杨广珍[1]2011年在《肝癌癌蛋白p28~（GANK）增强细胞氧化应激耐受的作用与机制研究》文中研究说明第一部分p28~(GANK)增强肝癌细胞氧化应激耐受的作用与机制研究研究背景和目的肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝癌中最常见的类型,占所有原位肝癌病例的90%以上。HCC的发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程,在其中氧化应激具有非常重要的作用。有综述总结了各种HCC动物模型的致癌机制:所有的HCC动物模型有唯一一个共同的特点,即肝细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)水平升高。细胞内ROS的水平决定于ROS的生成及清除能力,当ROS生成增多或者(和)细胞ROS清除能力减弱时,便会出现ROS水平升高。ROS化学性质活泼且具有氧化性质,能够导致DNA损伤、脂质氧化以及一些蛋白生物学功能的改变,造成细胞损伤,使细胞处于氧化应激状态。肝癌细胞的快速增殖导致大量ROS生成使细胞面临氧化应激,但是,已有研究证实相对于正常肝细胞,肝癌细胞具有更强的抗氧化酶体系和抗氧化能力,致使其在肝脏的过氧化环境中取得生存优势,这是各种因素导致肝癌发生的机制之一。另外,在肝癌的化疗过程中,大部分化疗药是通过直接或者间接诱导细胞中ROS水平升高诱导肝癌细胞死亡而发挥治疗作用的,但肝癌细胞强大的抗氧化系统能够保护肝癌细胞对抗这种死亡,而使肝癌的化疗效果不明显。综合已有研究成果,纵观肝癌的发生发展、转移、复发到肝癌的化疗耐受都与肝癌细胞对氧化应激的耐受有关。因此,寻找影响肝癌细胞氧化应激耐受力的关键分子具有重要意义。gankyrin基因是2000年Fujita等人应用消减杂交法从人肝细胞肝癌组织中筛选出的一条新基因。它编码的Gankyrin蛋白在大部分肝癌组织(~70%)中呈高丰度表达,而且在肝癌生成的早期即已高表达,而在正常肝组织没有表达。本实验室和其他研究小组的研究已揭示p28~(GANK)蛋白的生物学功能是多样的:它既可以通过促进p53与其泛素连接酶MDM2结合而促进p53蛋白的泛素化及降解发挥抗凋亡作用,又能够作为穿梭蛋白将RelA转位到胞浆而抑制NF-κB转录活性,还可以增强Akt蛋白磷酸化而转导细胞生长信号。而p53蛋白、NF-κB转录因子和PI3K/AKT信号通路都在细胞的氧化应答中具有重要作用。我们实验室的研究结果还显示,利用腺病毒介导的方法在肝癌细胞系中干扰p28~(GANK)的表达能使细胞中ROS累积增多,导致自发性的细胞死亡;ROS清除剂NAC可以逆转这种细胞死亡的发生。这提示p28~(GANK)能够影响细胞的ROS累积,从而增强肝癌细胞对氧化应激的耐受力。本研究拟利用H_2O_2这种经典的氧化应激诱导剂在肝癌细胞中诱导氧化应激,一方面观察氧化应激对肝细胞中p28~(GANK)表达水平的影响;另一方面观察改变肝癌细胞的p28~(GANK)蛋白表达水平后,细胞对氧化应激的耐受力的变化;并进一步探讨p28~(GANK)调控肝癌细胞氧化应激耐受的具体分子机制。实验方法:1.用不同浓度H_2O_2刺激细胞,利用real-time PCR、western blot等方法观察肝细胞(肝癌细胞)中p28~(GANK)基因转录以及翻译表达水平的变化;并用ROS清除剂NAC处理细胞,然后western blot检测细胞p28~(GANK)表达水平的变化;2.利用GSH检测专用试剂盒分析DEN诱导SD大鼠肝癌模型过程中大鼠血浆GSH水平并通过real-time PCR的方法检测相应肝组织样本中p28~(GANK)基因表达变化情况;3.通过质粒稳定转染、瞬时转染以及腺病毒感染的方法改变肝癌细胞中p28~(GANK)蛋白表达,然后通过观察显微镜下细胞形态变化、细胞PI染色阳性率以及PARP蛋白的剪切体等,观察p28~(GANK)高低表达对氧化应激诱导的细胞死亡的影响;4.用ROS特异的荧光探针对H_2O_2刺激下的细胞或者转染了癌基因ras表达质粒的细胞进行染色,然后进行荧光显微镜镜下观察以及流式细胞仪检测,观察细胞内p28~(GANK)表达水平的变化对氧化应激下细胞内ROS累积的影响;5.应用real-time PCR方法检测p28~(GANK)高低表达对氧化应激下抗氧化酶系统的诱导表达的影响以及肝细胞癌组织样本中p28~(GANK)表达与抗氧化酶系统表达水平的相关性;6.用细胞总抗氧化能力试剂盒检测p28~(GANK)高低表达的稳定细胞系其抗氧化能力,观察这些细胞系总抗氧化能力是否不同;7.电镜观察稳定细胞系HCCLM3H/CCLM3-sip的细胞内线粒体密度,并通过real-time PCR的方法检测两种细胞中线粒体生成相关基因的表达水平;8.应用western blot方法检测p28~(GANK)高低表达对氧化应答关键信号通路:MAPK信号通路及PI3K/AKT信号通路的影响;并应用相应通路抑制剂观察以上通路在p28~(GANK)抗氧化功能中的重要性。结果:1.适度浓度的H_2O_2刺激能够增加肝癌细胞中p28~(GANK)转录及蛋白水平的表达,持续增加H_2O_2浓度则会使p28~(GANK)表达减少,视细胞类型不同具体刺激浓度亦不同;NAC处理能够降低SMMC7721细胞中p28~(GANK)表达水平;2. DEN诱导大鼠肝癌过程中,大鼠血浆中GSH浓度变化与其肝组织中mRNA表达水平呈现负相关性;3.增加(或者降低)细胞中p28~(GANK)蛋白的表达能够相应减少(或者增加)H_2O_2刺激诱导的细胞死亡,其中p53蛋白不发挥主要作用;4. p28~(GANK)能够抑制H_2O_2刺激导致的ROS水平升高,并且能够降低ras表达质粒转染引起的细胞内ROS累积;5. p28~(GANK)能够增强氧化应激下抗氧化酶的转录激活;6. p28~(GANK)正向调节细胞的总抗氧化能力;7.稳定干扰HCCLM3细胞内p28~(GANK)表达会降低细胞内线粒体密度,并且抑制线粒体生成相关基因的表达;8. p28~(GANK)显著增强氧化应激导致的Akt的磷酸化,而且应用PI3K/AKT信号通路抑制剂可以减弱氧化应激下p28~(GANK)对细胞的保护作用。结论:本研究利用H_2O_2诱导氧化应激的模型研究了p28~(GANK)表达与细胞氧化应激耐受性间的关系。发现p28~(GANK)蛋白能够正向调节肝癌细胞对氧化应激的耐受力,而且一定浓度内的H_2O_2刺激能够上调肝癌细胞中p28~(GANK)的表达。氧化应激下p28~(GANK)能够增加肝癌细胞中抗氧化酶的表达,增强细胞的总抗氧化能力,减少细胞内ROS的累积,抑制氧化应激引起的细胞死亡。此外,氧化应激下p28~(GANK)还可以通过增强Akt蛋白磷酸化而保护肝癌细胞对抗氧化应激诱导的细胞死亡。第二部分p28~(GANK)正反馈调节β-catenin信号通路的作用与机制研究研究背景和目的肝癌是世界第六大常发肿瘤,更因为其化疗敏感性低、高复发、预后差等原因被称为“癌中之王”。随着分子生物学的迅猛发展,以癌基因为靶点的生物学治疗被认为是未来治疗肝癌的有效手段。近年来一系列研究显示,肝癌癌蛋白p28~(GANK)有望成为肝细胞癌治疗的一个有效靶标。一方面,p28~(GANK)几乎表达于所有的肝细胞癌组织中,癌高于癌旁的几率约为百分之七十,但在正常肝组织中没有表达;另一方面p28~(GANK)能够促进细胞增殖,将正常细胞转化为癌性细胞。目前研究已经得知p28~(GANK)加快细胞周期进程,促进细胞增殖是通过增强抑癌蛋白Rb的磷酸化,加速Rb蛋白降解,促进转录因子E2F的释放而完成的。然而大部分肝癌细胞中都存在Rb的缺失或者突变,那么除Rb蛋白外,p28~(GANK)还能够通过哪些途径促进肝癌细胞的增殖呢?这个问题目前还没有研究涉及。β-连环蛋白(β-catenin)是一种重要的肿瘤相关基因,除了在细胞粘附中有重要作用外,还是Wnt信号通路的重要功能分子。Wnt/β-catenin信号通路是众多组织中调控细胞增殖、凋亡和分化的重要通路。近来研究发现,在肝癌发生早期存在β-catenin蛋白的异常聚集,并且这种聚集能够促进肝癌的发生以及早期肝癌细胞的快速生长。探讨β-catenin在肝癌发生发展中的作用具有重要临床价值。已有研究表明提高野生型p53水平可以明显下调β-catenin蛋白水平。而p28~(GANK)能与p53蛋白的泛素连接酶MDM2相互作用,促进p53蛋白的泛素化及其蛋白酶体途径依赖的蛋白降解,我们推测在肝细胞癌的发生发展中癌蛋白p28~(GANK)与β-catenin间可能存在相互联系。本研究将利用一些经典的分子生物学实验方法研究:在各种细胞生长信号的刺激下p28~(GANK)表达水平的改变;改变p28~(GANK)蛋白表达对β-catenin信号的影响;介导生长因子刺激信号的关键蛋白Akt对p28~(GANK)表达的影响;Wnt/β-catenin信号通路激活对细胞中p28~(GANK)的调节作用并初步探讨以上调节作用和影响的分子机制。实验方法:1.运用双荧光素酶报告基因系统以及western blot等方法检测生长因子刺激或者瞬时转染Ras对p28~(GANK)基因表达水平的影响;2.应用报告基因系统结合ERK与PI3K信号通路抑制剂确定生长因子与Ras对p28~(GANK)表达的调节通路;3.利用报告基因系统、real-time PCR以及western blot等方法观察瞬时转染Akt表达质粒对p28~(GANK)基因表达的影响;4.多种肝癌细胞系中高表达p28~(GANK),观察p28~(GANK)对p-Akt的影响;5.通过Luciferase报告基因质粒pGL-OT(含有β-catenin/TCF4复合物特异结合区)及对照报告基因质粒pGL-OF与不同剂量p28~(GANK)质粒细胞共转染实验,确定p28~(GANK)对β-catenin/TCF4转录活性的影响;6.运用western blot及核浆分离技术,检测HEK293细胞瞬转p28~(GANK)后,β-catenin在胞核胞浆中的分布变化;应用腺病毒介导的RNA干扰技术下调肝癌细胞系中p28~(GANK)的表达水平,探讨其对β-catenin转录活性的影响;7.应用western blot和免疫组织化学方法检测临床肝癌组织标本中β-catenin、c-Myc、cyclinD1表达水平与p28~(GANK)蛋白表达水平之间的关系;8.利用双荧光素酶报告基因系统研究差异表达p28~(GANK)对其自身报告基因转录活性的影响;运用western blot检测外源性p28~(GANK)表达增加对内源性p28~(GANK)表达的影响。结果:1.肝细胞生长因子、表皮生长因子刺激和Ras表达质粒瞬时转染都能够明显上调饥饿处理后的HEK293和HepG2细胞中p28~(GANK)的表达水平;2. PI3K/AKT通路介导上述刺激对p28~(GANK)的上调作用,而且瞬时转染Akt表达质粒能够上调p28~(GANK)转录及蛋白水平的表达;而且HCC组织样品中p-Akt水平与p28~(GANK)的表达存在正相关性;3. Huh7、L02及HepG2细胞中瞬时转染p28~(GANK)质粒均可显著增强AKT蛋白磷酸化水平;4. HEK293细胞中瞬时转染p28~(GANK)表达质粒可提高β-catenin入核蛋白水平,并在一定程度上稳定细胞中β-catenin总蛋白水平,增强β-catenin/TCF4转录活性;5.报告基因、RT-PCR或western blot实验证明瞬时转染表达β-catenin和c-Myc都能够在转录和蛋白水平上调p28~(GANK)表达;6. Western blot和免疫组化实验分析表明p28~(GANK)的蛋白水平在肝癌组织样品中与β-catenin、c-Myc和cyclinD1呈同向性表达;7.在HEK293和Hep3B中p28~(GANK)正向调节自身表达。结论:本研究发现生长因子刺激或Ras激活可以上调肝癌癌蛋白p28~(GANK)的表达,其中PI3K/AKT信号通路具有重要作用。Akt、β-catenin和c-Myc的上调表达都能够促进p28~(GANK)的表达。进一步实验表明上调的p28~(GANK)可以反过来进一步促进β-catenin蛋白的稳定及其核内定位从而上调β-catenin/TCF4转录活性,而且p28~(GANK)过表达能够增强AKT蛋白磷酸化水平。上述结果支持我们提出的p28~(GANK)以正反馈方式调节β-catenin信号通路的科学推测,为深入理解p28~(GANK)影响肝癌发生发展的信号调控机制提供了依据。
冯凯[2]2000年在《胰岛素调控大鼠肝癌细胞系报告基因表达的研究》文中研究说明糖尿病造成的主要临床问题是长期高血糖对机体的伤害，良好的血糖控制可以明显减少糖尿病并发症的发生率。而糖尿病急慢性并发症是糖尿病患者致死或致残的主要原因。治疗糖尿病要达到的最终目的，是在日常变化的膳食条件下，把血糖稳定在相对狭小的生理范围内。但每天通过皮下多次注射胰岛素的方法来强化血糖的控制，常常会增加低血糖的发生率，因此它不是最理想的治疗方案。糖尿病的基因治疗己成为目前最具前景的治疗策略，它是通过基因转移技术对细胞进行基因改造，恢复胰岛素生理性分泌，改善糖尿病患者临床状态的治疗方法。通过基因修饰非β细胞，使其替代体内功能不足的胰岛细胞表达分泌胰岛素，是糖尿病基因治疗的一种策略，它的主要优点是加工的非胰岛细胞不会受到机体针对胰岛细胞的自身免疫伤害。但寻找理想的调控基因是这一研究的难点。为了研究磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)启动子片段在肝细胞内的转录调节作用，本课题主要进行了以下工作： 首先，构建及鉴定荧光素酶报告质粒pGL2-PEPCK-Luc。从质粒pPEPCK-int上用限制性内切酶切取大小为550bp左右的PEPCK启动子片段，通过过渡载体质粒PBS-SK，构建含有PEPCK启动子片段的的过渡质粒PBS-PEPCK。并在此基础上构建成功真核细胞表达的荧光报告质粒pGL2-Basic-Luc，经核苷酸序列测定，证实质粒连接位点正确，重组片段序列与GeneBank资料一致，未发现核苷酸突变或丢失。 随后，通过脂质体(Lipofectin)转染法将构建的报告质粒与内对照质粒pSV-β-Galactosidase共同转染大鼠肝肿瘤细胞系(CBRH7919)，以不含任何启动子的pGL2-Basic-Luc质粒作为荧光素酶表达活性对照，设定背景荧光强度为1，结果显示，细胞转染pGL2-PEPCK-Luc与pGL2-Basic-Luc质粒后，荧光素酶表达的相对活性分别为11.75±1.54vs1.36±0.18，P＜0.01。证明重组质粒在CBRH7919细胞内能够使表达荧光素酶，为下一步研究PEPCK启动子的转录调节奠定了基础。 最后，研究PEPCK启动子序列在肝细胞内对报告基因转录的调节作用。
佚名[3]2010年在《基础免疫》文中指出脂筏在tmTNF-α反向信号传递中的作用陈克清刘涛于敏胡雪娜冯玮姜小丹王晶李卓娅华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉430030背景及目的:脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有
张剑云[4]2017年在《糖皮质激素受体和盐皮质激素受体介导的典型农药和金属的内分泌干扰效应的体外评价》文中进行了进一步梳理农药和金属是环境中两类重要的污染物。全球每年大约有100-250万吨的农药用于农业、住宅和公共卫生等方面,大量文献表明其母体化合物或代谢产物在环境中广泛存在。由于矿物开采加工和电子垃圾的废弃,金属污染也越来越受到人们的重视。已有多项研究证明许多农药和金属是环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs),可以通过模拟或拮抗生物体内源激素,干扰激素受体的正常功能。皮质激素包括糖皮质激素和盐皮质激素,通过与其特异性受体[即糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)]结合并转录激活调控下游基因表达,从而发挥生理功能。这两种皮质激素受体在大脑、肾、肝、心血管、结肠等多种组织和器官中表达,起着不可或缺的作用。然而,目前关于EDCs与GR、MR之间相互作用的研究仍然十分有限。因此建立快速筛选类/抗皮质激素EDCs的检测方法和评价体系,为EDCs的环境安全和健康风险评价提供科学依据,对保障人民健康与安全有重大现实意义。本论文主要研究内容如下:(1)使用双荧光报告基因实验、激素响应基因实验,检测34种常用农药及农药代谢产物对GR的干扰作用,并利用分子对接对其机制进行初步探索。所测34种化合物对GR均不存在的显著的激动作用。而其中12种化合物,包括5种拟除虫菊酯(氯氰菊酯、联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、3-苯氧基苯甲醇(3-PBA)和苄呋菊酯)、4种有机氯(o,p'-DDT、p,p'-DDT、p,p'-DDE和甲氧滴滴涕)、氨基甲酸酯杀虫剂乙硫苯威、三嗪除草剂莠去津和杀真菌剂甲苯氟磺胺显著抑制了GR转录活性。苄呋菊酯、乙硫苯威、联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、p,p'-DDT、o,p'-DDT、甲氧滴滴涕和甲苯氟磺胺,表现较强的GR拮抗活性,其化合物抑制糖皮质激素作用的20%的相对浓度(RIC20)低于10-6M。进一步实验发现,4种有机氯农药、联苯菊酯和3-PBA抑制了大鼠肝癌细胞H4IIE中糖皮质激素响应基因烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(phosphoenol pyruvate carboxykinase)的表达,o,p'-DDT和甲氧滴滴涕还可抑制精氨酸酶(arginase)和酪氨酸氨基转移酶(tyrosine aminotransferase,TAT)的转录表达。氯氰菊酯和甲苯氟磺胺也可抑制TAT的表达。在小鼠免疫细胞J774A.1中,高效氯氟氰菊酯、苄呋菊酯、3-PBA、o,p'-DDT、p,p'-DDT、p,p'-DDE、甲氧滴滴涕和甲苯氟磺胺,显著降低了糖皮质激素诱导的抗炎蛋白GILZ基因的表达。分子对接模拟结果显示筛选出的12种拮抗剂与GR的结合可能具有不同的结合模式。我们的研究结果表明,多种农药和农药代谢产物存在糖皮质激素干扰作用,对人体健康和生态环境存在潜在风险。(2)检测了 43种常用农药及农药代谢产物对MR的干扰作用,并对其干扰机制进行了初步探索。所测农药对MR均不存在显著的激动作用。而其中16种化合物,包括4种拟除虫菊酯农药(氯氰菊酯、联苯菊酯、苄氯菊酯、氰戊菊酯)、4种有机氯农药(o,p'-DDT、p,p'-DDT、p,p'-DDE和甲氧滴滴涕)、2种有机磷农药(乙酰甲胺磷、乐果),酰胺类除草剂甲草胺、三嗪除草剂特丁津、三嗪除草剂莠去津代谢产物、氨基甲酸酯类杀菌剂代森锌、苯基吡唑类杀虫剂氟虫腈,显著的减弱了醛固酮对MR转录活性的激活,具有盐皮质激素拮抗作用。进一步实验发现,这16种MR拮抗剂显著抑制了人血管平滑肌细胞中的盐皮质激素响应基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)的表达,并干扰了 MR介导的醛固酮在肝癌细胞SMMC-7721中抑癌作用。联合暴露实验中,这16种MR拮抗剂混合物在低浓度下即可表现出明显的MR拮抗作用。与相加作用模型、独立作用模型方程式预测值比对,联合暴露的拮抗作用符合相加模型。MR核转移实验结果表明,抑制醛固酮诱导的MR核转移是化合物干扰MR转录活性的重要机制之一。(3)检测了 15种常用金属对GR以及MR的干扰作用。在最高无细胞毒性浓度下,15种金属均未表现出类糖/盐皮质激素活性。有7种金属盐表现出明显的GR拮抗作用,5种金属盐表现出MR拮抗作用。除了 Cu(Ⅱ)和Li(Ⅰ)以外,Ba(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Sn(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)是首次被报道可干扰GR的转录活性。同时,本研究也是首次证明Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Li(Ⅰ)、Mn(Ⅱ)和Sn(Ⅱ)暴露干扰了 MR的转录活性和MR介导的醛固酮对肝癌细胞SMMC-7721的抑癌作用。其中,Pb(Ⅱ)、Li(Ⅰ)和 Sn(Ⅱ)对GR和MR都有拮抗作用;Ba(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和 Zn(Ⅱ)只抑制GR的转录活性;而Cd(Ⅱ)和Mn(Ⅰ)只对MR有拮抗作用。
杨应成[5]2016年在《肝脏癌前病变的发生机制研究》文中认为第一部分肝脏癌前病变的发生机制研究研究背景和目的:世界卫生组织(World Health Organization,WHO)在1978年首次明确定义癌前病变(Precancerous Lesions)为“一种更容易发生恶性肿瘤的组织学改变”。癌前病变发生恶性肿瘤的风险显著高于其他组织,但并非所有的癌前病变均会进展为恶性肿瘤。高级别不典型增生结节(High Grade Dysplastic Nodules,HGDN)是肝癌的癌前病变,HGDN是指“肝组织有异型增生但又未达到恶性肿瘤标准,具有高度恶性潜能的,直径1mm以上的不典型增生结节”。HGDN是一种真正处于良恶性临界状态的肝组织,其进展为肝癌的风险显著高于其它非恶性结节,如增生性大结节(Large Regenerative Nodules,LRN)、低级别不典型增生结节(Low Grade Dysplastic Nodules,LGDN)等。据统计,HGDN患者发生肝癌的风险是LGDN的四倍,其五年内进展为肝癌的风险高达60-80%。由此可知,HGDN是调控肝脏恶性肿瘤发生的一个关键节点,如果能有效控制甚至逆转HGDN,那么就能大大降低肝癌的发病率。但是,目前与肝脏癌前病变相关的研究少之又少,其具体发生机制仍然鲜为人知。因此,我们希望通过对HGDN的形成,以及HGDN进展为肝癌的分子机制进行深入研究,寻找控制甚至逆转HGDN的分子靶标,以期最终能够降低肝癌的发病率。研究方法:1.精准获取临床HGDN组织样本:运用激光捕获显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)精准割取同一患者肝脏石蜡样本中的正常组织、HGDN组织和肝癌组织。2.HGDN组织中micro RNA表达谱鉴定:抽提LCM所获取肝组织中的micro RNA,利用micro RNA低密度表达谱芯片检测正常组织、HGDN组织和肝癌组织中的micro RNA表达特点;运用micro RNA动态网络标志物分析技术(Dynamic Network Biomarker Analysis,DNB)筛选出HGDN中异常表达的micro RNA。3.研究目标micro RNA在正常肝细胞恶性转化过程中的生物学功能:通过soft-agar克隆形成实验、皮下荷瘤实验、retrorsine小鼠肝细胞原位移植实验、分选DEN诱癌小鼠原代HGDN细胞荷瘤实验、尾静脉注射antagomir实验以及相关标志物检测等,深入研究目标micro RNA在肝细胞恶性转化过程中的相关功能。4.构建相关基因敲除小鼠并建立诱癌模型:我们构建了mi R-484组成型敲除小鼠(mi R-484-/-),并购买了Ⅰ型干扰素受体组成型敲除小鼠(Ifnar1-/-);通过对上述小鼠进行DEN诱癌,进一步研究mi R-484和Ⅰ型干扰素信号通路在肝脏癌前病变形成和肝癌发生过程中的功能及意义。5.机制探索:运用荧光定量PCR实验、报告基因实验、ELISA实验、Ch IP实验、相关抑制剂实验、基因敲除细胞实验以及敲除小鼠体内试验等,深入研究mi R-484调控肝细胞恶性转化和HGDN形成的具体分子机制。6.临床印证:通过一系列的免疫组化实验、ELISA实验以及原位杂交实验,印证本研究中相关基因在临床样本和小鼠DEN诱癌样本中的表达情况。研究结果:1.明确了肝脏癌前病变中micro RNA的表达特征,发现mi R-449b,mi R-545,mi R-484,mi R-320,mi R-625#,mi R-661和mi R-29a#等在HGDN中异常高表达。2.发现mi R-484能诱导正常肝细胞恶性转化并增强其成瘤能力。3.DEN诱癌时下调mi R-484能通过抑制癌前病变的形成影响肝癌的发生。4.mi R-484-/-小鼠DEN诱癌发现癌前病变的形成和肝癌的发生均显著减少。5.持续低剂量的Ⅰ型干扰素(IFN-I)依赖于mi R-484启动子区的H3K27高乙酰化(H3K27Ac)作用,选择性诱导mi R-484表达;而异常高表达的mi R-484能进一步诱导IFN-I生成,形成一个正反馈环路,最终促进肝细胞恶性转化。6.Ifnar1-/-小鼠DEN诱癌后,20周时,敲除组肝中mi R-484并未高表达,且其形成癌前病变明显少于野生小鼠;40周时,其肝癌的大小和数量也显著降低。7.在临床肝脏组织和血液样本中,mi R-484与IFN-I表达量相关。研究结论:本研究首次明确了肝脏的癌前病变HGDN中micro RNA的表达特征,发现了其中异常高表达的micro RNA。我们在动物水平和细胞水平证实:肝脏的慢性炎症或DNA损伤等诱导产生的低剂量I型干扰素,依赖于mi R-484启动子区H3K27Ac的作用,选择性诱导mi R-484生成;而异常高表达的mi R-484又能诱导IFN-I的生成,形成了一个正反馈环路,最终诱导正常肝细胞恶性转化,促进肝脏癌前病变的形成和肿瘤的发生。本研究首次发现低剂量的IFN-I具有促进HGDN形成和肝癌发生的作用,相关结果为控制甚至逆转肝脏的癌前病变HGDN提供了一些潜在的治疗靶标。第二部分CYP3A5在肝细胞癌中通过调控m TORC2/Akt信号通路发挥肿瘤抑制功能研究背景和目的:细胞色素P450家族通过对内源性或外源性物质的代谢在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用,其中CYP3A亚家族的作用尤为显著。CYP3A亚家族含量最多、底物谱很大,是代谢反应中最主要的限速酶之一。CYP3A亚家族包括4个主要成员,即CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。由于CYP3A7主要存在于胎肝,而CYP3A43最近才被发现,故这两个成员的具体功能尚不明确;现今关于CYP3A亚家族研究最多的是它的两个主要成员:CYP3A4和CYP3A5。其中,CYP3A4在肿瘤发生发展过程中的生物学功能已经有较为充分的研究,它能活化前致癌物,且能参与抗肿瘤药物的代谢;而CYP3A5是研究得最深入的CYP3A亚家族低丰度成员,但是相关研究仍主要集中于肿瘤发生和药物代谢这两个方面,且相关研究主要是一些流行病学统计结果,对CYP3A5在肿瘤发展过程中的具体生物学功能则缺乏深入研究。研究方法:1.利用网络基因芯片公共数据库分析发现CYP3A5在癌和癌旁的表达水平差异。2.运用免疫组织化学染色方法分析CYP3A5原位表达差异,并根据组织芯片组化染色结果进行CYP3A5与临床-病理特征的相关性分析。3.利用临床肝癌标本和不同转移能力肝癌细胞系分析CYP3A5在不同转移能力肝癌组织和细胞株中的表达水平差异。4.肝癌细胞株过表达CYP3A5后进行迁移、侵袭、粘附等转移相关表型的体外、体内实验研究。5.利用免疫印迹、si RNA、免疫共沉淀、酶谱分析、免疫组化染色等技术,深入研究CYP3A5调控肝细胞癌侵袭转移的具体分子机制。研究结果:1.CYP3A5的表达水平在肝细胞癌组织中显著低于对应癌旁组织。2.CYP3A5表达水平的高低与肝癌转移潜能呈负性相关,且与预后直接相关。3.体外实验和体内试验同时证明,过表达CYP3A5能明显抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和粘附能力。4.CYP3A5通过抑制AKT信号通路活性,调节TIMP1、TIMP2的表达和MMP2、MMP9的活性。5.CYP3A5通过单纯阻断m TORC2激酶活性而非影响m TORC2复合物结构,选择性下调AKT的磷酸化水平(Ser473)。6.CYP3A5通过诱导产生细胞内高水平的ROS抑制m TORC2的激酶活性,进而抑制AKT(Ser473)活化,最终影响肝癌的转移相关表型。研究结论:本研究发现,CYP3A5表达水平在肝细胞癌组织中较癌旁组织明显下调。我们运用大样本的肝细胞癌组织芯片验证发现,这种表达差异与肝细胞癌的转移相关临床和病理指标存在显著相关性,即CYP3A5表达水平与肝细胞癌转移潜能呈负性相关。体外和体内实验进一步证明过表达CYP3A5可以显著抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和粘附能力,且这种转移相关表型的抑制作用主要是通过下调AKT信号通路活性,上调TIMP1、TIMP2表达水平和下调MMP2、MMP9的活性来实现的。通过深入的实验研究,我们发现CYP3A5介导的AKT(Ser473)活化减弱是m TORC2/p-AKT(S473)途径依赖的。同时,我们首次报道了CYP3A5通过诱导细胞产生高水平的ROS,从而在不影响m TORC2复合物稳定性的情况下单纯抑制m TORC2的激酶活性,最终抑制了p-AKT所介导的肝细胞癌侵袭和转移。
刘东远[6]1998年在《大鼠谷胱甘肽S-转移酶P基因转录调控机制的研究》文中研究指明谷胱甘肽S-转移酶(GSTs，EC 2.5.1.18)是一个属于Ⅱ相代谢解毒酶的大的同工酶家族。它们具有多种生物学功能，既能作为代谢酶也可作为结合蛋白在多种解毒过程中发挥作用。因此在保护细胞免受内、外源毒物损伤方面起着重要作用。化学致癌过程至少包括三个阶段：启动、促进、发展。在启动阶段发生了一些特定基因表达不可逆的改变，尤其是细胞内一些原癌基因的激活。在促进阶段，许多器官在未发现恶性癌变前已经出现了一些癌前病变细胞(启动细胞)。GST的某些同工酶如GST-Pi家族的人GST-π及大鼠GST-P与细胞癌变及癌细胞的多重耐药性密切相关。尤其大鼠GST-P在化学致癌早期的癌前病变细胞(启动细胞)中表达大大升高，因此被作为癌变最稳定、最准确的标志酶之一。对GST-P酶的研究对于了解癌变过程及监测环境中化学致癌物有着积极的意义，而在癌变过程中GST-P酶含量升高主要决定于其基因转录水平的升高，因此搞清GST-P基因转录调控机制对于了解癌变过程中GST-P基因表达增强方式，了解细胞癌变机制有重要意义。 我们用高灵敏度的荧光素酶报告系统对GST-P基因上3.0kb(-2900bp／+59bp)范围内的调控元件进行了搜寻。首先我们将这一3.0kb的片段从E-CAT上切下，连接到没有启动子和增强子的荧光素酶报告基因载体pGL2-Basic中，得到重组体E-LUC。然后用外切酶Ⅲ及S1核酸酶对E-LUC内的重组片段进行缺失，得到9个缺失报告质粒。我们将其转染到HeLa细胞中。经过72小时的培养，收集细胞并测定荧光素酶的活力。结果表明，与Sakai的报道相一致，在-2.9kb到-2.3kb存在增强子元件。但此外还发现，当从-1.8kb缺失到-1.3kb，荧光素酶活性升高约4倍，表明在-1.8kb到-1.3kb之间可能存在负调控元件。
邬礼政[7]2015年在《尼古丁调控miR-30a生成影响牙周膜细胞细胞周期和炎性反应机制研究》文中研究表明牙周炎(periodontitis)作为口腔健康的头号杀手,主要由菌斑引起的直接细胞毒作用及宿主对菌斑微生物的免疫应答导致牙周组织损伤,进一步引起牙周支持组织丧失,导致牙齿缺失。越来越多的研究证实在牙周炎发生发展过程中存在多种mi RNAs的表达变化,提示它们在牙周炎发生发展中发挥着重要的作用。然而,其究竟通过何种途径来影响牙周炎的发生发展过程,尚需大量研究证实。吸烟作为牙周炎重要的危险因素,烟草中的主要成分尼古丁在牙周炎发生发展过程中发挥着重要作用。课题组前期研究通过构建牙周炎大鼠模型、体外培养人牙周膜细胞,尼古丁作用于实验性牙周炎大鼠和人牙周膜细胞后,发现烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 n ACh R)在实验性牙周炎大鼠牙周组织和和人牙周膜细胞的表达均显著升高,α7 n ACh R特异性拮抗剂α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)可拮抗该效应,进而参与吸烟相关性牙周炎发生发展过程。另有研究表明,尼古丁、α7 n ACh R可能通过调控多种mi RNAs表达水平,参与多种心血管系统、神经系统疾病的发生发展过程。然而关于尼古丁、α7 n ACh R调控mi RNAs参与牙周疾病乃至口腔疾病发生发展的研究却鲜有报道。由此,我们猜想:尼古丁激活人牙周膜细胞α7 n ACh R后可能会通过mi RNAs进一步参与吸烟促牙周组织炎性损伤和抑制牙周组织修复过程。但是其具体分子机制尚需进一步研究。本研究将深入探讨mi RNAs在吸烟相关性牙周炎发生发展中发挥的作用,为牙周炎的防治提供新的理论依据和治疗靶点。【目的】【目的】本课题拟从尼古丁调控牙周膜细胞周期进程、细胞增殖、STAT3信号通路等方面入手,系统探讨尼古丁可能通过调控牙周膜细胞mi R-30a表达水平,进而调节NF-κB-mi R-30a-STAT3反馈环路和CCNE2参与牙周组织炎性损伤和组织修复过程的机制;探索基于mi R-30a调节途径出发降低尼古丁促牙周炎患者的牙周组织损伤和抑制牙周组织修复效应,为有效预防及治疗吸烟相关性牙周炎提供新的理论依据。【方法】1.组织块法进行牙周膜细胞原代培养;在成功培养原代牙周膜细胞后进行常规传代。流式细胞实验鉴定细胞表型;待牙周膜细胞传至第五代时,给予细胞尼古丁处理,micro RNA芯片检测尼古丁处理后牙周膜细胞mi RNAs表达情况,选取与细胞增殖和炎性反应密切相关的mi RNAs进行q PCR验证,考虑到mi R-30家族成员成熟形式差异较小,故通过扩增其前体形式来比较表达差异。2.分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或mi R-30a inhibitor处理;MTT实验检测各组细胞增殖情况,流式细胞实验分析各组细胞周期分布情况,实时定量PCR检测各组牙周膜细胞mi R-30a表达情况,实时定量PCR和Western blot实验检测各组细胞CCNE2的m RNA和蛋白表达情况。构建CCNE2 3’UTR野生型和突变型报告基因载体,双荧光素酶报告基因实验验证mi R-30a是否可以直接结合CCNE2 3’UTR区;设计CCNE2干扰RNA,验证CCNE2在调节牙周膜细胞增殖和细胞周期中的作用。3.分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或mi R-30a inhibitor处理;采用实时定量PCR和Western blot实验检测各组细胞SOCS3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子m RNA和蛋白表达情况,双荧光素酶报告基因实验检测尼古丁对STAT3活性水平的影响。构建SOCS3 3’UTR野生型和突变型报告基因载体,双荧光素酶报告基因实验验证mi R-30a是否可以直接结合SOCS3 3’UTR区;设计SOCS3干扰RNA,验证SOCS3在调节牙周膜细胞JAK2-STAT3信号通路中的作用。4.尼古丁可显著上调pre-mi R-30a表达,提示尼古丁对mi R-30a的抑制作用可能发生于转录起始水平。因而,我们对mi R-30a的潜在宿主基因进行分析,发现mi R-30a宿主基因的启动子区存在转录因子NF-κB的结合位点。分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或拮抗剂10-8Mα-BTX和/或5x10-5M PDTC和/或10-6M Cucurbitacin I处理;采用实时定量PCR检测各组细胞mi R-30a表达水平,Western blot实验和双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞NF-κB p65蛋白表达水平和NF-κB活性水平。【结果】1.体外成功进行人牙周膜细胞原代培养。待细胞聚合生长至90%时,常规进行细胞传代,流式细胞实验发现细胞表面高表达间充质细胞表型CD29、CD105,低表达细胞表型CD31、CD14,提示细胞来源于间充质;给予第5代牙周膜细胞尼古丁作用后进行micro RNA芯片检测,发现有20个micro RNAs上调;16个micro RNAs下调;选择与炎性反应和细胞增殖密切相关的mi R-30a、let-7f、mi R-21及let-7e进行实时定量PCR验证,发现10-5M尼古丁可显著上调牙周膜细胞pre-mi R-30a表达水平,且呈时间依赖性;而let-7f、mi R-21及let-7e表达水平无明显规律,故最终确定mi R-30a进行深入研究。2.尼古丁可抑制牙周膜细胞增殖能力,转染mi R-30a inhibitor可逆转尼古丁对牙周膜细胞增殖能力的抑制效应,差异有统计学意义;另外,尼古丁可抑制牙周膜细胞周期蛋白CCNE2表达,诱导牙周膜细胞发生G1期阻滞,导致其合成DNA能力下降,进而影响其增殖过程。给予人牙周膜细胞转染mi R-30a inhibitor可干扰牙周膜细胞内mi R-30a的表达;进一步研究发现,抑制mi R-30a的表达可调节尼古丁影响的牙周膜细胞CCNE2表达水平,削弱尼古丁抑制的牙周膜细胞周期进程;双荧光素酶报告基因实验证实mi R-30a可直接结合CCNE2 3’UTR区,调控其表达水平;干扰CCNE2表达后,发现CCNE2是调控牙周膜细胞G1期向S期转化的关键因子,进而影响其增殖能力。3.尼古丁可激活牙周膜细胞JAK2-STAT3信号通路,参与牙周组织炎性反应过程,表现为:尼古丁可明显上调磷酸化的JAK2和STAT3蛋白表达水平和STAT3活性水平。对STAT3抑制剂Cucurbitacin I进行浓度梯度实验发现,10-5M和10-6MCucurbitacin I均可抑制磷酸化STAT3蛋白表达水平,而10-5M Cucurbitacin I细胞毒性较大,细胞坏死较多,而10-7M Cucurbitacin I抑制STAT3能力较低,故选择10-6M Cucurbitacin I作为后续的实验浓度。另外,尼古丁激活JAK2-STAT3信号通路后,还可上调下游炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平,10-6M Cucurbitacin I可拮抗尼古丁的激活效应,提示尼古丁可通过JAK2-STAT3参与吸烟相关性牙周炎炎性损伤过程。进一步研究发现,抑制mi R-30a的表达可调节尼古丁对JAK2-STAT3信号通路的激活效应,削弱尼古丁诱导的牙周组织炎性反应过程;双荧光素酶报告基因实验证实mi R-30a可直接结合SOCS3 3’UTR区,调控其表达水平;干扰SOCS3表达后,发现SOCS3是调控牙周膜细胞JAK2-STAT3信号通路激活与否的关键因子。4.Western blot和双荧光素酶报告基因实验证实尼古丁可激活牙周膜细胞NF-κB信号通路;另外,对mi R-30a宿主基因转录起始位点上游5000bp至下游1000bp的DNA区域的分析表明,在该区域里存在NF-κB结合位点;当PDTC抑制NF-κB表达后,mi R-30a的表达水平也受到抑制,提示NF-κB可能通过调控mi R-30a的启动子区影响其表达水平。而STAT3信号通路抑制剂Cucurbitacin I也能下调p65蛋白表达和NF-κB活性水平,进而构成NF-κB-mi R-30a-STAT3反馈环路参与牙周组织炎性损伤过程。【结论】1.成功培养鉴定人牙周膜细胞,micro RNA芯片和实时定量PCR实验结果发现尼古丁可能通过上调mi R-30a表达水平参与吸烟相关性牙周炎发生发展过程。2.尼古丁可通过上调人牙周膜细胞mi R-30a表达水平,来靶向下调CCNE2表达水平,促进牙周膜细胞发生G1期阻滞,进而抑制牙周膜细胞增殖能力,参与吸烟抑制牙周组织修复过程。3.尼古丁通过上调人牙周膜细胞mi R-30a表达水平,来靶向下调SOCS3表达水平,解除其对牙周膜细胞STAT3信号通路的抑制作用,导致牙周膜细胞STAT3信号通路的持续激活,进而参与吸烟促进牙周组织炎性损伤过程。4.尼古丁可能通过调节NF-κB活性水平来调控牙周膜细胞mi R-30a表达;STAT3又能反馈调控NF-κB活性水平,从而构成一个NF-κB-mi R-30a-STAT3反馈环路,参与吸烟相关性牙周炎牙周组织炎性损伤过程。
殷鹏[8]2012年在《PI3K/Akt信号通路对人肝癌细胞中胱硫醚-γ-裂解酶基因表达调控的分子机制及其生物学功能的研究》文中研究表明目前认为内源性硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后发现的第三种气体信号分子,在哺乳动物中广泛存在,并在许多生理病理过程中发挥了重要作用,例如在心血管系统、中枢神经系统以及炎症免疫调节等方面,内源性H2S都有着不同的生理功能。哺乳动物体内的H2S主要通过含硫的半胱氨酸代谢生成。胱硫醚-Y-裂解酶(cystathionine-y-lyase, CSE)是体内转硫途径的关键酶。CSE作为一种5’-磷酸吡哆醛依赖性酶,对H2S的产生以及含硫化合物的代谢具有重要的调节作用。人CSE基因定位于染色体1p31.1,其编码的CSE蛋白产物为43kDa,主要在心血管、肝脏、平滑肌等许多组织中普遍表达,并严格调控着体内的H2S水平。已发现H2S引起的细胞生物学效应主要通过CSE/H2S体系产生,包括对DNA损伤,细胞周期,细胞增殖和凋亡过程都具有调节作用。目前对H2S生物学效应的研究,主要集中在心血管系统和炎症调节等方面,而H2S在肿瘤细胞中的作用报道相对较少。有文献报道,转硫途径中代谢酶的缺乏与肿瘤的发生发展具有相关性,并且也有H2S直接影响肿瘤细胞增殖和凋亡等过程的报道。PI3K/Akt作为体内重要的信号通路,能够调控众多信号转导途径,参与细胞的生长与存活、细胞间信息传递等,异常的Akt信号通路参与肿瘤的形成与转移,具有促增殖抗凋亡等作用。因此我们关注在肿瘤发生发展中,PI3K/Akt信号转导通路与CSE基因表达调控之间可能的联系。论文第一部分,我们在8种人肝癌及永生化肝细胞株中发现CSE的蛋白质水平与PI3K/Akt信号通路具有很好的相关性,且在CSE与Akt2mRNA水平相关。在本实验室构建的稳定过表达持续性激活Akt的小鼠MEF中,CSE蛋白质和mRNA水平较阴性对照明显升高,这些结果提示我们PI3K/Akt可能对CSE基因表达的调控具有重要作用。随后,发现PI3K的特异性抑制剂LY294002能够显著下调人肝癌细胞CSE的蛋白和mRNA水平,且存在剂量和时间依赖性。我们采用对Akt的过表达及基因敲低(knockdown)技术发现PI3K的下游分子Akt也可调控人肝癌细胞CSE蛋白质和mRNA水平。而对抑癌基因PTEN进行干扰或用IGF-1、胰岛素刺激细胞能激活Akt从而促进CSE基因表达。进一步采用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞,发现LY294002不影响CSE蛋白质稳定性。以上结果说明PI3K/Akt信号通路可能在转录水平调控人肝癌细胞CSE的基因表达水平。论文第二部分,我们研究PI3K7Akt信号通路调控CSE基因表达的分子机制。首先构建了六种不同长度的人CSE基因启动子荧光素酶报告基因质粒,转染细胞后发现-592/+139bp片段的CSE基因启动子活性最强,为核心启动子片段。LY294002处理细胞能够抑制CSE基因的转录,验证了PI3K/Akt能在转录水平上调控CSE基因的表达。我们采用转录因子预测软件对核心启动子中的转录因子进行了预测,共发现包括4处Spl结合位点在内的8种常见转录因子的结合位点,我们对所有可能的结合位点一一分别进行点突变,结果证明CSE基因启动子中Spl结合位点突变后能够明显下降CSE基因启动子活性以及CSE的mRNA和蛋白质水平。其中以最靠近转录起始位点的两处Spl结合位点突变引起的CSE下调最为明显。而其他几种常见的转录因子如AP1,Oct-1,FoxD3,HNF-3β,v-Myb, c-Ets和E2F对CSE转录水平的调控作用不明显。采用直接干扰Spl水平,并结合ChIP的方法进一步证明了Spl能与CSE基因启动子区直接结合。而通过研究LY294002对CSE mRNA半衰期的影响发现,PI3K/Akt信号通路并未对CSE基因转录后水平有调控作用。以上结果说明Spl作为一种重要的转录因子在PI3K/Akt信号通路对CSE基因转录水平的调控中发挥了重要作用。论文第三部分,我们主要研究了CSE的一些细胞生物学功能。实验证明CSE表达能够影响内源性H2S浓度的高低,并且CSE能够促进肝癌肿瘤细胞增殖,而这种促增殖作用是通过对细胞周期的调节实现的,对细胞周期调节蛋白p21Wafl/Cipl的影响可能是关键因素。而在肿瘤细胞的其他生物学行为中,CSE表达对人肝癌细胞凋亡能力以及对人肝癌细胞迁移能力都没有明显影响,而我们采用EMT相关蛋白检测发现CSE在肝癌EMT的过程中也没有明显作用。综上所述,本文研究发现在人肝癌细胞中,PI3K/Akt信号通路通过转录因子Spl,在转录水平上调控CSE基因的表达,并且CSE及其催化产物内源性H2S通过对细胞周期的调节促进肝癌细胞增殖。这一发现对深入认识CSE基因在肿瘤发生发展中的作用机制具有重要意义。
邓欣[9]2008年在《正肝方对大鼠肝癌前病变及人肝癌细胞分化和端粒酶的影响》文中指出背景与目的肝细胞癌(HCC)是我国常见的肿瘤之一,恶性程度极高,易于复发、转移。其死亡率在全部恶性肿瘤中列第二位,仅次于胃癌。肝癌一旦发生,治疗非常困难,预后极差,5年生存率仅2%。因此,积极预防肝癌,研究具有阻断或抑制肝癌发生的药物,不仅具有重要的学术价值,而且可以产生巨大社会经济效益。由于肝癌的发生、发展是一个多阶段的过程,在肝癌形成以前通常会经历一个较长的肝癌前病变过程。因此,如能延缓或阻断肝癌前病变的形成,就有可能阻断肝癌的发生。肝癌前病变在病理学上主要表现为肝细胞非典型增生,而细胞增殖失控和分化障碍是肿瘤的基本特征,所以寻找能抑制肝细胞恶性增殖和诱导其分化的药物,对肝癌的化学预防具有重要的价值。近些年来,中医药在预防肝癌发生方面进行了一些研究探索,并显现出较好的研究前景。已有较多研究发现一些中药具有一定程度的预防肝癌的作用。然而,由于研究周期长、作用因素复杂、对象不易控制等诸多原因,使得中医药在预防肝癌的临床和基础方面的研究较少,能够经得起实验重复和临床验证的中药复方更少。至今未见一种公认有效的肝癌预防制剂应用于临床。正肝方是针对肝癌的中医病机特点组方而成的中药复方,该方主要由黄芪、丹参、鳖甲、女贞子、半枝莲、白花蛇舌草等组成,具有活血软坚、益气养阴、清热解毒的功效。本研究采用组织化学、免疫组化、RT-PCR、PCR-ELISA等方法观察了正肝方对黄曲霉毒素B_1(AFB_1)诱发的大鼠肝癌前病变的影响,以及正肝方药物血清对人肝癌细胞分化和端粒酶的影响,以明确正肝方对肝癌的预防作用及其主要作用机制。本研究为将正肝方开发为肝癌预防新药,在临床上推广应用,提供一定的理论依据。材料与方法1.动物体内实验Wister雄性大鼠100只,随机分为4组:模型对照组(A组)30只、正肝方小剂量预防组(B组)30只、正肝方大剂量预防组(C组)30只、正常大鼠对照组(D组)10只。除正常大鼠对照组外,先后用AFB_1和2-乙酰氨基芴(2-AAF)处理各组大鼠造模。正肝方大、小剂量预防组在造模期间,将正肝方水剂(单味免煎中药粉剂按比例称取,用无菌蒸馏水溶解,配成0.3g/ml和0.6g/ml的水剂)按10ml/kg分别灌喂大鼠;模型对照组(A组)用无菌蒸馏水按10ml/kg灌喂大鼠。8周后处死大鼠,采血,取肝组织标本。将肝组织标本分别HE染色和铀铅染色,光镜、电镜病理观察;采用组织化学法结合电脑图象分析检测肝组织γ-谷氨酰转移酶(GGT)阳性灶、免疫组织化学法(IHC)检测肝组织谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-P)阳性灶、增殖细胞核抗原(PCNA)、甲胎蛋白(AFP)、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)和细胞周期蛋白D_1(Cyclin D_1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK_4)蛋白表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测肝脏组织IGF-Ⅱ、Cyclin D_1和CDK_4基因表达;比色法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、GGT、总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)生化指标。2.体外血清药理实验正肝方水煎剂(1.5g/ml),灌喂正常大鼠,每日2次,连续3d,于第4d,1次给予全日剂量后1h采血,制备药物血清,药物血清经56℃灭活30min。以正常鼠血清为阴性对照,维甲酸为阳性对照,将药物血清温育Bel-7402人肝癌细胞。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖,图象分析系统测定细胞核质比,放射免疫法测定细胞分泌的AFP含量,动态比色法测定细胞内GGT和ALP活性,多聚酶链反应—酶联免疫吸附法(PCR-ELISA法)检测细胞端粒酶活性。结果1.动物体内实验1.1各组大鼠一般情况动物实验开始时,各组大鼠体重大小较一致,无统计学差异(P＞0.05)。在整个实验过程中,正常对照组的大鼠体重增长大于造模组(P＜0.01);模型组(A组)、正肝方小剂量组(B组)和大剂量组(C组)3组间大鼠生长情况相似,体重增长无差异显著性(P＞0.05)。表明正肝方无论是大剂量还是小剂量,对大鼠都是安全的,没有明显的毒副作用。实验结束时,A组死亡12只,B组15只,C组13只,D组无死亡。1.2各组大鼠肝组织形态及细胞超微结构变化光镜下:A、B、C组大鼠的肝组织切片(HE染色)可见到散在的,大小不等的增生肝细胞灶或结节;肝细胞增生灶多少不等,A组最多,C组最少;灶/结节内以嗜碱性肝细胞为主,个别灶内肝细胞浊肿变形、点状坏死;部分灶/结节内肝细胞异型,体积变大,见少量双核、核深染、巨核细胞。电镜下:增生灶内肝细胞可见细胞器排列集中,胞质内含大量线粒体,粗面内质网扩张。细胞核大,不规则,核仁突出,部分细胞双核,可见两个以上核仁,染色质疏松,边集。1.3各组大鼠肝组织GGT和GST-P阳性灶的比较正肝方小剂量组的每个GGT灶面积(mm~2/个)少于模型组(P＜0.05),但单位面积GGT灶个数(个/cm~2)、单位面积灶的总面积(mm~2/cm~2)无明显减少(P＞0.05)。正肝方大剂量组的单位面积GGT灶个数、单位面积灶的总面积和每个灶面积与模型组比均显著减少(P＜0.01)。与小剂量组比,正肝方大剂量组的GGT灶个数、灶的总面积和每个灶面积显著减少(P＜0.01),提示正肝方减少AFB_1诱发的大鼠肝组织GGT灶面积的作用有一定的量效关系。与模型组比,正肝方小剂量组的每个GST-P灶面积(mm~2/个),单位面积GST-P灶个数(个/cm~2)、单位面积灶的总面积(mm~2/cm~2)无明显减少(P＞0.05)。正肝方大剂量组的单位面积GST-P灶个数、单位面积灶的总面积和每个灶面积与模型组比均显著减少(P＜0.05或P＜0.01),提示大剂量正肝方具有抑制癌前病变肝组织GST-P灶的作用。1.4各组大鼠肝功能的比较与模型组比较,正肝方小剂量组和大剂量组的ALT、GGT、TBIL值显著降低(P＜0.01或P＜0.05),大剂量组的AST、ALP值也显著低于模型组(P＜0.01或P＜0.05)。与小剂量组比较,大剂量组的ALT值显著低于小剂量组(P＜0.01),表现出一定的量效关系。以上提示:正肝方能保护肝功能,减轻AFB_1和2-AAF导致的肝损伤作用。1.5各组大鼠肝组织PCNA、AFP免疫组化染色结果正肝方大剂量组PCNA和AFP染色的阳性单位(PU)值较模型组均显著降低(P＜0.01或P＜0.05),大剂量组PCNA和AFP染色的标记指数(LI)值也低于模型组(P＜0.01)。提示大剂量正肝方能有效降低大鼠癌前病变肝组织PCNA和AFP的表达,减轻大鼠癌前病变肝细胞的异常增生。1.6各组大鼠肝组织Cyelin D_1、CDK_4表达情况正肝方小剂量组和大剂量组Cyclin D_1染色的LI和PU值较模型组均显著降低(P＜0.01),大剂量组Cyclin D_1染色的PU值也低于小剂量组(P＜0.05),呈现出一定的量效关系;正肝方小剂量组和大剂量组CDK_4染色的PU值均较模型组显著降低,大剂量组PU值也低于小剂量组。正肝方小剂量组和大剂量组的Cyclin D_1和CDK_4 mRNA表达水平较模型组表达水平均显著降低(P＜0.01)。提示大剂量正肝方能降低大鼠癌前病变肝组织Cyclin D_1、CDK_4蛋白和mRNA异常高表达水平。1.7各组大鼠肝组织IGF-Ⅱ表达情况与模型组比较,正肝方小剂量组和大剂量组的PU值显著降低(P＜0.01或P＜0.05),大剂量组的LI值也低于模型组(P＜0.05)。与模型组比较,对照组IGF-ⅡmRNA相对表达水平最低(P＜0.01),正肝方小剂量组和大剂量组的IGF-ⅡmRNA表达水平显著降低(P＜0.01)。与小剂量组比较,大剂量组的IGF-ⅡmRNA表达水平亦显著低于小剂量组(P＜0.01),呈现出一定的量效关系。提示正肝方能降低大鼠癌前病变肝组织IGF-Ⅱ蛋白和mRNA异常高表达水平。2.体外血清药理实验2.1药物血清对Bel-7402细胞增殖的影响(MTT比色法)对照组、正肝方组、维甲酸组A_(490)值分别为1.704±0.102、1.483±0.077、1.510±0.104。与对照组比,正肝方药物血清组A值显著降低(P＜0.01)。提示正肝方可抑制Bel-7402细胞的增殖。2.2药物血清对Bel-7402细胞核质比的影响对照组、正肝方组、维甲酸组Bel-7402细胞核质比分别为1.04±0.09、0.71±0.07、0.69±0.08。与对照组比,正肝方药物血清组和维甲酸组核质比显著降低(P＜0.01)。提示正肝方可降低Bel-7402细胞核质比。2.3药物血清对Bel-7402细胞分泌AFP的影响对照组、正肝方组、维甲酸组Bel-7402细胞AFP分泌量(ng/10~6)分别为22.58±2.68、14.60±1.85、13.50±2.50。与对照组比,正肝方药物血清组和维甲酸组AFP分泌量显著低于对照组(P＜0.01),表明正肝方和维甲酸均可抑制Bel-7402细胞分泌AFP。2.4药物血清对Bel-7402细胞GGT和ALP活性的影响与对照组比,正肝方药物血清组和维甲酸组细胞内GGT活性明显降低(P＜0.05),ALP活性显著增高(P＜0.01)。提示正肝方可降低Bel-7402细胞内GGT活性,升高ALP活性。2.5药物血清对Bd-7402细胞端粒酶活性的影响Bel-7402对照组、正肝方组A_(450)值分别为0.929±0.066、0.360±0.105。两者比较,正肝方药物血清组端粒酶活性显著低于Bel-7402细胞对照组(P＜0.01),即正肝方可抑制Bel-7402细胞的端粒酶活性。结论正肝方具有预防化学致癌物引起的肝癌前病变作用,其机理可能是通过影响IGF-Ⅱ癌基因及蛋白的异常表达,经内源性调控和(或)外源性调控作用于细胞增殖周期,抑制肝细胞增殖活性,阻断肝细胞异常增生,起到延缓或阻断肝癌前病变发生、发展的作用。此外,正肝方具有诱导Bel-7402人肝癌细胞分化的作用,其机理可能是抑制了Bel-7402细胞端粒酶活性。
杜锐[10]2009年在《microRNA在乙肝病毒复制中的作用及机制研究》文中研究指明【背景】乙肝病毒相关性疾病包括由乙肝病毒(HBV)引起的急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝细胞肝癌等,严重威胁着人类的健康。我国是肝病大国,乙型肝炎病毒携带者有1.2亿之众,约占我国全部人口的9%。慢性乙肝和肝硬化患者有3000万之多。乙型肝炎一旦慢性化,10-20%可发展为肝硬化,1%-5%可演变为肝癌。我国每年因肝硬化和肝癌死亡人数超过30万,其中肝癌死亡人数达18万,目前这一数目还呈上升趋势。肝病已经成为当今威胁中国人口健康的主要疾病之一,数量巨大的慢性肝病患者的存在,以及每年新发现肝炎病例的出现,给国家经济带来了沉重的负担。尽管干扰素和核酸类似物的应用可以抑制乙肝病毒在体内的复制,但不能有效清除体内的乙肝病毒,同时长期用药的各种副作用以及病毒突变和停药后的复发等严重影响治疗效果,因此寻找新的抗病毒治疗方法和新的抗病毒治疗靶点是当务之急。microRNA (miRNA)是近年来发现的一类广泛存在于动植物体内的非编码小RNA,在转录后水平负性调控基因的表达。据预测,每个miRNA可以调控超过200个基因的表达,人类基因组序列可以编码超过1000个以上的miRNAs,这些miRNAs可调控超过1/3的蛋白编码基因的表达,影响着几乎所有的信号通路。miRNA已被证实不仅广泛参与个体发育,器官形成,物质代谢等生理过程,且和肿瘤发生、病毒复制等病理过程密切相关。病毒复制和宿主细胞的多种因素有关,因此病毒生命周期也极有可能利用miRNA这种调控方式。事实上,已有确切的证据证明病毒基因组本身能编码大量的miRNA,通过和病毒或宿主细胞编码的靶基因结合,而达到免疫逃逸或对抗宿主细胞的抗病毒效应。同时宿主miRNA能调节病毒基因的表达而调控病毒的复制,病毒利用这些宿主细胞的miRNA通路而促进病毒在体内的复制。在宿主细胞和病毒的对抗网络中,miRNA发挥极其重要的调节作用。因此,我们推测存在着这么一类miRNA分子,能通过调节HBVmRNA、HBV编码的蛋白质,或者是宿主细胞内病毒复制相关的蛋白质的表达,而调控HBV在体内的复制。到目前为止,miRNA在乙肝病毒复制中的作用及机制尚未见报道。【目的】探讨内源性的miRNA在乙肝病毒复制中的调节作用及其分子机制,以期从新的角度阐明乙肝病毒体内复制的机制,并为寻找新的抗病毒治疗靶点提供理论依据。【方法】1.通过miRNA芯片检测乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15及其亲本细胞HepG2的miRNA表达谱,寻找差异表达的miRNA;2.利用real-time RT-PCR法对miRNA芯片结果进行验证;3.通过细胞转染,利用miRNA特异的前体寡核苷酸分别上调HepG2.2.15细胞中miRNA的表达,miRNA特异的反义寡核苷酸抑制物分别下调HepG2.2.15细胞中miRNA的表达;4.通过MTT试验检测miRNA对肝癌细胞体外增殖能力的影响;5.通过实时荧光PCR检测miRNA对乙肝病毒DNA水平的影响,实时荧光PCR检测miRNA对乙肝病毒mRNA水平的影响,ELISA检测miRNA对乙肝病毒蛋白水平的影响;6.利用生物信息学网站或软件预测miR-501/let-7a可能调控的靶基因;7.利用Western blot、RT-PCR以及荧光素酶报告基因实验验证miR-501/let-7a调控的靶基因;8.通过流式细胞术分析let-7a对肝癌细胞细胞周期的影响,Western blot检测let-7a转染的肝癌细胞系周期相关蛋白的表达;9.克隆HBV核心启动子以及增强子的不同截短体,荧光素酶报告基因实验检测let-7a对其调控作用;10.构建miR-501靶基因HBXIP的siRNA载体,和miR-501抑制剂共转染肝癌细胞系,分别检测HBVDNA、mRNA和蛋白水平的变化,探讨miR-501-HBXIP通路在HBV复制中的作用;11.构建Ras的负显性突变体,和let-7a抑制剂共转染肝癌细胞系,分别检测HBVDNA、mRNA和蛋白水平的变化,探讨let-7a-Ras通路在HBV复制中的作用。12.收集肝癌手术患者新鲜癌旁肝硬化组织,实时荧光定量PCR检测miR-501/let-7a在组织中的表达,分析miR-501/let-7a的表达和HBV复制状态之间的关系。【结果】1. 10个miRNAs在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15和其亲本细胞HepG2中差异表达(>2倍),其中5个分子在HBV感染的HepG2.2.15细胞系上调,分别为hsa-miR-18a*,hsa-miR-431,hsa-miR-302b*,hsa-let-7a,hsa-miR-501;5个分子表达下调,分别为hsa-miR-148a,hsa-miR-320,hsa-miR-503,hsa-miR-519e*,hsa-miR-448;2. Real-Time RT-PCR结果显示:hsa-miR-18a*,hsa-miR-431,hsa-let-7a,hsa-miR-501在HepG2.2.15细胞系表达上调,hsa-miR-148a,hsa-miR-320,hsa-miR-503,hsa-miR-519e*,hsa-miR-448在HepG2.2.15细胞系表达下调,与芯片结果一致;3.适时荧光定量PCR实验结果显示,miR-501,let-7a的抑制剂显著抑制HBV DNA的水平,而miR-503,miR-519e*,miR-448以及miR-320的前体分子对乙肝病毒DNA水平没有影响,进一步适时荧光定量PCR和ELISA的结果表明miR-501,let-7a的抑制剂能显著抑制乙肝病毒mRNA和蛋白水平,并且具有时间依赖性;4.生长曲线实验表明,let-7a的抑制剂能促进肝癌细胞体外增殖能力,而miR-501的抑制剂则对肝癌细胞的增殖能力没有影响,因为,我们认为miR-501,let-7a能促进乙肝病毒的体外复制;5.生物信息学预测的众多miR-501的靶基因中包括已明确的乙肝病毒复制抑制分子HBXIP,而let-7a的预测靶基因中包括乙肝病毒mRNA序列和已明确的乙肝病毒复制相关分子Ras;6.与对照细胞相比,转染miR-501特异性抑制剂的HepG2.2.15细胞的HBXIP蛋白水平明显降低,而mRNA水平则无显著差异。miR-501通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的HBXIP 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达;7. HBXIP siRNA能有效抑制HBXIP蛋白的表达,并能逆转miR-501的抑制剂对乙肝病毒复制的抑制效果; 8.根据计算机预测,let-7a可能直接作用于乙肝病毒mRNA序列,将let-7a的潜在作用靶点克隆入报告基因载体,双荧光素报告基因结果表明,let-7a不能直接作用于乙肝病毒mRNA序列。与对照细胞相比,转染let-7a反义抑制物的HepG2细胞的K-Ras蛋白水平明显升高,而mRNA水平则无显著差异。let-7a通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的K-Ras 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达;9.流式细胞术检测周期发现,let-7a抑制剂促进肝癌细胞G1-S期进展,Western blot结果发现,CDK6, CCNJ等周期相关蛋白受let-7a负性调控;10. let-7a的抑制剂有效抑制乙肝病毒核心启动子和增强子的活性,发挥类似Ras通路的功能,负显性突变的Ras能逆转let-7a的抑制剂对乙肝病毒复制的抑制作用。11新鲜临床标本检测let-7a和miR-501的结果表明:let-7a和miR-501在乙肝病毒高复制的临床标本肝硬化组织明显高于乙肝病毒低复制的临床标本。【结论】1. miRNA在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系和其亲本细胞中差异表达,可能参与乙肝病毒的复制;2. miR-501能促进乙肝病毒的体外复制,miR-501在临床标本中的表达和HBV复制状态呈正相关,其可能的分子机制是:miR-501负性调控靶基因HBXIP的表达而促进HBV的复制;3. let-7a能促进乙肝病毒的体外复制,let-7a在临床标本中的表达和HBV复制状态呈正相关,let-7a并不能通过直接作用于HBVmRNA而影响病毒复制,可能通过两条通路促进病毒复制:一是负性调控周期相关蛋白,使肝癌细胞处于静止期,病毒复制增强;二是抑制Ras蛋白及其下游通路,间接通过HBVmRNA的核心启动子和增强子而促进病毒复制。
参考文献：
[1]. 肝癌癌蛋白p28~（GANK）增强细胞氧化应激耐受的作用与机制研究[D]. 杨广珍. 第二军医大学. 2011
[2]. 胰岛素调控大鼠肝癌细胞系报告基因表达的研究[D]. 冯凯. 中国协和医科大学. 2000
[3]. 基础免疫[C]. 佚名. 第七届全国免疫学学术大会论文集. 2010
[4]. 糖皮质激素受体和盐皮质激素受体介导的典型农药和金属的内分泌干扰效应的体外评价[D]. 张剑云. 浙江大学. 2017
[5]. 肝脏癌前病变的发生机制研究[D]. 杨应成. 第二军医大学. 2016
[6]. 大鼠谷胱甘肽S-转移酶P基因转录调控机制的研究[D]. 刘东远. 中国协和医科大学. 1998
[7]. 尼古丁调控miR-30a生成影响牙周膜细胞细胞周期和炎性反应机制研究[D]. 邬礼政. 第四军医大学. 2015
[8]. PI3K/Akt信号通路对人肝癌细胞中胱硫醚-γ-裂解酶基因表达调控的分子机制及其生物学功能的研究[D]. 殷鹏. 复旦大学. 2012
[9]. 正肝方对大鼠肝癌前病变及人肝癌细胞分化和端粒酶的影响[D]. 邓欣. 湖北中医学院. 2008
[10]. microRNA在乙肝病毒复制中的作用及机制研究[D]. 杜锐. 第四军医大学. 2009
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