王宏伟[1]2001年在《抗HIV-1单链抗体、重组毒素的制备与功能测定》文中研究指明从分泌抗HIV-1gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞102中，提取出mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR扩增，分别获得抗HIV-1gp120蛋白单克隆抗体的轻、重链可变区基因V_L和V_H。在该基因中加入连接肽基因后，经进一步PCR扩增、组装合成出单链抗体ScFv（single chain antibody）基因，将该基因克隆入pGEM-T载体后，进行了核苷酸序列分析测定。测序结果表明，获得的单克隆抗体轻、重链可变区基因V_L和V_H符合小鼠抗体可变区基因特征，为功能性重排的鼠抗体可变区基因序列，分离得到的单链抗体基因ScFv由重链可变区基因V_H-连接肽基因-轻链可变区V_L基因构成，这种构成模式较V_L-Linker-V_H基因结构具有更强的抗体亲和活性。ScFv基因全长为705bp，其中V_H基因为336bp，编码112个氨基酸，V_L基因全长为324bp，编码108个氨基酸。 将获得的ScFv基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE和白喉毒素DT的受体结合区，制备出重组毒素基因ScFv-PE和DT-ScFv，利用原核表达载体pET28，构建了用于表达抗HIV-1gp120蛋白的单链抗体及重组毒素的原核表达质粒pET28-ScFv、pET28-ScFv-PE、pET28-DT-ScFv，上述质粒转化受体菌BL21（DE3）后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白。其中抗HIV-1 gp120 ScFv的表达量占菌体蛋白总量的51％以上，而重组毒素ScFv-PE和DT-ScFv的表达量分别占菌体蛋白总量的28％和26％左右，叁种表达产物均以包涵体的形式存在，叁种蛋白的包涵体经8M脲变性处理后，分别进行了复性处理，利用Ni-NTA金属螯合层析法对表达产物进行了纯化，叁种目的蛋白的纯度均超过了85％以上。 为了便于对表达的单链抗体及重组毒素进行检测，实验中利用杆状病毒表达载体Bac-to-Bac系统，对中国流行株B亚型HIV-1Gag-Env融合蛋白进行了表达，首先构建了杆状病毒重组表达质粒pfast-GE，该质 博士学位快不 中文自县一粒经转座和加压筛选后，分离出重组杆状病毒基因组穿梭质粒Bacmid，将其转染SN昆虫细胞后，筛选出稳定表达中国流行株HIV上－gpl 20蛋白的重组杆状病毒。利用重组杆状病毒的表达产物，对制备的单链抗体及重组毒素进行检测发现，得到的单链抗体及重组毒素具有良好的抗原结合活性。 为进一步验证重组毒素对靶细胞的杀伤作用，本实验构建了表达中国流行株HIV1 蛋白的真核重组表达质粒pIRgp和pCDgp，该重组质粒转染Hela细胞后，经G418加压筛选，得到稳定表达HIV1gpl20蛋臼的靶细胞株Hela－gp。用此细胞模型对制各的重组毒素进行测试发现，重组毒素ScFvPE对Hela苫p细胞表现出良好的细胞毒性作用，在此基础上，将重组毒素作用于B亚型HIVJ感染的MT4淋巴细胞，证明SCFV－PE可对HIV－l感染的靶细胞起到特异性杀伤破坏作用。 为制备易于纯化的抗HIV1 外膜蛋白的单链抗体，本实验利用分泌型毕赤酵母系统对目的蛋白ScFv进行表达，构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICgSCFV，经电击转化后，用PCR筛选得到了重组阳性酵母菌，该酵母菌经甲醇诱导后，可稳性表达ScFv目的蛋白，表达的ScFv目的蛋白以可溶性形式存在于酵母菌培养基上清中，具有良好的生物学活性，目的蛋白的表达量占培养基上清中总蛋白量的 18％左右。
金洪涛[2]2002年在《抗HIV-1单链抗体基因的表达及重组毒素的构建》文中认为抗体在诊断和治疗领域日益受到人们的重视，随着基因工程技术的发展，小分子抗体如单链抗体(ScFv)等也走到了免疫和治疗的前台，尤其是在导向药物领域占据着无可比拟的优势。为了获得针对HIV的无毒副作用的，能根除体内病毒的药物，进行了单链抗体和重组免疫毒素的表达，期望其针对HIV病毒以及感染细胞的特异杀伤作用可以最终实现抗病毒这一治疗目的。 为获得分泌表达的直接具有活性的单链抗体，检测抗HIV-1单链抗体的抗原识别活性，并探讨HIV Env糖蛋白的毕赤酵母真核表达，将ScFv基因从质粒pET28-ScFv中用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ切下克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点上，筛选得到重组转化质粒pPIC9-ScFv；以携带有HIV-1 NL-43 Env的质粒pJen10为模板，PCR扩增gp41全基因。然后EcoRI酶切连入pHIL-S1质粒。重组酵母转化质粒电击转化毕赤酵母GS115后，筛选阳性整合菌株，甲醇诱导重组菌的表达。结果分泌的ScFv具有抗原结合活性，gp41蛋白也获得了表达。 在此基础上，PCR融合构建了以抗HIV-1外膜糖蛋白gp120的单链抗体(ScFv)取代DT毒素受体结合区的重组免疫毒素，在DT和ScFv之间引入一柔性蛋白连接肽序列ASGCPE，经pET系统在大肠杆菌中获得了表达，融合蛋白可部分以可溶性蛋白的形式存在。
于芳[3]2006年在《抗HIV-1单链抗体重组白喉毒素的构建与表达研究》文中研究表明重组免疫毒素被称为“生物导弹”，是目前肿瘤、自身免疫性疾病以及移植排斥等免疫治疗领域的热点研究方向之一。对于AIDS而言，由于免疫毒素能够特异性的杀伤HIV潜伏感染细胞，彻底摧毁病毒储存池，而对正常细胞毒性很低，从而成为当前HAART辅助治疗的亮点。 为了获得针对HIV-1的无毒副作用且能根除体内病毒的药物，进行了重组免疫毒素的表达，期望其针对HIV病毒和感染细胞的特异杀伤作用可以最终实现抗病毒这一治疗目的。 将获得的单链抗体(ScFv)基因分别代替白喉毒素DT的受体结合区以及白喉毒素DT的受体结合区和跨膜区，制备出重组毒素基因DT-ScFv，利用原核表达载体pET28a，构建了用于表达重组毒素的原核表达质粒pET-DT-hS120、pET-DTA-hS120，上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白，表达量分别为21％，23％，并利用Ni-NTA金属螯合层析法对表达产物进行了纯化及复性处理。
于芳, 金宁一, 李昌, 刘玉生, 佟敬山[4]2007年在《抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达》文中认为目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定。结果酶切及DNA序列测定鉴定正确。SDS-PAGE和West-ern Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75200的蛋白,与DT-hs120融合基因分子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体。结论成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达。
徐辞[5]2008年在《抗猪囊尾蚴特异性单链抗体基因的克隆与序列分析》文中研究说明猪囊尾蚴病是猪肉绦虫的幼虫(猪囊尾蚴)寄生于猪的肌肉和其他器官中所引起的一种寄生虫病,又称猪囊虫病。是一种散发性、传染性寄生虫病。本病呈世界性分布,在我国各地均有散发流行,尤其是东北、华北和西南广大地区常有发生,不仅影响养猪业发展,而且严重危害人体健康,是一种重要的人、畜共患病。目前治疗本病除了化学药物以外还没有生物制剂应用。近年来随着分子生物学、生物化学、免疫学的发展,实验方法的不断完善,很多研究者正在试图研制生物制剂。而单链抗体(ScFv)和免疫毒素的应用,对治疗猪囊虫病提供了更快捷、更彻底的方向。单链抗体(ScFv)由抗体重(Vh)、轻(V1)链可变区通过与一段约5～25个氨基酸连接肽,一般为(Gly4Ser)3,拼接而成的重组蛋白。与完整抗体相比,单链抗体具有更大的优越性,它在非靶向组织中滞留时间短、血清清除速度快、组织穿透力强、其特异性可以在体外用免疫学方法筛选等优点。更重要的是ScFv能在细菌中表达,便于基因操作和基因工程大量生产,还可用基因工程的方法构建与其它效应分子连接的融合蛋白,因此ScFv可成为药物、毒素、放射性物质等导向靶细胞的理想载体。重迭延伸PCR(SOE PCR)技术是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重迭链,从而在随后的扩增反应中通过重迭链的延伸,将不同来源的扩增片段重迭拼接起来。此PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。本实验先对猪囊尾蚴头节特异性单链抗体轻链可变区基因(V1)和重链可变区基因(Vh)进行酶切鉴定和PCR鉴定,电泳结果显示,在330bp和370bp左右出现目的条带,与预期结果相符。序列分析结果显示出较高同源性,其中重链的同源性高达94%,轻链的同源性高达为96%。然后采用重迭延伸PCR(SOE PCR)技术,经过多次实验摸索反应条件,变性温度定义在94℃,40s,在第一轮PCR时,Tm值定义为58℃为最佳;在第二轮PCR时,Tm值定义为52℃为最佳。并且每一轮的循环数定义在25次。将猪囊尾蚴头节特异性单链抗体轻链可变区基因(Vl)和重链可变区基因(Vh),通过linker连接成目的基因Vl-inker-Vh单链抗体基因,酶切鉴定和PCR鉴定结果显示,在750bp左右出现目的条带,与预期结果相符,并将连接产物连接到pMD—18T载体,转化感受态细胞JM109。本实验为以后进行单链抗体ScFv—PE40重组免疫毒素的构建、在大肠杆菌中的表达及活性的测定奠定良好的基础。
温伟红[6]2003年在《人抗HBsAg单链抗体基因的构建、表达及其表达产物的活性鉴定》文中提出目的 构建人抗HBsAg单链抗体基因，在真核细胞和原核细胞中进行表达，并对其表达产物的活性进行鉴定。 方法 以从噬菌体抗体库中筛选获得的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增出其轻、重链可变区(V_L、V_H)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly_4Ser)_3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L-V_H-Linker-V_L结构的单链抗体基因。 将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N3，瞬时转染COS-7细胞，分析其表达情况。稳定转染Jurkat细胞，建立稳定表达ScFv融合蛋白的细胞系，并分析其表达产物的活性。 将获得的不含前导肽的单链抗体基因克隆入HA和6His融合的原核表达载体pTAT-HA，在大肠杆菌BL21中进行表达，分析其表达情况。表达产物并经NiNTA柱纯化后，分析其活性。 结果 经测序表明，前导肽、连接肽、V。及V。的序列正确，经酶切鉴定证实成功地构建了绿色荧光蛋白基因融合表达载体。瞬时转染COS刁细胞后，通过荧光显微镜观察、间接免疫荧光检测、免疫组化检测证实了SCFV融合蛋白的表达。稳定转染 Jurkat细胞，经 G4筛选，建立了稳定表达 ScFv融合蛋白的细胞系。建系细胞裂解产物和浓缩的培养上清经SDS－PAGE及Western Blot分析，证实了ScFv融合蛋白的分泌性表达。间接ELISA检测证实所表达的单链抗体具有与HBSAg结合的特异性。建系细胞培养上清与肝癌细胞作用后，经荧光显微镜观察、间接免疫荧光及流式细胞仪检测进一步确定表达的SCFV融合蛋白具有与HBSAg特异性结合的活性。 经酶切鉴定证实原核表达载体pTAT爿ASCFV构建成功。在大肠杆菌BLZI中实现了 SCFV融合蛋白的表达。经 Ni－NTA柱纯化获得纯化产物，经间接ELISA分析确定所得产物具有与HBSAg结合的特异性。与肝癌细胞作用后，通过间接免疫荧光检测、免疫组化捡测进一步确定所获得的纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。 结论 门）成功地构建了五种人抗HBSAg单链抗体基因。Q）瞬时转染COS7细胞，获得了分泌性表达。稳定转染Jurkat细胞，经筛选获得稳定表达SCFV融合蛋白的细胞系，并证实表达产物具有与HBSAg特异性结合的功能。（3）在大肠杆菌 BLZI中进行表达，经 Ni－NTA柱纯化获得了纯化产物，并证实纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。
王颖[7]2008年在《同步筛检叁种残留药物的快速检测方法的探索性研究》文中进行了进一步梳理药物残留一直是食品安全领域的热点问题,不同种类不同程度的残留药物可通过环境和食物链对机体产生多种直接和间接危害。而实际检测方法中的样品单一性、操作的繁琐性和设备与成本的昂贵性等缺点,使得对能广谱特异、低耗高效和灵敏便捷地同步筛检方法的需要显得尤为迫切。基于此,本研究开展的主要目的为最终利用一种融合抗体同时与相关的叁种残留药物发生免疫学反应,所建立的方法也能同时筛检叁种药物。本实验具体分为一个基础和两个研究展开方向。基础为氯霉素和磺胺二甲嘧啶(CAP和SM_2)单克隆抗体的制备,并对纯化的抗体进行六个方面的特性鉴定。首先,从分子水平探讨,分别克隆、组装、串联和表达了CAP、SM_2和环丙沙星(CPFX)单链抗体及串联后的融合抗体,并对单链抗体的二级结构进行预测。然后,从免疫学角度出发,利用CAP和SM_2纯化后的单克隆抗体,分别建立直接和间接竞争ELISA方法,获得标准曲线后比较两类检测方法,对同一样品实样检测均具有较好的相关性;同时利用胶体金试纸初步组装了氯霉素金标检测试纸。利用建立的优化ELISA条件分别检测纯化后的叁种单链抗体和融合抗体,并平行比较相对应的单克隆抗体、单链抗体和融合抗体。结果显示:利用融合单链抗体同步筛检叁种药物的方式可行。
马颖[8]2006年在《抗肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Ⅱ基因工程抗体的实验研究》文中研究表明肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7是一种重要的新发人畜共患传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的近30年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis , HC) ,还可在5~10%的病例中引发溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。EHEC O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。同时,O157:H7菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛,使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。美国疾病预防控制中心(CDC)已将EHEC O157:H7菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。目前,EHEC O157:H7的全基因组测序已经完成,但对其感染仍缺乏有效的治疗方法。临床上针对O157:H7菌的感染主要采用抗生素治疗及相应的对症治疗。新近的研究发现,抗生素使菌体破裂,导致O157:H7菌志贺样毒素(Shiga like toxin,Stx)的释放水平大大提高,使得抗生素对病程无明显影响甚至导致病程的延长,从而增加发生并发症的危险并引起死亡。人类同感染性疾病作斗争的历史证明,抗体是治疗某些感染性疾病的首选方法。由于O157:H7菌的感染易引起暴发流行,且对其感染尚缺乏有效的治疗方法,治疗性抗体的研究就显得尤为紧迫。EHEC O157:H7主要产生两种毒素,分别称为志贺样毒素Ⅰ(Stx1)和志贺样毒素Ⅱ(Stx2)。在细菌体内,Stx2为分泌型表达,Stx1为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成,A亚单位具有细胞内毒性,能与28S rRNA作用从而抑制蛋白质合成,是大肠杆菌O157:H7引起临床表现的病理基础;B亚单位具有细胞结合特性,能与具有特定糖鞘脂受体(Gb3)的细胞结合,从而引导A亚单位发挥作用,是志贺样毒素致病的关键。多数O157:H7细菌产生Stx2,而且Stx2毒性强于Stx1,与HUS及TTP等严重并发症的相关性更为密切。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基础,是理想的制备
陈云雨[9]2009年在《人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究》文中认为细胞间黏附分子-1(ICAM-1)作为淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)的配体可介导白细胞与血管内皮细胞的黏附及白细胞穿出血管壁,同时促使更多中性粒细胞和嗜酸性粒细胞转移至炎症区,释放更多的氧化自由基、蛋白酶和花生四烯酸等代谢产物,加重组织损伤程度,进而造成病理损伤,在炎症性疾病的发生与发展过程中发挥重要作用,ICAM-1成为炎症相关性疾病治疗新的靶点。本研究旨在利用噬菌体展示技术应用Tomlinson I+J噬菌体抗体库制备人源抗ICAM-1单链抗体,并对工程菌进行表达条件优化、目的蛋白纯化工艺研究及生物学活性研究。人血管内皮细胞-单核细胞黏附抑制实验表明,制备的人源抗ICAM-1单链抗体能够有效抑制血管内皮细胞与单核细胞之间的黏附,对炎症性病理反应有较强的抑制作用,本课题研究为临床炎症相关性疾病的初步治疗奠定基础。
张颖[10]2008年在《生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究》文中研究说明噬菌体抗体库技术是继单克隆抗体制备技术后具有换代地位的抗体制备技术,在功能蛋白的表达、疾病诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。生长抑素(SS)是由下丘脑分泌的一种神经多肽,通过抑制生长激素释放而抑制动物生长和泌乳,是重要的内分泌激素。因此,建立SS免疫测定方法和免疫芯片技术对于研究动物生长和泌乳调控机制、开发促进动物生长发育和泌乳的新技术等,均具有重要意义。迄今,国内外关于小分子单链抗体的研究鲜见报道,至今无应用噬菌体展示技术筛选生长抑素单链重组抗体的报道。本研究取健康BALB/C小鼠脾脏和用偶联牛血清白蛋白的SS免疫小鼠脾脏,分别提取总RNA,扩增抗体轻链和重链可变区基因,组装成单链抗体基因。借助噬菌体展示技术,平行建立天然和免疫鼠源单链抗体库。主要结果如下:1.人工抗原的合成及免疫:将设计合成的生长抑素利用碳化二亚胺法与BSA偶联,制备人工抗原,免疫BalB/C小鼠,其抗血清效价最高可达1:2560。2.抗体可变区基因的获得及目的基因构建:分别取未免疫的和抗血清效价较高的小鼠脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增得到抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因,大小分别为360bp和340bp左右;纯化回收的V_H与V_L基因在接近等摩尔浓度下连接。在免疫库构建中采用含有Linker接头片段的引物,利用重迭延伸PCR法(SOE-PCR)将V_H与V_L基因片段拼接起来,再用带有限制性内切酶位点的引物扩增出单链抗体(ScFv)基因片段;在天然库构建中采用不对称PCR连接单链抗体(ScFv)基因片段,分别获得大小约750bp的目的片段。结果表明,不对称PCR连接方法的效率高于传统的组装方法。3.ScFv噬菌体抗体库构建:ScFv基因纯化后经SfiI和NotI双酶切,与同样经过双酶切的载体pCANTAB5E连接,电穿孔法转化大肠杆菌TG1感受态细胞,提取质粒,经PCR初步鉴定证明有外源片段插入且与目的片段一致。转化菌经辅助噬菌体M13K07超感染后,收集上清,得到噬菌体抗体库。天然库的构建中,经过40次电击,获得了9.8×10~7抗体库,相对于免疫抗体库的3条片段SOE连接法,5次电击获得的9.3×10~7抗体库,后者的效率要高的多。可以看出,免疫抗体库构建的工作量远远低于天然库。该抗体库的建立,为进一步筛选和表达抗体、建立生长抑素放射免疫测定、酶免疫测定、免疫组化分析和免疫芯片等技术奠定了基础。
参考文献：
[1]. 抗HIV-1单链抗体、重组毒素的制备与功能测定[D]. 王宏伟. 中国人民解放军军需大学. 2001
[2]. 抗HIV-1单链抗体基因的表达及重组毒素的构建[D]. 金洪涛. 中国人民解放军军需大学. 2002
[3]. 抗HIV-1单链抗体重组白喉毒素的构建与表达研究[D]. 于芳. 长春理工大学. 2006
[4]. 抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达[J]. 于芳, 金宁一, 李昌, 刘玉生, 佟敬山. 免疫学杂志. 2007
[5]. 抗猪囊尾蚴特异性单链抗体基因的克隆与序列分析[D]. 徐辞. 吉林农业大学. 2008
[6]. 人抗HBsAg单链抗体基因的构建、表达及其表达产物的活性鉴定[D]. 温伟红. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[7]. 同步筛检叁种残留药物的快速检测方法的探索性研究[D]. 王颖. 吉林大学. 2008
[8]. 抗肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Ⅱ基因工程抗体的实验研究[D]. 马颖. 第叁军医大学. 2006
[9]. 人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究[D]. 陈云雨. 吉林大学. 2009
[10]. 生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究[D]. 张颖. 华中农业大学. 2008
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