCR检测hpESC体外自体分化中多能性调控基因OCT4的表达。【结果】1、与志愿捐卵者DNA比较,其STR、HLA均为纯合子,与志愿者DNA半匹配,证实其的确是孤雌细胞。2、核型的不稳定:在第20代核型为46,XX,第30-50代为46,XX/45,X嵌合体,到了第60代后又恢复为46,XX核型。3、HUMARA基因多态性分析表明,hpESC此基因位点为纯合子。4、对hpESC进行XCI分析,其在第20代没有检出失活的X染色体,表明其为双活性X染色体。到了第60代后,其进行了XCI,一条X为活性的,另一条X为失活的,但由于其为纯合子,不能分析其是否具有倾斜性失活状态。5、XIST基因在早期不表达。长期培养后,伴随XCI的发生,XIST基因表达可检出。6、hpESC母系印迹基因SNRPN、IGF2没有表达。7、多能性调控基因OCT4在hpESC分化后仍可检出,与其分化能力弱有一定联系。【结论】1、本实验室建立的珍贵细胞的确是人孤雌胚胎干细胞。2、纯合子hpESC在体外培养中其遗传学特性不稳定。3、X失活研究表明,hpESC早期是双活性,这可能是其X染色体不稳定的原因之一。在培养过程中,其X染色体进行了选择和修复,并最终发生了XCI。
何杰[5]2016年在《牛早期胚胎发育中JPX影响XIST表达的研究》文中指出在哺乳动物中,雌雄个体之间为了达到X染色体上基因表达量的平衡,雌性个体会在早期胚胎发育过程中将其中一条X染色体失活(X Chromosome inactivation,XCI)。X染色体失活主要由X染色体失活中心(X Inactivation Center,XIC)介导,而位于失活中心的X染色体特异性转录体(X-chromosome inactive special transcript,XIST)在X染色体失活过程中起到主要作用。近年来对XCI失活领域的不断探索,发现了很多XIST的调节子。JPX在2002年被发现,其编码的长非编码RNA是在小鼠胚胎干细胞分化过程中发现的一个XIST的激活子,JPX通过将XIST P2启动子上的绝缘子CTCF游离出来,解除绝缘子CTCF对XIST转录的抑制作用,从而促进XIST的表达,使得XCI正常进行。敲除JPX基因对雌性的胚胎干细胞具有致死性。然而,在胚胎的早期发育中JPX是否也能影响XIST的表达,迄今无相关报道。本研究是在牛的早期胚胎中,采用体细胞核移植技术研究胚胎早期发育中JPX对XIST表达的影响。1、检测牛早期胚胎不同发育阶段中JPX和XIST的表达情况,发现JPX和XIST在牛的2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中都有表达,并且随着胚胎发育相对表达量逐步升高。2、通过QRT-PCR分别检测牛雌雄胎儿心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中JPX和XIST的相对表达量,发现JPX和XIST在雌性胎儿组织中的相对表达量显着高于雄性胎儿组织(P<0.05)。3、根据NCBI上已知的牛JPX序列通过3'-RACE PCR扩增技术将牛JPX 3'端全长660 bp扩增出来,通过测序获得JPX 3'端全长序列。4、构建针对牛JPX的JPX-pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体,QRT-PCR检测到干扰效率为75%(P<0.01),稳转雌性牛成纤维细胞,筛选出单细胞克隆。以获得的单细胞克隆作为供核细胞,进行体细胞核移植,并检测JPX、XIST以及X连锁基因的相对表达量,发现当JPX受到干扰后,相应胚胎时期的XIST表达量显着下降,但叁个X连锁基因PGK1、DYNLT3和MSN在囊胚阶段的表达量显着上调。在牛早期胚胎发育过程中,当JPX RNA水平受到干扰后会下调XIST的表达,进而上调X-linked基因PGK1、DYNLT3和MSN的表达。
刘黎明[6]2014年在《Xist基因调控及对牛SCNT早期胚胎发育的影响》文中研究表明Xist是产生一个非编码RNA的与X染色体相关的基因,它是在合子期基因组开始激活,并且是胚胎早期发育表达的第一个印记基因。尽管Xist是在雌性动物中参与X染色体失活,但Xist RNA的功能尚未被完全认知。在动物克隆胚胎发育中许多基因表达异常,Xist也是这些异常表达基因之一。前期研究表明,利用Xist基因缺陷型供体细胞用于克隆实验,可成功将小鼠克隆效率提高8-9倍。本实验探讨了TAALE载体转染到胎牛成纤维细胞调控Xist基因表达的可行性,并且以抑制Xist基因表达的细胞作为供体制作克隆胚胎,研究Xist基因调控对牛克隆胚早期发育影响。实验结果显示,本实验设计特异性抑制Xist表达载体TALER转染雌性胎牛成纤维细胞,并用mCherry作为载体转染效率检测的报告基因。通过流式细胞仪进行分选获得阳性细胞后直接提取R.NA,反转录扩增cDNA,与同一来源细胞系进行Real time RT-PCR对Xist表达水平检测,结果发现实验组细胞Xist旧对表达量下调93.85%,说明本实验设计的载体转染系统能够有效限制Xist基因的表达。选取Xist基因抑制表达阳性的转染细胞用于体细胞核移植实验,同时用未经处理的细胞作为对照,实验组和对照组的卵裂率、8细胞发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率分别为78.8%vs75.1%(P>0.05,无显着差异)、54.4%vs50.6%(P>0.05,无显着差异)、12.3%vs27.8%(P<0.01,差异极显着)、0vs26.6%(P<0.01,差异极显着)。上述实验结果表明,本实验设计的特异性抑制Xist表达载体TALER可有效地抑制雌性胎牛成纤维细胞Xist基因表达,但这种基因下调细胞用于克隆实验时发现与对照组相比2-8细胞克隆胚胎发育略有提升,但囊胚期和桑葚胚期的克隆胚胎发育率明显降低,其机制有待于进一步探讨。
杨洋[7]2017年在《抑制XIST基因表达对猪克隆胚胎基因表达模式及发育效率的影响》文中认为体细胞核移植技术已经被广泛应用,但是克隆效率低下一直是制约克隆技术发展的主要原因之一。有研究表明,克隆效率低下是由于克隆胚胎中X染色体异常失活导致的,在小鼠中通过敲除供体细胞XIST基因或者利用RNAi技术干扰早期胚胎中XIST基因表达,均能显着提高小鼠的克隆效率。尽管在小鼠上通过基因敲除和RNAi技术抑制XIST基因表达均可以显着提高小鼠克隆胚胎发育效率,但两种方法能否提高猪克隆胚胎发育效率仍然未知。本论文以两种猪体细胞,包括野生型公猪PK细胞(WT)和本实验室前期获得的XIST基因敲除公猪PK细胞(KO)为材料作为供体细胞进行核移植,收集桑葚胚时期两组胚胎,通过转录组测序比较处理组与对照组胚胎基因表达差异。本试验同时比较了突变XIST基因胚胎相较于野生型对照组胚胎的体内发育效率。本试验同时针对猪XIST基因设计了四组小干扰RNA靶序列,筛选了最佳的干扰序列,使用最佳干扰序列合成了普通的siRNA,化学修饰的siRNA,并构建了表达靶向序列发夹结构的质粒表达载体,筛选了干扰作用时间最长的干扰形式。在猪核移植胚胎二细胞期进行包浆注射,对照组注射等体积的水,比较注射组胚胎体外发育效率及相关基因表达情况。本试验获得如下结果:(1)shRNA质粒表达载体转染细胞,其干扰效果持续时间最久,化学修饰的siRNA干扰效率最低;(2)二细胞期注射shRNA质粒表达载体,在囊胚期仍然可以有效干扰XIST基因表达(P<0.05),且显着提高了X染色体连锁基因表达量(P<0.05);(3)二细胞期注射10p L 5ng/μL shRNA质粒表达载体,显着抑制了XIST基因表达水平(P<0.05),但是相较于对照组,其平均囊胚细胞数和囊胚率没有显着差异;(4)以敲除XIST基因的细胞系做供体细胞,显着提高了克隆胚胎中X染色体连锁基因的表达水平(P<0.05);(5)用通过敲入neo-EGFP外源基因突变XIST基因的细胞系做供体细胞,降低了体外培养和体内发育胚胎的发育效率(P<0.05)。以上结果表明,以突变XIST基因作供体细胞做核移植,显着提高了X染色体基因表达水平,但降低了体内发育效率,其原因可能是由于供体细胞经历了长期的G418药物筛选导致。在二细胞期包浆注射靶向XIST基因的shRNA质粒表达载体,在囊胚期可以有效抑制XIST基因的表达,但是囊胚细胞数和囊胚率相较于对照组没有显着差异,其原因可能是由于XIST基因表达模式的种间差异。
刘鑫[8]2018年在《KDM4D和KDM4E在牛受精胚胎发育和体细胞核移植胚胎重编程过程中的作用研究》文中指出体细胞核移植(SCNT)技术可使高度分化的体细胞通过重编程获得全能性,从而发育成新的动物个体。该技术在治疗性克隆生产、疾病模型建立、再生医药制造、家畜性状改良、濒危物种保护等方面的应用潜力巨大。但长期以来,利用SCNT技术生产克隆动物的效率极低,主要表现在胚胎早期发育的高损率、克隆动物在孕期或围产期死亡、克隆动物出生后的发育异常等方面,这严重阻碍着该技术的推广应用。当前广泛认为,供体细胞基因组上的表观遗传修饰未能被卵胞质充分地重编程是导致克隆效率低下的主要原因。研究表明,牛SCNT胚胎在合子基因组激活(ZGA)时期存在异常高水平的组蛋白H3第九位赖氨酸残基叁甲基化(H3K9me3)和二甲基化(H3K9me2)修饰,猜测这两种表观标记是导致牛SCNT重编程不充分的障碍之一。本研究通过转录组测序(RNA-seq)和实时荧光定量PCR(qPCR)实验,首次确认了造成上述异常修饰的两个组蛋白H3K9去甲基化酶——KDM4D和KDM4E。通过胚胎显微注射技术,在牛体外受精(IVF)胚胎中干扰KDM4D和KDM4E基因表达,而在SCNT胚胎中过表达KDM4D和KDM4E,以此研究这两个因子在受精胚胎正常发育和SCNT胚胎重编程过程中的作用。主要的实验内容和结果如下:1.通过RNA-seq数据和qPCR实验,确定了牛IVF与SCNT胚胎中KDM4D和KDM4E基因表达量的变化模式。结果显示这两个基因在两类胚胎中均呈现ZGA时期一过性高表达的转录情况,并且KDM4E的表达量高于KDM4D,而SCNT胚胎中这两个基因的表达量均显着低于同时期的IVF胚胎。2.通过干扰片段的显微注射实验,研究沉默KDM4D和KDM4E基因的表达对IVF胚胎发育的影响。结果发现,同时干扰这两个基因会显着抑制IVF胚胎ZGA阶段H3K9甲基化的抹除,影响卫星序列satellite I和部分合子基因的转录激活,并损害了胚胎的体外发育能力,表现在囊胚发育率低下、囊胚细胞数下降和囊胚凋亡水平上升等方面。而单独沉默KDM4D或KDM4E的差异结果表明,KDM4E对牛受精胚胎的发育发挥着更重要的作用。3.通过KDM4D和KDM4E mRNA的显微注射实验,研究过表达野生型和功能缺失突变型KDM4D或KDM4E对SCNT胚胎发育的影响。结果发现,过表达野生型的KDM4D或KDM4E均会高效去除SCNT胚胎ZGA阶段的H3K9甲基化标记,恢复卫星序列satellite I和部分合子基因的转录激活,并改进胚胎体外和体内的发育能力,表现在囊胚发育率提高、囊胚内细胞团细胞数增多和促进克隆牛出生等方面,但过表达突变型的KDM4D或KDM4E并不会改善SCNT胚胎的发育。4.通过RNA-seq数据,确定8细胞期牛IVF和SCNT胚胎的差异表达基因(DEGs),以及在SCNT胚胎中过表达KDM4E对这些DEGs的调整情况。结果在6,948个上述DEGs中,有1,893个SCNT胚胎低表达的基因可被过表达的KDM4E再次激活,这类DEGs主要参与信号转导、胚胎发育、细胞周期和基因表达调控等生物过程,以及紧密连接、干性因子、蛋白泛素化和Hippo信号等细胞通路。同时,过表达KDM4E使2,057个SCNT胚胎高表达基因的转录水平得到调整。这类DEGs主要参与氧化还原稳态、蛋白甲基化修饰和DNA损伤应答等生物过程,以及氧化磷酸化、蛋白及RNA降解和RNA转录等细胞通路。综上所述,本研究一方面证明了牛IVF胚胎ZGA时期H3K9me3和H3K9me2修饰的抹除由同时期高表达的KDM4D和KDM4E调控,干扰这两个因子的表达不利于IVF胚胎的发育。另一方面证实了牛SCNT胚胎ZGA时期异常高的H3K9me3和H3K9me2修饰与其内源低表达的KDM4D和KDM4E有关,过表达这两个因子促进了SCNT介导的体细胞重编程,并提高了克隆牛的生产效率。
阮子芸[9]2017年在《水牛供体细胞性别对其核移植胚胎发育及印记基因甲基化的影响》文中进行了进一步梳理供体细胞重编程不完全是体细胞克隆效率低的主要原因,包括DNA甲基化、印记基因表达、X染色体失活、组蛋白修饰等方面。为此,本研究拟探讨雌雄体细胞克隆(SCNT)胚胎的发育、DNA甲基化及其甲基化转移酶、组蛋白H3K9甲基化的差异,以及印记基因Xist、H19、IGF2的甲基化和表达水平,并通过降低H3K9me3和Xist的表达,以期提高克隆效率。研究结果如下:1.水牛成纤维细胞性别对SCNT胚胎发育的影响比较雌雄SCNT胚胎发育潜能和速度的结果显示,SCNT-♀胚胎的囊胚率显着高于SCNT-♂胚胎(P<0.05),与来自于X、Y精子的单精子胞质内注射胚胎(ICSI-X和ICSI-Y)及体外受精(IVF)胚胎相比差异不显着(P>0.05)。此外,SCNT-♀和SCNT-♂胚胎的发育速度快于IVF胚胎,,SCNT-♀、SCNT-♂的8细胞率(48h)和囊胚率(120h)显着高于IVF组(P<0.05)。QRT-PCR检测OCT4、SOX2、NANOG在各类胚胎的表达结果显示:SCNT-♀桑椹胚的OCT4和NANOG以及囊胚期NANOG表达量显着高于SCNT-♂组(P<0.05),而SCNT-♂囊胚期OCT4的表达量显着高于SCNT-♀组(P<0.05),SOX2在SCNT-♀和SCNT-♂的桑椹胚和囊胚的表达差异不显着(P>0.05)。2.雌雄水牛克隆胚胎甲基化差异的研究比较雌雄SCNT胚胎DNA甲基化及其甲基化转移酶和H3K9me2、H3K9me3的表达水平,探讨SCNT胚胎甲基化差异的分子机制。采用免疫组化检测 5mC、5hmC 以及 H3K9me2、H3K9me3 的表达;QRT-PCR 分析 Dnmts和TETs mRNA的表达水平。结果显示:5mC、5hmC分别主要表达于SCNT-♀、SCNT-♂胚胎,且SCNT-♀胚胎甲基化水平低于SCNT-♂胚胎;而DnmtN、Dnmt3a和Dnmt3b在SCNT-♀和ICSI-X早期胚胎的表达差异不显着(P>0.05),但在SCNT-♂和ICSI-Y早期胚胎的表达差异显着(P<0.05)。TET1高表达于SCNT-♂胚胎;TET2和TET3在早期胚胎低表达。H3K9me2高表达于IVF胚胎;H3K9me3显着高表达于SCNT-♂的8cell期(P<0.05)。3.雌雄克隆胚胎印记基因的甲基化模式及调控研究采用重亚硫酸盐结合PCR法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)检测Xist、H19、IGF2在雌雄克隆胚胎和来自于X、Y精子的IVF-X、IVF-Y胚胎的甲基化状态。结果显示:Xist的甲基化水平在IVF-X、IVF-Y胚胎分别为44.8%和72.3%,在SCNT-♀胚胎甲基化状态类似IVF-X胚胎,但在SCNT-♂胚胎甲基化水平为0%。H19和IGF2在这四组早期胚胎的甲基化水平变化为80%-94%。KDM4B显着降低雌雄SCNT胚胎H3K9me3的表达且提高SCNT-♂胚胎的分裂率、囊胚率和SCNT-♀胚胎的分裂率(P<0.05)。4.雌雄水牛克隆胚胎印记基因的表达和调控QRT-PCR 检测 Xist、H19、IGF2 在 ICSI-X、ICSI-Y、SCNT-♀、♀CNT-♂早期胚胎的表达情况。Xist-shRNA降低SCNT-♀胚胎Xist的表达以期提高克隆胚胎发育潜能。结果发现:Xist高表达于各类胚胎的8cell(P<0.05),在各时期SCNT-♀胚胎的表达高于SCNT-♂胚胎(P<0.05);H19、IGF2高表达于SCNT的2cell和8cell(P<0.05)。Xist-shRNA显着降低SCNT-♀胚胎的Xist的表达及其囊胚率(P<0.05)。5.雌雄克隆水牛印记基因的甲基化和表达情况采用BSP法和QRT-PCR法分别检测印记基因Xist、H19、IGF2在雌雄的存活(♀LI-3,♂LI-3)、死亡克隆水牛(♀S1-3,♂S1-3)和普通水牛(♀N1-3,♂N1-3)耳部的甲基化和表达情况。结果显示:(1)Xist基因甲基化水平在♀L组的与♀N组差异不显着(P>0.05),而♀S组显着低于♀N组(P<0.05);在♂L、♂S和♂N组差异不显着(P>0.05)。(2)H19的甲基化水平在♀L、♀S和♀N以及♂L、♂S和♂N组差异不显着(P>0.05)。IGF2的甲基化水平在♀L、♀S和♀N以及♂L和♂N组差异不显着(P>0.05)。但♂S组显着低于♂L和♂N组(P<0.05)。(3)Xist的表达水平在♀S组显着高于♀L和♀N组(P<0.05),但♂S、♂L和♂N组无显着差异(P>0.05);而H19、IGF2在♀L和♀N以及♂L和♂N组无显着差异(P>0.05),但在♀S和♂S组分别显着高于♀L、♀N以及♂L、♂N组(P<0.05)。上述结果表明:(1)SCNT-♀胚胎的发育潜能高于SCNT-♂胚胎;(2)SCNT-♀胚胎的DNA甲基化水平低于SCNT-♂胚胎,且其Dnmts的转录模式和Xist的甲基化较于SCNT-♂胚胎趋于正常;(3)抑制H3K9me3的表达,促进SCNT胚胎的发育;(4)抑制Xist的表达,促进SCNT-♀胚胎的发育;(5)Xist、H19和IGF2的甲基化和表达水平在存活克隆水牛正常,在死亡克隆水牛低甲基化和高表达。
张辉[10]2015年在《牛胚胎早期发育中DNA甲基化修饰的研究》文中认为在胚胎早期发育过程中,染色体会经历广泛的表观遗传修饰的变化,如DNA去甲基化和重新甲基化,组蛋白的去甲基化和重新甲基化,以及组蛋白去乙酰化和乙酰化等等。胚胎早期发育过程中表观遗传修饰变化异常,会导致胚胎发育异常,甚至引起流产和出生后的异常发育。体细胞核移植(SCNT)可以使高度分化的体细胞重新编程,发育成新的个体,这种技术在农业,生物医药产业和濒危物种保护业拥有巨大的潜力。但是体细胞重编程的不完全导致克隆效率低下,制约着该技术的发展。因此,研究植入前胚胎发育过程中的表观遗传修饰变化对进一步了解胚胎发育机制,提高体外胚胎发育率,提高克隆效率,促进该技术广泛的发展和应用有重要意义。本研究对牛体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎原核时期和植入前发育过程中几个重要的表观修饰进行了检测,对比了体外受精胚胎和核移植胚胎在原核时期和植入前发育过程中的表观遗传修饰的变化;建立了一种简便快捷的将siRNA转入核移植胚胎的电转方式,研究了DNA甲基转移酶1(DNMT1)对牛核移植胚胎体外发育以及表观重编程的影响;还研究了O-GlcNAc糖基化对牛体细胞核移植胚胎体外发育和DNA甲基化重编程的影响。主要研究内容和结果如下:1.利用双重免疫荧光染色技术,对牛体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎原核时期和植入前发育过程中几个重要的表观遗传修饰位点(5-mC,5-hmC,H3K9me2和H3K9me3)进行检测。结果显示,在牛体外受精胚胎原核时期,原核融合前(2hpa-10hpa)雌原核5-mC水平没有显着变化,5-hmC水平逐渐升高,H3K9me3和H3K9me2水平逐渐降低;而雄原核5-mC水平逐步降低,在10hpa达到最低,5-hmC水平逐渐升高,H3K9me3和H3K9me2水平都逐渐降低。原核融合后(16hpa-22hpa)合子的5-mC,5-hmC,H3K9me3和H3K9me2水平都是逐渐升高的。核移植胚胎伪原核的5-mC,H3K9me3和H3K9me2水平具有相似的变化趋势,在2hpa到10hpa逐渐降低,16hpa到22hpa逐渐升高;而5-hmC水平在整个原核时期是逐渐上升的。从2-细胞期到囊胚期,体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎的5-mC,5-hmC和H3K9me3水平变化趋势一致。从2-细胞期到8-细胞期逐渐降低,8-细胞期表达最低,桑葚胚期到囊胚期逐渐升高;体外受精胚胎H3K9me2水平在2-细胞到8-细胞时期较弱,桑葚胚期到囊胚期逐渐升高;而核移植胚胎H3K9me2水平在2-细胞期较弱,从4-细胞期到囊胚期逐渐升高。说明在牛体外受精胚胎和核移植胚胎原核时期开始就存在广泛的表观遗传重编程。2对比牛体外受精胚胎和核移植胚胎在原核时期和植入前发育过程中的表观遗传修饰水平。结果显示在体外受精胚胎和核移植胚胎原核时期22hpa时,核移植胚胎存在异常高的5-mC和H3K9me3水平,而5-hmC和H3K9me2水平异常低。在2-细胞到囊胚期,核移植胚胎5-mC,5-hmC和H3K9me2水平显着高于体外受精胚胎,5-mC水平在2-细胞期到桑葚胚期差异显着,5-hmC水平在2-细胞期到8-细胞期以及囊胚期差异显着,H3K9me2水平在4细胞期到囊胚期差异显着,其他时期差异不显着。核移植胚胎H3K9me3水平在2-细胞到8-细胞时期显着高于体外受精胚胎,桑葚胚期和囊胚期显着低于体外受精胚胎。以上结果说明核移植胚胎存在不同程度的表观遗传修饰的异常,过高的5-mC,5-hmC,H3K9me2水平以及H3K9me3的表达异常都可能导致胚胎发育异常。3.建立了一种简便快捷的将siRNA转入核移植胚胎的电转方式。4.研究了干扰DNMT1对核移植胚胎体外发育和重编程的影响。结果显示将siRNA转入到核移植胚胎后,DNMT1的mRNA水平和蛋白水平发生了显着下降,mRNA水平在2-细胞期到8细胞期差异显着,蛋白水平在4-细胞期和8-细胞期差异显着,其他时期差异不显着。对DNMT1进行干扰后,胚胎4细胞和8-细胞期的5-mC水平显着降低,但是发育率没有显着变化。干扰DNMT1的表达可以在一定程度上改善核移植胚胎异常的DNA甲基化水平,但是对胚胎体外发育率没有显着影响。5.研究了通过DON或PUGNAc处理改变O-GlcNAc糖基化水平对牛体细胞核移植胚胎发育及重编程的影响。结果显示,高浓度或者长时间DON或PUGNAc处理会抑制胚胎发育,导致囊胚率降低。25nM DON处理24h能够显着提高胚胎卵裂率和囊胚率,降低囊胚细胞凋亡率,增加囊胚内细胞团比率,提高胚胎体外发育能力,同时还显着提高核移植胚胎原核时期5-hmC水平和降低5-mC水平,并且DON处理组胚胎在2-细胞到桑葚胚期间的5-mC水平同样发生显着降低,但5-hmC水平则没有显着变化。100nM PUGNAc处理24h对于胚胎体外发育率以及原核时期和2-细胞到囊胚期的5-mC和5-hmC水平都没有显着影响。以上结果说明,糖基化的动态平衡在胚胎发育过程中起重要作用,长时间处理打破了这种平衡,导致胚胎发育率降低。短时间的DON处理能够一定程度上修复核移植胚胎原核时期异常的表观遗传修饰,调节胚胎发育过程中基因表达,促进重编程。
参考文献：
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[3]. 牛体细胞克隆中异常重编程的分析及提高重编程效率的研究[D]. 苏建民. 西北农林科技大学. 2012
[4]. 人类胚胎干细胞X染色体倾斜性失活及印迹、X连锁基因表达状态[D]. 刘维强. 广州医学院. 2009
[5]. 牛早期胚胎发育中JPX影响XIST表达的研究[D]. 何杰. 西北农林科技大学. 2016
[6]. Xist基因调控及对牛SCNT早期胚胎发育的影响[D]. 刘黎明. 内蒙古大学. 2014
[7]. 抑制XIST基因表达对猪克隆胚胎基因表达模式及发育效率的影响[D]. 杨洋. 华南农业大学. 2017
[8]. KDM4D和KDM4E在牛受精胚胎发育和体细胞核移植胚胎重编程过程中的作用研究[D]. 刘鑫. 西北农林科技大学. 2018
[9]. 水牛供体细胞性别对其核移植胚胎发育及印记基因甲基化的影响[D]. 阮子芸. 广西大学. 2017
[10]. 牛胚胎早期发育中DNA甲基化修饰的研究[D]. 张辉. 西北农林科技大学. 2015
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