于黎[1]2002年在《熊科物种的分子系统发育研究》文中提出熊科动物是现代生存的陆生食肉目动物中体形最大者。熊科动物在全球分布有7种，它们被划为2～7个属。迄今为止，熊科的系统发育关系和其物种的分类划分还仍然存在着很多争议。主要的原因就在于熊科物种的分化间隔时间相对较短，是一个快速的进化辐射和物种形成事件。本文测定了所有现生熊科物种和大熊猫共8个样本的核内两个单拷贝基因的部分序列，即光间受体视黄类物质结合蛋白（IRBP）基因第一外显子序列（1280bp）和甲状腺素转运蛋白（TTR）基因第一内含子序列（1007bp），希望能从核基因的角度探讨熊类的系统发育关系。我们的结果与前人基于线粒体基因提出的系统发育关系假设有所差异。以大熊猫( A.melanoleuca)作为外群进行系统发育分析的结果表明：眼镜熊( T.ornatus )是分化最早的熊科物种。棕熊( U.arctos )和北极熊( U.maritimus )作为分化最晚的熊科物种不仅聚为姐妹群，而且与亚洲黑熊( U.thibetanus )和美洲黑熊( U.americanus )的关系较近。合并数据集的系统发育分析表明棕熊和北极熊与美洲黑熊的关系最近，而不是亚洲黑熊，但是支持率不高。用TTR内含子数据和合并数据集分别构建的系统发育树中，懒熊( Ursus ursinus )和马来熊( Ursus malayanus )形成一个支持率非常高的姐妹群。我们认为眼镜熊仍然单独归为一个属Tremarctos，而其余所有的熊科物种都归为Ursus属。相比较而言，TTR内含子序列更适于作为解决近缘物种，如熊科物种，系统发育问题的标记。
于黎, 李庆伟, Oliver, A.Ryder, 张亚平[2]2003年在《熊科物种的系统发育研究》文中指出熊科动物是现生的陆生食肉目动物中体形最大者。熊科动物在全球分布有7种,它们被划为2～7个属。迄今为止,熊科的系统发育关系和其物种的分类划分仍然存在着很多争议。主要的原因就在于熊科物种的分化间隔时间相对较短,是一个快速的进化辐射和物种形成事件。以前的研究主要利用线粒体不同基因片段作为分子标记来重建熊科物种的进化历史,但是熊科物种之间的进化关系却因不同作者选取的线粒体片段、分析方法等方面各不相同,其结果也表现出明显的差异。因此,许多学者认为应该挖掘新的不同遗传特征的分子标记,以解决熊科物种进化方面的争议。鉴于此,我们探讨用核基因序列数据研究熊科分类和系统演化中长期悬而未决的疑难问题。
于黎, 张亚平[3]2006年在《食肉目哺乳动物的系统发育学研究概述》文中研究说明追溯生物界不同生物类型的起源及进化关系,即重建生物类群的系统发育树是进化生物学领域中一个十分重要的内容。食肉目哺乳动物位于食物链顶端,很多成员不仅在我国野生动物保护工作中占有重要地位,而且还是研究动物适应性进化遗传机制的重要模式生物。因而,食肉目物种作为物种资源中的一个重要类群,其系统发育学一直是国内外研究的热门课题。构建可靠的食肉目分子系统树,无疑将具有重要的进化理论意义和保护生物学价值。鉴于目前食肉目各科间系统发育关系仍然处于“广泛争论”的状态,本文将针对食肉目科水平上的系统发育学研究进展,包括来自于形态学特征、细胞学及分子生物学方面的证据,做简要概述,并提出目前研究中存在的问题。这对今后食肉目系统发育方面的进一步研究工作具有指导意义,并为以该类群作为模式生物开展适应性进化研究奠定基础。
侯新东[4]2014年在《我国华南地区大熊猫系统演化与遗传多样性的古DNA研究》文中指出生命的起源与演化问题在自然科学领域一直备受关注,古生物学家、进化生物学家依据发现的动植物化石或亚化石遗体或遗迹,来探寻它们的演化与灭绝的原因。但是,由于化石记录的不完整,建立在比较解剖学和形态分类学基础上的传统化石分析方法在研究中越来越难以解决生物演化方面的问题。通过现代分子生物学技术对古生物遗体或遗迹中古DNA的研究,为揭示古生物演化提供了有力的分子生物学证据,同时在研究对象和研究方法方面也拓宽了传统古生物学研究的领域。大熊猫是我国特有的珍稀濒危物种,地质历史时期中大熊猫在我国分布广泛,更新世中晚期大熊猫的分布达到全盛期,广泛分布于我国长江流域、珠江流域以及华北部分地区,最北界达40°N(周口店第一化石点),向南则延伸至越南、老挝、缅甸部分地区,向东抵达东南沿海地区,第四纪末次冰期大熊猫的分布范围也开始缩小。目前由于气候的变化和人类活动的影响,大熊猫分布目前仅限于陕西西南的秦岭南麓,四川盆地西北缘的岷山和邛莱山、西缘的大、小相岭及凉山。大熊猫的分类问题一直以来都是人们争论的热点,80年代以前其争论形成叁派学说——熊科、浣熊科、大熊猫科(独立一科)。Mivart通过研究大熊猫的颅骨结构、四肢骨、牙齿、足型、肾、毛的触感、内脏以及一些化石,还有对进化有重要意义的第四上前臼齿,凭借大熊猫与浣熊类动物在颅骨结构、牙齿、内脏等方面具有的相似性,尤其是裂齿(P4)的齿冠冠型,他认为大熊猫应该属于浣熊科。1964年Davis发表了《大熊猫形态学与进化机理研究》的专着,他根据大熊猫50个器官系统比较研究的结果,断言“大熊猫每一个形态特征都表明它们仅仅是一种高度特化的熊,故可把它放在熊科,或对它的差异给予足够的承认,也可独立一科”。从这开始对大熊猫的分类地位逐渐形成两派——熊科、大熊猫科。林峰等采用PCR和Southern杂交等方法对大熊猫、小熊猫、马来熊、浣熊等共有的1条113kb的RAPD产物片段进行初步分析,发现马来熊产物则无相应的杂交带,认为这种结果暗示了大熊猫与熊科马来熊的亲缘关系要近于小熊猫和浣熊,主张将大熊猫划为熊科。用线粒体Cyt b、12S rRNA基因全序列和全基因组构建的系统发育树中可看出,大熊猫与熊类均在同一分枝上。对于分子生物学上本认为支持归属为熊科的证据,张亚平等重新解读为大熊猫与熊类在DNA序列上的相似性并不能作为大熊猫应归入熊科的有力证据,而且如果将细胞色素b的部分序列翻译成氨基酸序列,结果显示大熊猫与小熊猫更接近,因此正如黑猩猩与人类DNA序列有98%的相似性却不能归入人科一样,大熊猫也应该单独成为一科。近年来,随着大熊猫祖先化石的不断发现,学者们得出在中新世晚期大熊猫类与熊的祖先就已经出现平行发展,相互间有亲缘关系,但形态特征与熊科物种存在一定的差异,主张将大熊猫单独分为一科即大熊猫科。早期的研究认为,大熊猫的遗传多样性下降得较为明显。潘文石通过分析秦岭大熊猫种群,研究其遗传压力,得出该种群每代将以0.5456%近交率丧失遗传多样性。李杨文等、宿兵等用蛋白质电泳技术,分别对不同地区大熊猫进行血液同工酶及血浆蛋白比较研究,得出大熊猫种群的物种多样性贫乏的结论。张亚平等测定大熊猫线粒体tRNA基因和D环区序列,在21个实验样品中共检测出9种单倍型,分析得出大熊猫的遗传分化程度很低。方盛国等利用DNA指纹技术研究大熊猫种群的遗传多样性,认为5大山系的群体遗传多样性严重贫乏,山系之间存在明显的遗传分化。近期的研究表明,现生大熊猫的遗传多样性仍然保持中等或者更高的水平。Lu等研究岷山、邛崃及秦岭大熊猫种群的线粒体DNA控制区基因序列,从36个大熊猫个体中检测出17种单倍型,这些单倍型与大熊猫的地理分布并没有明显的相关性,通过限制性内切酶和微卫星序列探针进行分析,认为大熊猫的遗传多样性处于中等水平。Zhang等利用线粒体控制区序列和10个微卫星位点,分析了5个山系大熊猫种群的遗传多样性,通过与其他熊类进行比较,得出现存的大熊猫种群有高水平的控制区及微卫星位点多样性,大熊猫并没有处于进化的尽头。Li等通过大熊猫全基因组的测序,发现大熊猫种群仍然存在较高的遗传多态性。Hu等通过研究线粒体控制区序列,探讨了凉山地区大熊猫种群的遗传多样性,得出该地区的大熊猫遗传多样性处于中等水平。本研究采用硅粒-GuSCN法对采集于云南腾冲、广西田东、湖南桑植和云南镇雄的5个大熊猫样品(编号分别为05001,97001,GXPB,HNSZ,14162)中的古DNA进行提取,通过多重PCR方法进行扩增。最终GXPB,HNSZ,14162这3个样品未获得可靠的古DNA序列,采自云南腾冲的97001和05001的两个样品扩增获得了古DNA序列。用分子生物学方法研究了97001和05001样品线粒体中的Cyt b.12s rRNA、16s rRNA、ND1和D-Loop基因,结合GenBank中的同源序列,构建了熊科物种与大熊猫的系统发育树,利用D-loop的序列探讨了大熊猫的遗传多样性。主要得到以下几点结论：1.获得距今8740±45年的97001样品和距今5025±35年的05001样品中的古DNA。97001获得的线粒体DNA序列长度为5025bp,05001获得的DNA序列长度为5142bp。证明了硅粒-GuSCN-蛋白酶K法提取和多重PCR扩增等方法用于华南地区近万年样品古DNA实验是可行的,也说明了在高温潮湿的华南地区保存的近万年的化石样品中能够得到古DNA。2.经14对引物扩增得到Cyt b基因1140bp全序列。两条序列的碱基A、T、G、C平均含量分别为：29.3%,31.3%,14.2%,25.2%,其中A+T的含量为60.7%,G+C的含量为39.3%。通过分析大熊猫、棕熊、北极熊、太阳熊、懒熊、亚洲黑熊、美洲黑熊、眼镜熊、小熊猫和浣熊序列,得出Cytb序列的转换/颠换为4.2,进行饱和度分析后,得出序列的碱基的转换和颠换没有达到饱和。计算了两两序列间的遗传距离,得出大熊猫和熊科物种的遗传距离最小,与小熊猫和浣熊的遗传距离较大。经15对引物扩增得到12s rRNA基因966bp全序列。两个序列碱基的平均含量为：A,35.4%；T,24.6%；G,18.4%；C,21.6%。其中A+T含量为60.0%高于C+G含量40%。分析了大熊猫与现生的7种熊科动物、大熊猫、小熊猫及浣熊的碱基序列差异,转换/颠换为3.6,进行饱和度分析后,得出序列没有达到饱和。计算了两两序列间的遗传距离,得出大熊猫和熊科物种的序列差异和遗传距离最小。经13对引物扩增得到D-Loop基因部分序列(932bp),其中683bp为连续片段,碱基A、T、G、C平均含量分别为：28.8%,30.2%,15.7%,25.3%,A+T平均含量(59.1%)显着高于G+C的平均含量(40.9%)。分析了序列间的差异,碱基转换/颠换为0.9,饱和度分析显示,得出序列即将达到饱和,计算了两两序列间的遗传距离,结果显示大熊猫和熊科物种的平均遗传距离要小于与小熊猫。经15对引物扩增,97001得到16s rRNA基因部分序列(1064bp),05001得到16s rRNA基因部分序列(1181bp),从序列差异和遗传距离结果来看,转换/颠换为3.0,大熊猫与熊科动物的差异较小,遗传距离较近。经10对引物扩增得到ND1基因序列的长为923bp,其中830bp为连续片段,碱基A+T含量(61.5%)明显高于G+C含量(38.5%)。将其与同源序列进行比对分析,显示碱基转换/颠换为4.4,进行饱和度分析后,得出序列没有达到饱和。计算了两两序列间的遗传距离,得出大熊猫和熊科中眼镜熊的遗传距离最小。5个基因得出的序列差异和遗传距离有差别,可能是跟基因的保守程度有关。3.得到的古DNA序列是可靠的。古DNA提取,PCR混合液的配制以及克隆均在独立的实验室进行。在实验过程中,严格按照古DNA的实验要求进行操作,从提取、PCR扩增和分子克隆都设立了相应的对照实验以监控污染情况。对每一个样品的每一对引物基本上都经过了两次以上的扩增、克隆和测序以确定序列的原生性。对所得的序列进行GenBank的Blast搜索,得出序列与现生大熊猫的相似性最高。本研究中古DNA序列进行了多次重复性实验的验证,在本实验室由不同的研究者进行操作,并在澳大利亚阿德莱德大学古DNA研究中心进行了重复性实验,所得到的序列与在中国地质大学(武汉)实验所得的序列是一致的。综上所述,本研究所得的古DNA数据是可靠的。4.基于Cyt b基因全序列、12s rRNA基因全序列、16s rRNA基因部分、ND1部分序列和D-Loop基因部分序列用MEGA软件与同源序列进行比对,同时也选择了Cyt b+12s rRNA、Cyt b+D-loop、Cyt b+12s rRNA+D-Loop、Cyt b+12s rRNA+16s rRNA+ND1和Cytb+12s rRNA+16s rRNA+ND1+D-loop组合序列分别用邻位法(NJ)、最大简约法(MP)和最小进化法(ME)构建系统发育树,其中由Cyt b、16s rRNA、ND1和Cyt b+12s rRNA+16s rRNA+ND1序列构建的系统发育树拓扑结构是完全一致的,只是分支上的自展支持率的数值略有差别。由12s rRNA、D-Loop单序列和组合序列所构建的系统发育树在拓扑结构上不完全一致,但有相同之处,棕熊、北极熊、大熊猫、小熊猫及浣熊所处的位置在所构建的所有系统发育树上都是一样的,只是自展值略有差别。从所有构树的结果来看,D-loop基因序列参与构建的系统树在拓扑结构上与其它序列所构建的系统树有较为明显的差别,因此,本研究认为D-loop序列不适合用来构建系统分析探讨大熊猫的系统演化关系。利用物种的双个体的同源序列构建系统发育树,结果表明,物种单个体用来构建系统发育树是可行的,排除了系统进化树上的物种单个体效应。在系统发育分析中,加入本研究所得的古DNA序列,提高了系统发育树的精度,使得熊科物种、大熊猫、小熊猫和浣熊之间的亲缘关系得到了进一步明确：浣熊最先分离,其次是小熊猫,大熊猫较晚分离,大熊猫和熊科物种有较近的亲缘关系。5.用PAML软件的mcmctree程序基于Cyt b+12s rRNA+16s rRNA+ND1序列的组合数据构建的系统发育树,计算了物种间的分歧时间。小熊猫和大熊猫的分歧时间为17.12Ma,大熊猫和熊科其他物种的分歧时间为12.68Ma。据化石记录得出的大熊猫和熊科物种的分歧时间为12Ma,与本研究算出的分歧时间相近。通过对构建的系统发育树和物种分歧时间进行分析,本研究认为大熊猫很早就与熊科动物中分化出来,进行了独立的进化与演化,支持把大熊猫划为独立的一科即大熊猫科。6.基于所获得的两个古代大熊猫655bp线粒体D-loop序列,与从GenBank获得的40个现生大熊猫的同源序列,用MEGA软件对42个序列进行Clustal W比对后,将数据导入DnaSP5.0进行分析,结果表明,42个序列组成上都不一样,分别属于42个大熊猫单倍型。根据655bp同源序列的碱基变化以及单倍型在不同地区的分布情况,利用Network4610软件构建了42种大熊猫单倍型的简约网络图,通过DNASTAR软件构建了42种大熊猫单倍型的系统发育树。结果表明,大熊猫的单倍型的多样性还是非常丰富的,并且在不同地区存在多种共享基因单倍型,说明在不同地区分布的大熊猫之间存在广泛的基因交流,使这个物种在遗传上始终保持着多样性。在5000年以前云南所分布的大熊猫古老的单倍型已经通过基因交流得以扩散到秦岭,邛崃山,凉山和岷山等地区。利用BEAST1.7.4程序进行Bayesian skyline plot(BSP)评估了过去8700多年来大熊猫的有效群体变化,结果显示,大熊猫的种群数量是在距今5000多年前开始下降的,现在其种群数量趋于稳定,现阶段可以通过加大建造各大熊猫栖息地之间的“绿色走廊”,增加种群之间的互相沟通,提高种群杂合率,来丰富其遗传多样性。
鲁再丰[5]2010年在《熊科物种DNA编码与系统发育关系研究》文中进行了进一步梳理随着分子生物学的发展,传统分类学打破了久已停滞不前的困境,开始迈入分子水平。2003年DNA条码概念首次提出,至今DNA编码已经被证明是一个行之有效的生物鉴定手段。它将对保护生物学、生物多样性研究的发展起着重要的作用,在解决鉴定问题的同时,也会给构建系统发育树提供足够可靠的“树叶”,从而推进生物进化历史的研究。熊科属于脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、食肉目。熊科的分化间隔时间相对较短,是一个快速的进化辐射和物种形成事件,其物种的发育关系一直存在着争议。由于人为的捕杀和物种栖息地的破坏,熊科动物的数量急剧减少,其物种均被列为国家级濒危保护物种。为了解决熊科物种系统发育关系及其进化和分类,同时为打击犯罪,保护和管理熊科物种提供技术支撑。本文使用DNA编码技术对熊科动物进行编码,并结合12SrRNA和Cytb基因构建系统发育树。本研究获得了32条亚洲黑熊的COI序列,5条亚洲黑熊和棕熊的Cytb序列,5条亚洲黑熊和棕熊的12SrRNA序列。分析得出熊科物种COI、12SrRNA和Cytb叁种线粒体基因,其碱基组成存在偏倚性,A+T含量要高于G+C。熊科物种发育关系研究得出,支持棕熊和北极熊是姐妹群关系,美洲黑熊与棕熊和北极熊关系较近与亚洲黑熊关系较远；支持亚洲黑熊应独立分为亚洲黑熊属Selenarctos,不属于熊属Ursus,棕熊、北极熊和美洲黑熊归于熊属Ursus;马来熊与美洲黑熊关系较近与懒熊关系较远,懒熊比马来熊分化要早；大熊猫和眼镜熊是熊科分化较早的物种；小熊猫不属于熊科。支持马熊是棕熊的一个亚种,不支持将其单独划分成种。对于物种水平的研究,COI基因构建的系统发育树与合并数据集得到的结果有较高的一致性；对亚种水平的研究,COI基因作为DNA条形码比12SrRNA基因和Cytb基因更为有效。对于COI基因、12SrRNA基因和Cytb基因,棕熊和北极熊种内序列分歧与种间序列分歧差异很小,在进行棕熊和北极熊的物种鉴定时,靠单独的序列差异和建树方法略显不足,需要再结合其它分析方法加以判定。
何光志[6]2009年在《八种野生动物蛔虫的分子鉴定及两种蛔虫抗原基因的表达与免疫保护研究》文中提出野生动物是宝贵的自然资源,保护野生动物是全人类的共同责任。大熊猫、黑猩猩和白眉长臂猿均属世界濒危物种,小熊猫、北极熊、棕熊、马熊和四川黑熊为我国的二级保护动物。蛔虫是这些动物体内最常见、危害最严重的寄生虫,野生和圈养种群均可感染与发病,因此搞好大熊猫等珍稀野生动物蛔虫病的防治是保护野生动物的一项重要技术措施。对动物蛔虫进行准确的分类鉴定是开展蛔虫生物学及防治等研究的基础性工作。蛔虫是一类宿主特异性较强的寄生虫。目前,对寄生于大熊猫和小熊猫等野生动物体内蛔虫的种类与分类地位尚存在一定的争议。过去对动物蛔虫的分类鉴定主要依赖于形态与生物学方法。由于宿主与地理环境等因素所导致的遗传变异,传统的形态与生物学分类研究方法在一些蛔虫近缘种的分类鉴定中的局限性日益明显。采用传统的形态学分类方法对蛔虫进行分类,很难准确地反映蛔虫种群的真正情况。长期以来,大熊猫等野生动物蛔虫病的防治均以药物驱虫为主,但驱虫药物均不同程度地存在副作用且长期使用可能产生抗药性等问题,因此也需要研究新的防治技术。为了更好地防治野生动物蛔虫病,本研究运用寄生虫分子分类常用靶基因(ITS-2、ND1基因)对大熊猫、小熊猫等8种野生动物蛔虫的进行了研究,从而为以形态学为基础的传统分类提供DNA分子水平的依据。同时,本研究也分别采用RT-PCR扩增西氏贝蛔虫的Bs-Ag1、Bs-Ag2和似蚓蛔虫的A1-Ag1、A1-Ag2等抗原基因,构建原核表达载体进行诱导表达,并对表达的重组蛋白进行Western-blot分析和免疫保护研究,从而为研制西氏贝蛔虫和似蚓蛔虫基因工程疫苗的提供候选抗原。主要研究工作和结果如下:1.大熊猫等八种野生动物蛔虫的ITS-2和ND1基因序列分析及系统发生关系研究为了探讨野生哺乳动物蛔虫的分类地位。本研究测定了寄生在大熊猫、小熊猫、北极熊、棕熊、马熊、黑熊、黑猩猩和白眉长臂猿体内蛔虫的核糖体第二内部转录间隔区(ITS-2)和线粒体ND1基因碱基序列,分析了其碱基组成和序列间的同源性,结果表明:大熊猫、小熊猫和4种熊科动物蛔虫的ITS-2基因和ND1基因部分序列同源性分别为80.4%～99.7%和90.4%～98.6%;黑猩猩和白眉长臂猿体内蛔虫的ITS-2基因和ND1基因部分序列间的同源性分别为100%和99.2%。采用多种方法构后免疫小鼠,3次免疫后用似蚓蛔虫感染性虫卵攻击小鼠,7天后处死小鼠,取其肝脏和肺脏分离似蚓蛔虫幼虫,结果发现rAl-Ag1-FCA组幼虫回收率比对照组幼虫减少了69.34%(P＜0.01),小鼠血清中IgG抗体显着升高(P＜0.01)。研究结果表明rAl-Ag1可用于制各似蚓蛔虫基因工程疫苗。5.似蚓蛔虫Al-Ag2基因的克隆表达和重组表达蛋白的免疫保护研究利用RT-PCR方法从似蚓蛔虫感染性虫卵的总RNA中扩增出了似蚓蛔虫Al-Ag2抗原基因,该基因与猪蛔虫L2R37基因(AB089179)的序列同源性为96.0%。构建pET32a-Al-Ag2表达载体并在表达菌株BL21(DE3)中进行了诱导表达,经Western-blot分析其重组蛋白能被兔抗似蚓蛔虫阳性血清所识别。似蚓蛔虫Al-Ag2基因表达的重组蛋白纯化后与弗氏完全佐剂(FCA)混合液接种免疫小鼠,3免后用似蚓蛔虫感染性虫卵攻击小鼠,7天后处死小鼠,取其肝脏和肺脏分离似蚓蛔虫的幼虫,结果发现rAl-Ag2-FCA组小鼠的荷虫数比对照组幼虫减少66.84%(P＜0.01),小鼠血清中IgG抗体显着升高(P＜0.01)。本研究结果为似蚓蛔虫病的早期诊断及似蚓蛔虫基因工程苗疫苗的研制奠定了基础。
白素英[7]2001年在《豹猫(Felis bengalensis)的遗传多样性及系统发育研究》文中指出本文通过随机扩增多态性DNA（RAPD）技术和线粒体DNA序列分析技术，对豹猫3个亚种6个群体64个个体进行了遗传多样性和系统发育分析。 RAPD分析中，首先检验了不同酶和退火温度对PCR扩增的影响。应用BioStar公司的Taq DNA聚合酶在40个随机引物中筛选出36个有效引物，引物的有效性为90.00％，平均每条引物得到8.67条带；而MBI公司的Taq DNA聚合酶只筛选出11个有效引物，引物的有效性仅为27.50％，平均每个引物只得到4.64条带。退火温度提高1℃，RAPD的扩增产物明显减少（引物P61除外），9个引物扩出的总带数由89条减到65条，但多态带的比率由87.64％增加到93.85％。用筛选出的36个有效引物对6份混合样品扩增，共获得289条DNA谱带，其中231条具有多态性，占79.93％。单个引物获得的标记数在0～6之间。选其中9个引物对6个群体的21个个体进行PCR扩增。共扩增出65条带，其中61条为多态片段，占93.85％。 本研究测定了3个亚种6个群体的16只豹猫的线粒体细胞色素b基因402bp的DNA序列，共发现23个位点存在变异，占总序列的5.72％。其中15次转换，8次颠换。豹猫细胞色素b的序列差异在个体间为0.00％～2.49％，亚种间平均为0.90％～1.34％。不同群体内差异较大，广西群体内高达1.99％；最低的是福建群体，为0.50％。 另测定了2个亚种5个群体的10只豹猫的线粒体DNA控制区的序列，其中，1只测得375bp，9只测得440bp。发现47个位点存在变异，占总序列的10.68％。其中39次转换，8次颠换。豹猫线粒体DNA控制区的序列差异在个体间为0.68％～6.59％，平均为3.14％，北方群体内差异较小，平均为1.71％，南方叁个群体内的DNA序列差异平均为2.27％，而豹猫的北方亚种和指名亚种间差异较大在2.73％～6.59％之间，平均为4.01％。 遗传多样性分析显示，核DNA和线粒体DNA数据得出的结论基本一致，豹猫的遗传多样性相当丰富。尤其是指名亚种内遗传多样性水平很高，但华东亚种的福建群体的遗传多样性水平较其它群体要低得多。线粒体DNA控制区的数据还显示，豹猫北方亚种与指名亚种分化明显，因此，应将豹猫的北方亚种与指名亚种作为两个进化显着性单元分别对待。将黑龙江、山西、贵州、广西、云南群体作为不同的管理单元进行分别管理。另外，指名亚种内存在遗传分化。 基于遗传距离，用NJ和UPGMA法构建了豹猫DNA水平的系统树，结合形态特征和地理分布，系统发育分析显示，所研究豹猫的6个群体可分3支，黑龙江-山西群体为独立的一支，对应于北方亚种F.b.euptilura；贵州-广西群体聚在一起，对应于指名亚种F.b.bengalensis；福建群体为另一支，对应于华东亚种F.b.chinensis。该结果基本支持基于形态的传统的亚种划分，只是F.b.euptilura和F.b.bengalensis分化明显，可能已经接近种的分化水平，而且从线粒体DNA控制区的PCR扩增片段的大小上看，原属于指名亚种内的云南群体与华东亚种的福建群体的片段大小相似，都小于贵州和广一 西群体的片段，因而其分类地位有待进一步验证。另据北方亚种和指名亚种细胞色素b 基因以及W控走区的平均0差异分别为1．3硼出和4．of％，推算出两个亚种的分 化时间约在26．8或28．6万年前。 本研究还表明，线粒体DNA控末区是研究豹猫群体遗传结构的良好标记，非损伤 性取样方法是研究野生动物的理想取样方法。
杨波[8]2013年在《大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）线粒体基因组研究及圈养种群遗传多样性分析》文中进行了进一步梳理大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的“活化石”物种,国家Ⅰ级保护物种,被IUCN和中国濒危动物红皮书定义为濒危级。现存野生种群仅分布于陕西秦岭南麓,四川盆地西北缘的岷山和邛崃山系,西缘的大相岭、小相岭及凉山等六个山系。如今大熊猫栖息地生境严重破碎化,限制孤岛小种群间基因交流,加速近亲繁殖和遗传漂变发生频率以致种群遗传多样性降低,并且伴随着统计学、环境、灾害和遗传等随机性的不确定性因素影响,小种群难以续存。随着全球气候变暖、森林锐减、淡水资源危机等重大环境问题的加剧,大熊猫的生存面临着严峻考验,急切需要得到有力的保护。大熊猫人工繁育是迁地保护的重要环节。然而,大熊猫圈养种群正面临着遗传多样性丧失、种源枯竭和繁殖适配率下降等风险,严重制约圈养种群的维持与发展,将使得迁地保护项目实施难度加剧。圈养种群遗传学分析依赖于现存野生种群的遗传学背景信息如遗传多样性、遗传结构、亲缘地理和保护单元定义等,是大熊猫迁地保护与野化放归的重要研究内容。本文基于线粒体基因组数据和mtDNA D-loop多态性信息就以上遗传学问题进行分析,为圈养大熊猫的繁殖管理和繁育策略在提供分子辅助。通过分析大熊猫4条线粒体基因组序列显示,其基因组结构属于典型的脊椎动物结构,长度约为16746～16846bp,控制区的十碱基串联重复单元致使基因组长度差异性的存在。线粒体基因组的碱基组成呈A+T碱基偏好性,A+T碱基含量高达61.2%,明显大于G+C含量(38.8%),各碱基含量依次为A>T>C>G。整个基因组序列共含有148SNPs,包含34个简约性信息位点和114个单可变位点。其中,CytB和D-loop区具有更高的碱基置换率,表明其进化速率更快,而12S、16S和ATP8的进化速率最低。系统进化分析显示,大熊猫与熊科物种聚集在一起,并处于熊科物种的基部位置；大熊猫与小熊猫处于不同的进化分枝。线粒体蛋白质基因均受到了高强度的净化选择压力和功能约束性,其中ATP8、ND1、ND5、CytB和ND4等五个基因表现的最为强烈。本文基于大熊猫线粒体控制区5’端约585bp,结果显示,圈养种群较野生种群表现出中等水平的遗传多样性,单倍型多样性(h=0.666)和核苷酸多样性(π=0.00285)数值稍小于野生种群(h=0.832,π=0.00393),但同时比凉山(h=0.579,π=0.00216)、小相岭(h=0.532,π=0.00180)和大相岭(h=0.186,π=0.00033)种群的遗传水平高。卧龙种群(h=0.632,π=0.0312)的遗传多样性指数均大于成都种群(h=0.604,π=0.00188),并且卧龙种群(S=11)单倍型较成都种群(S=5)含有较多的变异位点数。种群内平均遗传距离分析显示出卧龙种群(0.00315)内平均距离>成都群体(0.00189),表明成都种群内个体间的遗传关系较近,近交繁殖较明显,从而导致种群遗传水平降低。卧龙与成都种群间存在着较大的基因流(Nm=2.2400>1)。卧龙种群与邛崃及岷山种群间Fst分别为0.0003和0.0237,均小于0.05,表明卧龙种群建群者大多数来源于这两个野生种群；成都种群与邛崃种群的Fst最小(0.1212)；陕西种群与秦岭野生种群的亲缘关系最近(Fst=0.0001)。六个野生种群可被划分成为四个地理区域种群即北部的秦岭种群,中部岷山、邛崃和大相岭的混合种群,南部的两个种群(小相岭和凉山种群)。并且,四个地理区域种群间的存在着明显的遗传差异性(Fst>0.25,P<0.01)。大熊猫总种群错配分布曲线呈单峰,同时SSD(0.03326)和r(0.10615)值均较少且不显着(P>0.05),表明种群曾经历过瓶颈效应,种群存在扩张现象。中性检验结果(Tajima's D=-0.82660和Fs=-19.10788)与其结果一致。叁个圈养种群错配分布曲线均呈单峰,且Tajima's D均为负值,表明种群受到了“奠基者效应”的影响以至瓶颈效应的产生,需要采取相应措施来进行更佳的保护与管理。
张栓玲[9]2012年在《食肉目动物鲜味受体基因（Taslrl）的分子进化研究》文中指出味觉在动物的采食中起着很重要的作用,尤其是鲜味在食肉目动物中的食物选择中更是担着主要角色,因为它们中许多以肉类为主要食物。食肉目动物从食性上可以分为叁大类,包括肉食类(meat-eater),杂食类(omnivores)和植食类(plant-eater)的。食肉目动物无疑成为研究物种食性多样化和味觉基因关系的首选动物,目前国内外关于食肉目的地理分布和化石研究较多,然而以鲜味受体(Taslr1)基因作为分子标记,来研究食肉目群体的进化以及食性分化分子遗传基础的还很少。先前有研究发现Taslr1基因在大熊猫上存在假基因化现象,这可能与其独特的食性有关,99%都是竹子,食物的改变使其鲜味受体基因功能束缚放松。然而,在食肉目中还有很多其它类群的Taslrl基因未被研究。在这项实验中,我们分析了3个不同食性类群的食肉目动物的Taslr1基因,尤其是小熊猫与大熊猫有十分近似的食性,我们推测小熊猫可能也存在Taslr1基因假基因化现象。本研究以Taslr1基因作为分子遗传标记,利用Premier5、DNAStar、 ClustalX1.83、DNAMAN、MEGA5、PAML4.0等生物学软件,基于分子系统学和生物信息学等分析方法对食肉目动物的分子进化进行了探讨。对序列进行了氨基酸组成、拓扑结构分析、系统发育、选择压力等相关分析,采用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)重建食肉目动物间的系统发育关系。得到的主要结果如下：1)首次获得7个食肉目动物Taslrl基因编码序列,分别是猪獾,鼬獾,东北虎,豹猫,小熊猫,黑熊,果子狸。食肉目Taslr1基因cDNA序列全长2526bp,包括6个外显子,其中所测的小熊猫,黑熊,果子狸为完整序列,小熊猫的2525bp,黑熊和果子狸的2526bp,猪獾,鼬獾,东北虎,豹猫为非完整序列约2552bp；2)利用已经测得的基因序列,结合GeneBank中已报道物种的Taslrl基因序列,进行序列比对分析,发现小熊猫物种的Taslrl基因第六外显子有lbp缺失,由于缺失导致移码突变,基因编码的蛋白质失去功能,所以小熊猫Taslrl基因为假基因。实验所涉及到的食肉目动物序列比对发现,只有大熊猫和小熊猫Taslrl基因存在缺失；3)选择性检验表明,Taslrl基因在食肉目动物进化过程中存在强烈的纯净化选择。通过PAML枝模型分析获得,叁个不同食性类群之间的选择压力ω(dN/dS)差异不显着,这表明不同食性之间的食肉目动物都经历着相似的净化选择,尤其是Taslrl基因失去功能的大熊猫和小熊猫其ω值没有显著高于杂食动物和食肉动物；4)Taslrl基因的假基因化现象可能是大熊猫和小熊猫在长期适应类似的食物中趋同进化的结果。根据本实验的研究结果,Taslrl基因假基因化现象只在大熊猫和小熊猫两个食肉目动物发现,因此,我们可以推测大熊猫和小熊猫假基因化的原因可能与其独特的食竹性有关,因为这一现象并没有在其他食草类动物中发现,如牛,马等。
张志敏[10]2006年在《亚洲黑熊脑源性神经营养因子全长基因和活化素β_A亚基基因的克隆及分子进化分析》文中研究表明亚洲黑熊(Selenarctos thibetanus)隶属食肉目熊科(Ursidae),主要分布于俄罗斯与亚洲的印度、尼泊尔、日本、朝鲜、阿富汗、巴基斯坦和中国。20世纪80年代,我国活熊取胆掀起的养熊热致使约9000多只野生黑熊被关进牢笼,由于饲养条件的限制,圈养黑熊只有野生黑熊寿命的1/3,这次熊类资源的浩劫导致黑熊数量骤减。我国的亚洲黑熊约有17500只。目前,亚洲黑熊已被国际濒危物种贸易公约列为一类保护动物,在我国也被列入濒危动物红皮书易危(Ⅴ)级,国家二级重点保护动物。亚洲黑熊具有很高经济价值,同时又是国宝大熊猫的近亲。由于取材困难等原因,目前国内对黑熊的研究主要集中在形态学、饲养繁殖和熊胆采集等方面;国外则侧重于传染病学、形态学、行为学、各类疾病和生长发育等方面;对染色体组型及遗传结构研究的报道很少,分子水平上的研究仅见于少数几个线粒体基因,未见核基因的报道。为满足我国人工养殖黑熊及其合理利用的需要,有必要从分子生物学水平收集亚洲黑熊种质资源方面的资料、探讨黑熊种属间的亲缘关系,为黑熊生态、遗传、繁殖与发育方面提供依据。 沿用本室改进的粪便提取方法,参照马来熊BDNF基因序列设计引物,首次从亚洲黑熊粪便DNA中扩增和克隆到包含完整核BDNF基因的753bp片段,以毛发作阳性对照并进行重复实验,获得稳定一致结果。序列分析表明,亚洲黑熊的BDNF基因非常保守,与人相比,一致性达94.5%,与大熊猫比达98.9%。在推导的多肽序列中,其成熟区氨基酸序列与所有已报道哺乳动物的完全一致;对亚洲黑熊及其相关物种BDNF基因序列的比较分析,发现大熊猫与包括黑熊在内的熊科动物亲缘关系更近,而与小熊猫较远。本文首次采用非损伤性取样法在分子生物学水平对亚洲黑熊基因组核BPNF基因进行分析,不仅为亚洲黑熊的保护和繁育提供重要参考资料,为非损伤性取样在珍稀濒危野生动物研究中的应用拓宽了思路,也为亚洲黑熊及其近缘种的系统分类研究提供分子证据。 借鉴互联网中已经克隆到的抑制素β_A亚基基因的序列,设计并合成一对兼并引物,首次扩增和克隆到亚洲黑熊的β_A亚基基因的357bp片段,以水作为阴性对照排
参考文献：
[1]. 熊科物种的分子系统发育研究[D]. 于黎. 辽宁师范大学. 2002
[2]. 熊科物种的系统发育研究[C]. 于黎, 李庆伟, Oliver, A.Ryder, 张亚平. 中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编. 2003
[3]. 食肉目哺乳动物的系统发育学研究概述[J]. 于黎, 张亚平. 动物学研究. 2006
[4]. 我国华南地区大熊猫系统演化与遗传多样性的古DNA研究[D]. 侯新东. 中国地质大学. 2014
[5]. 熊科物种DNA编码与系统发育关系研究[D]. 鲁再丰. 东北林业大学. 2010
[6]. 八种野生动物蛔虫的分子鉴定及两种蛔虫抗原基因的表达与免疫保护研究[D]. 何光志. 四川农业大学. 2009
[7]. 豹猫(Felis bengalensis)的遗传多样性及系统发育研究[D]. 白素英. 东北林业大学. 2001
[8]. 大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）线粒体基因组研究及圈养种群遗传多样性分析[D]. 杨波. 四川农业大学. 2013
[9]. 食肉目动物鲜味受体基因（Taslrl）的分子进化研究[D]. 张栓玲. 四川农业大学. 2012
[10]. 亚洲黑熊脑源性神经营养因子全长基因和活化素β_A亚基基因的克隆及分子进化分析[D]. 张志敏. 华中师范大学. 2006
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