（1、河北省沧州市人民医院耳鼻喉科，河北，沧州，061000；2、河北省军区沧州干休所，河北，沧州，061000；3、河北医学院第四医院耳鼻喉科，河北，石家庄，050000）
中图分类号：R739.65文献标识码：A
【摘要】目的：研究分析Vav3与EphA2蛋白喉鳞状细胞癌组织中的表达情况，同时研究它们与临床病理参数之间的关系，以及二者表达的相关性。方法：回顾分析2010年1月至2015年01月期间在沧州市人民医院耳鼻咽喉科手术切除的喉组织，其中喉鳞状细胞癌组织和喉部非癌组织各为43和10例。采用免疫组织化学方法检测 Vav3蛋白与EphA2蛋白表达情况。采用SPSS16.0统计软件进行了统计学分析。其中，各组率比较采用了χ2检验及Fisher确切概率法。其相关性的分析应用了Spearman等级相关分析。结果：Vav3蛋白在喉癌组织中阳性表达率为69.76%，EphA2蛋白在喉癌组织中阳性表达率为55.81%。它们表达分别与不同临床分期、T分期及淋巴结转移有统计学意义（p<0.05）,而与性别、年龄、吸烟、分型之间无统计学意义（p>0.05）。结论：Vav3蛋白与EphA2蛋白在喉癌组织中均呈高表达，且两者呈正相关性，它们可能成为新的喉癌细胞标志物和治疗新靶点。
【关键词】喉鳞状细胞癌； Vav3蛋白； EphA2蛋白
前言
喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是人类最常见的头颈部恶性肿瘤之一，它严重威胁着人类的健康。近年来，喉癌发病率呈明显增长趋势。喉癌原发生于声带部位者居多，约占60％[1]。研究喉鳞状细胞癌的发病机制，为我们了解其生物学行为，早期的诊断与治疗提供帮助。Vav家族蛋白是Rho 家族GTPase 鸟嘌呤核苷酸转移因子。Vav3 蛋白是Vav家族蛋白的成员之一，它可通过调节Rho 、EphA2、Rac亚家族等许多因子积极参与维持细胞形态、细胞黏附、血管生成，在调节免疫功能和细胞分化等过程中发挥着重要的作用。Vav3 蛋白与EphA2蛋白的研究，对预测喉癌发展和预后治疗具有深远意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
实验材料来源于2010年1月至2015年1月期间在沧州市人民医院耳鼻咽喉科手术切除的喉组织，其中喉鳞状细胞癌组织和喉部非癌组织各为43和10例。鳞状细胞癌组织为病理诊断所证实。喉部的非癌组织为经病理证实非癌组织。其中喉癌病例男性为32例，女性为11例；年龄范围为45～76岁，中位年龄54岁。高中分化24例，低分化10例。按照2002年UICC TNM分期标准，T1期9例，T2期15例，T3期13例，T4期6例；声门上型18例，声门型25例；淋巴结转移19例，无淋巴结转移24例。
1.3检测指标
所有患者均为初治、未经过放化疗，有完整的临床及病理学资料。病理类型为鳞状细胞癌；肿瘤部位为喉声门及声门上区；未患有其他原发癌或远处转移癌。石蜡组织完整（福尔马林固定及石蜡包埋），大小适当（长径≤2cm，宽>2mm），除外蜡块无可供分析的肿瘤组织标本。
1.4病理学诊断及临床分型标准
本研究过程中，依据美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer, AJCC）2002年公布的喉癌分型方案[2]。本研究为回顾性分析，对患者身体无副损伤。
1.5实验方法
链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶法（SP法）检测43例喉鳞状细胞癌患者组织、10例正常喉组织中VAV3、EphA2的表达情况。
1.5.1 组织标本处理
1.5.1.1 喉组织标本分别取喉鳞状细胞癌癌灶、正常喉组织。其中，正常喉组织取自于喉癌根治术，未被喉鳞状细胞癌侵犯的喉正常组织。
1.5.1.2 首先，将标本固定于4%甲醛溶液中24小时，分别浸泡于梯度乙醇中2h、以及无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各1h。二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ再分别浸泡0.5h 与15min，石蜡Ⅰ与石蜡Ⅱ分别为1h与 2h后，开始进行标本脱水及浸蜡。将制成的喉组织蜡块置于冰箱内进行冷却约15min左右，再进行切片，切片厚度为4μm。将蜡片放置在展片仪水盒内，水温约45℃左右，捞起切片进行编号。而后放入烤箱中60℃烘烤切片30min。将制好的切片应用于常规的病理诊断与免疫组织化学染色。
1.5.2 对照组设计
检测VAV3及EphA2的表达情况均选取PBS代替一抗作阴性对照。
1.5.3结果判定标准
染色细胞内出现棕色颗粒的为阳性表达。2名病理医师在不知病例详细资料的前提下对喉组织病理切片进行阅片。选取每张病理切片至少10个不同的视野在高倍镜下（×400）观察, 以此来判断细胞染色强度与着色率。
1.6 统计学方法
应用SPSS16.0软件进行统计学分析。各组率间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。用Spearman进行相关性分析。以P≤0.05为差异在统计学上有显著性意义，以P≤0.01为差异在统计学上有非常显著性意义。
2.结果
2.1 应用免疫组化法对VAV3蛋白及EphA2蛋白的检测结果
VAV3蛋白的表达以细胞胞膜为主，EphA2蛋白的表达以细胞胞浆为主。以染色细胞出现棕色颗粒判断为阳性。VAV3蛋白在43例喉鳞状细胞癌组织及10例正常喉黏膜组织中阳性率分别为67.76%和10%，两者差异有统计学意义（χ2=11.937, P＝0.001）。EphA2蛋白在43例喉鳞状细胞癌组织及10例正常喉黏膜组织中阳性率分别为55.81%和10%，两者差异有统计学意义（χ2=6.833, P＝0.009）。
2.2 VAV3及EphA2蛋白表达与喉鳞状细胞癌组织病理参数的关系
VAV3蛋白及EphA2蛋白的表达与喉癌的临床分期、T分期及淋巴结转移有关（P<0.05）,而与性别、年龄、吸烟、分型之间无关（P>0.05）。
2.3 VAV3与EphA2的表达的相关性分析
VAV3与EphA2在43例喉鳞状细胞癌原发灶标本中的表达情况作Spearman相关分析, VAV3与EphA2共同表达为阳性为21例，共同表达阴性为10例，在VAV3中表达为阳性，而在EphA2中表达为阴性的为9例，在VAV3中表达为阴性，EphA2中表达为阳性的为3例。统计结果显示二者呈正相关（r=0.434, P=0.004），见表1。
附表：喉鳞状细胞癌组织中VAV3和EphA2表达的关系
3.讨论
喉鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类健康，喉癌原发于声带者居多，约占总数的60%[1]。迄今其病因不十分明确，可能与吸烟、饮酒、病毒感染、空气污染、性激素等因索有关[3]。VAV是鸟嘌呤核苷酸交换因子，在哺乳动物中，VAV蛋白包括VAV1、 VAV2、 VAV3三个成员[4]。目前研究认为VAV3 蛋白由 8个结构域组成，在VAV3 蛋白的结构域中Ac、CH结构域缺失是其完全活化的物质基础[5] 。DH结构域的211或213残基及ZF 结构域上 Cys527 突变时 VAV3会受到抑制甚至失去活性[6] 。PH 结构域可以在细胞核中产生调节作用使VAV3于细胞质移动至细胞膜内表面，使其活化[7] 。经研究，EphA2蛋白参与细胞生长、分化、迁移及细胞内信号传递等过程。其抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，参与了多种肿瘤的发生发展。研究发现EphA2 在卵巢癌膀胱癌乳腺癌均有高表达，在食管癌、结肠癌、宫颈癌[等肿瘤中发现， EphA2蛋白参与了许多肿瘤病理生理发展过程,。它可能参与肿瘤形成、促进肿瘤向恶性型发展,并提示肿瘤的恶性程度及其预后不良。
本研究结果显示，VAV3蛋白在喉鳞状细胞癌及正常喉黏膜组织中阳性率分别为67.76%和10%；EphA2蛋白在喉鳞状细胞癌及正常喉黏膜组织中阳性率分别为55.81%和10%。表明VAV3蛋白和EphA2蛋白在喉癌组织中表达明显升高，说明VAV3蛋白和EphA2蛋白参与喉癌的发生发展过程。Hunter SG 等[8]实验发现，EphA2 受体通过VAV3与肌动蛋白细胞相连接，促进血管增生并促进了肿瘤的生长。当激活EphA2受体后，活化EphA2受体就可以募集VAV3，VAV3中SH2 结构域与EphA2受体上磷酸化的酪氨酸位点相结合，VAV3连接EphA2 受体和肌动蛋白细胞，参与血管的生成并促进肿瘤的生长。本研究结果显示，Ⅱ+Ⅲ期喉鳞癌VAV3和EphA2阳性率高于Ⅰ+Ⅱ期，T3+T4组中VAV3和EphA2阳性率明显高于T1+T2组，有淋巴结转移组VAV3和EphA2阳性率高于无淋巴结转移组。表明这两种蛋白均与临床分期、浸润深度及淋巴结转移有关。目前可推测，VAV3蛋白和EphA2蛋白可能参与喉癌发生、浸润及转移的过程。这些结果为喉鳞状细胞癌的发病机制、治疗及预后提供了新的方向。
参考文献
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论文作者:陈英1, 杨文婧1, 陈永强2,贾国章1, 胡俊兰3
论文发表刊物:《解放军预防医学杂志》2015年第7期供稿
论文发表时间:2016/1/27
标签：蛋白论文; 组织论文; 细胞论文; 病理论文; 统计学论文; 喉癌论文; 淋巴结论文; 《解放军预防医学杂志》2015年第7期供稿论文;