宋莉莉[1]2001年在《细胞外pH值对培养的主动脉平滑肌细胞膜电位及钾通道活动的影响》文中研究说明酸碱平衡是人体维持内环境稳定的一个重要因素。正常细胞外液pH值（pH_o）为7.35-7.45。在一些病理或生理条件下，如组织缺氧、酸中毒或碱中毒等，pH_o可在6.5～8.1之间波动，并由此引发血管张力的改变。pH_o引起的血管张力改变，在不同组织，不同血管节段的表现也不同，如在肺动脉，pH_o降低使之收缩，而在脑血管中，pH_o的降低则导致血管的舒张，其机制还未完全明了。有人认为pH_o是通过改变内皮源性血管活性物质的释放而影响血管的舒缩状态的；也有人认为pH_o是通过细胞内pH值（pH_i）影响细胞代谢及信号传递途径从而改变血管平滑肌细胞张力的；还有实验表明pH_o可以直接作用于血管平滑肌细胞，改变其舒缩状态从而调节血管张力，这种作用与血管平滑肌细胞上钾通道的功能状态有密切的关系。目前对pH_o影响肺、脑及肠系膜等阻力血管张力的研究较多，pH_o调节大血管张力的机制，尤其是离子机制还不明了。 为了进一步探究pH_o调节血管张力的离子机制，本实验以主动脉平滑肌细胞为实验对象，采用细胞培养及全细胞膜片钳技术，研究pH_o的改变对主动脉平滑肌细胞上钾通道活动的影响。本实验是国家自然科学基金《流量依赖性血管张力调节的离子机制研究》（39800226）中的一部分，为进一步通过细胞共培养技术研究pH_o调节血管张力的机制奠定了基础。 实验方法 1、采用组织块法培养SD大鼠乳鼠的主动脉平滑肌细胞，通过免疫组织化学方法进行鉴定。此外，应用消化法培养了小牛主动脉、肺动脉的内皮细胞和乳鼠脑微血管内皮细胞。为下一步研究血管异质性对pH_o引起血管张力改变的影响作好准备。 2、采用全细胞膜片钳技术检测SD大鼠乳鼠主动脉平滑肌细胞第四军医大学航空临床医学教研室 硕士学位论文的膜电位及钾通道的活动情况，钳制电压660mV，阶越电压为 10mV，共 13个刺激电压，刺激电压从660mV～＋60mV。并应用钾通道特异性阻断剂（如 TEA、4AP等）确定钾通道的类型。采用全细胞膜片钳技术记录视网膜微血管内皮细胞株RF历A的膜电位及进行膜上电流观察。 3、采用全细胞膜片钳技术研究p民的急、慢性改变对乳鼠主动脉平滑肌细胞上钾通道功能状态的影响。（）急性pH。改变：使细胞顺次暴露于pH7．2－pH6．5一pH7．2的细胞外液中，或是pH7．2～pHS．1一PH7．2的细胞外液中。（2）慢性PHo改变：将细胞原代培养于CO。浓度为8．8％的孵箱中，第7天进行传代，取第8天（传代后第2夭）的细胞，进行膜片钳实验。在另一些实验中，细胞外液中包含TEA 门）或4APu L 观察对电流改变的影响，从而确定所涉及的通道类型。 实验结果 1、成功培养并鉴定了乳鼠主动脉平滑肌细胞、小牛主、肺动脉内皮细胞及乳鼠脑微血管内皮细胞。 2、用全细胞膜片钳记录的电流钳制方式测得SD大鼠7日龄乳鼠主动脉平滑肌细胞的静息膜电位为上7土smV（n＝30人 观察到SMC上主要存在的钾通道电流为 K山，对 TEA门）敏感，对 4－APu）不敏感。ACh对该通道电流无明显作用。RF／6A细胞膜电位有两个高峰，峰值约为毛5mV和巧5mV。膜上存在叁种钾通道电流：钙激活性钾通道（Ko＼瞬时外向性钾通道（K／及内向整流性钾通道（K；＊。 3、在急性PH。改变中，PHo减低使主动脉平滑肌细胞膜超极化，钾电流增大。而升高则使膜去极化，钾电流减小。TEA门）能够阻断这种改变，而4AP（smM）对此没有影响。在慢性实验中，孵箱中CO。浓度升高使膜去极化，钾电流减小。 结论 实验观察到SD大鼠乳鼠主动脉平滑肌细胞上主要存在的钾通道 ．3．第四军医大学航空临床医学教研室 硕士学位论文为K门通道，在个别细胞上见到Kv通道。这可能与物种及年龄有关，也是血管异质性在离子水平上的表现。pH。改变引起钾电流及膜电位的变化，提示p民影响血管张力的机制之一是通过改变其平滑肌细胞上钾通道活动来实现的。而急、慢性pH。降低对钾电流的作用相反，可能是因为pH；的介入改变了细胞的代谢状态，或是细胞的一种适应性反应。
牛龙刚[2]2014年在《酸中毒对大鼠冠脉平滑肌张力的影响及机制研究》文中研究说明研究背景：生理性事件或病理性疾病都可导致机体重要脏器如心脏和脑对能量的需求增加,高耗能组织短期或长期内对能量的过多需求,可导致有氧的叁羧酸循环不能提供足够的能量,进而无氧的糖酵解过程增强,其提供能量的同时产生大量的酸性代谢产物如丙酮酸、乳酸等释放入血引起酸中毒。在心肌梗塞发生时,局部的缺血缺氧导致局部较严重的酸中毒,由于循环障碍时不利于代谢产物排出,酸中毒对局部组织的影响会较大,尤其是对CA ASMCs和心肌细胞。研究表明,在猪CA、家兔CA、大鼠肠系膜动脉和主动脉酸中毒可引起动脉平滑肌张力减弱,在大鼠肺动脉和CA酸中毒能够引起动脉平滑肌张力增强。尤其是对大鼠CA的酸中毒研究存在争议,相关研究认为酸中毒舒张大鼠CA,引起冠脉流量增大。导致酸中毒对不同种属动物动脉以及同一种属如大鼠不同动脉作用差异的机制至今仍未阐明。更重要的是,目前已有研究表明酸中毒可造成心肌细胞受损,适当的碱化治疗对心肌细胞有保护作用,那么心梗时CA再通以及酸中毒的及时纠正对心梗后心肌损伤的恢复可能是非常重要的。因此,阐明酸中毒对CA张力的影响如何及其机制,以及其对不同动脉张力差异性影响的原因将有利于给临床缺血缺氧性疾病的治疗提供参考依据。研究目的：1.研究酸中毒对大鼠CA张力的影响,包括其对CA基础张力的影响,以及酸中毒条件下,CA对血管活性物质肌源性反应的影响如何。2.研究相同酸中毒条件下,大鼠CA, RIA和MA肌源性反应的异同点及其机制。3. ASMCs的L-型钙通道和Kv通道是调节动脉张力的重要通道,这些通道受酸中毒影响时其电流大小有何变化。4.酸中毒发生时极易影响到ASMCs pHin值,而pHin值的稳态受到细胞膜上酸碱转运体的调节,本文进一步研究酸碱转运体抑制剂对酸中毒所致的动脉张力变化、ASMCs [Ca2+]in和pHin值变化的影响。5.阐明酸碱转运体与pHin值、[Ca2+]in和CA张力之间的关系。研究内容及方法：采用体重为200～220克成年♂Wistar大鼠,从器官、组织和细胞叁个水平研究酸中毒对冠脉张力的影响及其机制。第一部分采用离体心脏恒压Langendorff灌流的方法观察酸中毒对CPF的影响。同时,为了排除心肌收缩力和心率变化对CPF的影响,采用离体CA插管恒压灌流的方式观察酸中毒时CA直径的变化。第二部分采用离体动脉环张力记录法,观察酸中毒时CA、RIA和MA基础张力的变化,以及其对CA由缩血管剂引起的收缩反应曲线的影响。观察外钙内流和内钙释放在酸中毒引起CA收缩过程中的作用。观察酸碱转运体抑制剂如：1μM州或3μM Lans、10μM Amil、10μM IDIS和1μM KB R7943对酸中毒引起CA收缩的影响。第叁部分观察酸中毒对CA、RIA和MA的ASMCs形态的影响。同时利用全细胞膜片钳技术,观察pHex值和pHin值变化对CA ASMCs LTCC通道的影响以及pHex值变化对Kv通道的影响。为了探索pHex值变化对pHin值影响以及酸碱转运体在此过程中的作用,观察酸碱转运体抑制剂如：1μM或3μM Lans、10μM Amil、10μM DIDS和1μM KB R7943对酸中毒引起的ASMCs [Ca2+]in和pHin值变化的影响。研究结果：1.酸中毒可使离体灌流心脏的LVP降低和CPF减小。在离体插管恒压灌流的CA可观察到CA直径随酸中毒程度增加而逐渐变小。2.在离体动脉环实验中,结果显示酸中毒仅仅引起CA基础张力升高,而对RIA和MA的张力没有影响。在相同酸中毒的条件下,由KCl或U46619引起的CA收缩反应明显增强。3.在酸中毒引起CA收缩的过程中,外Ca2+内流所起作用比内Ca2+释放要大。4.酸碱转运体抑制剂尤其是质子泵和Na+/HCO3-转运体的抑制剂明显抑制酸中毒引起的CA收缩,其中DIDS的作用较强。Na+/Ca2+交换体抑制剂KB R7943的作用也较明显,但远不及DIDS。5.急性分离单细胞实验结果表明,酸中毒特异性地使CA ASMCs的长度缩短和面积变小。6. pHex值降低可使CA ASMCs的Ba2+电流增强,相反可使MA ASMCs的Ba2+电流减弱,而对RIA ASMCs的Ba2+电流幅度没有显着影响。而pHin值降低时对Ba2+电流抑制作用和其升高对Ba2+电流增强作用,在CA和MA ASMCs是一致的。7. pHex值降低可抑制CAASMCs的Kv通道电流,而对RIA和MA的Kv通道电流没有显着影响。8. pHex值降低也可特异性地使CAASMCs [Ca2+]in升高,而对RIA和MA ASMCs [Ca2+]in没有显着影响。酸碱转运体抑制剂如质子泵抑制剂Lans和Na+/HCO3-转运体抑制剂DIDS可抑制酸中毒所致的[Ca2+]in的升高,其中DIDS的作用最强,而Amil对[Ca2+]in的变化几乎没有影响。9. pHex值降低可使CA ASMCs pHin值升高,相反使MAASMCs的pHin值降低。酸碱转运体抑制剂DIDS可使pHex值降低引起的CA ASMCs pHin值的升高作用受到抑制,Lans的此作用次之,而Amil的作用不显着。结论：酸中毒可引起或促进RCA的收缩,而对RIA和MA的静息张力没有显着影响。细胞外酸中毒增强RCAASMCs的LTCC电流和抑制其Kv电流,细胞外酸化或细胞内碱化可增强RCAASMCs的LTCC电流。细胞外酸化引起CAASMCs细胞内碱化,其碱化程度受到酸碱转运体抑制剂尤其是Na+/HCO3转运体和质子泵抑制剂的影响。据此我们推测,酸中毒引起RCA收缩、RCA ASMCs pHin值升高和电生理学的改变与细胞膜上的Na+/HCO3-转运体和质子泵有关。
曹庆玲[3]2007年在《几种因素对大鼠离体血管环张力影响的初步研究》文中进行了进一步梳理二氧化硫(SO_2)是大气中最普遍的污染物之一，其毒理学作用已引起人们的广泛注意。近年来我室对SO_2的毒理学研究表明SO_2是一种全身性毒物，并且最近研究发现，吸入SO_2或将其衍生物腹腔注射对大鼠有明显的降压作用。目前，双氧水作为防腐剂、添加剂用于我们日常饮食中；由于饮食和环境因素的改变，酸性体质人群趋于增加，这对人体是有害的；KCl在很多方面也有应用，其与高血压的关系也有研究，但结果不大一致。本实验中，我们对SO_2衍生物的降压途径和作用机理进行以下的研究，并且对pH值、双氧水及KCl对血管张力的影响也进行了以下研究。1．SO_2衍生物作用后血管组织环核苷酸与TXA_2、PGI_2代谢改变及意义观察SO_2衍生物对胸主动脉血管环张力的影响，采用放射免疫法检测血管组织环腺苷酸(cAMP)、环鸟苷酸(cGMP)、前列环素(PGI_2)和血栓素(TXA_2)的稳定代谢产物6-酮-前列腺素F_(1α)(6-Keto-PGF_(1α)，简称为6-Keto)和血栓素B_2(TXB_2)的含量。结果：①SO_2衍生物对去甲肾上腺素(NE)预收缩的内皮完整和去除内皮的大鼠胸主动脉血管环均呈浓度依赖性舒张作用，且其张力变化在内皮完整与去内皮的血管环之间无显着性差异；②SO_2衍生物可引起血管组织中cAMP、6-Keto(即PGI_2)含量剂量依赖性增加，其增加程度与内皮无关；③SO_2衍生物对血管环cGMP含量呈降低趋势但在统计学上无显着意义，且对去除内皮血管无显着影响；④SO_2衍生物对去内皮或内皮完整血管环的TXB_2含量均无明显影响；⑤无论是否去除内皮，SO_2衍生物均可引起cAMP／cGMP和6-Keto／TXB_2比值显着升高。结论：①SO_2衍生物可能是直接作用于血管平滑肌而引起血管舒张，其血管舒张作用与内皮无关；②SO_2衍生物作用于胸主动脉血管环产生PGI_2，同时cAMP参与了其细胞内信号转导过程，且PGI_2和cAMP含量的增加与内皮无关。2．pH值对大鼠离体血管环张力的影响观察血管环张力的变化，采用硝酸还原酶法及高效液相色谱法(HPLC)分别测定血管组织中NO含量及亚硫酸盐含量。结果：①NE预收缩后，pH值降低对内皮完整和去除内皮胸主动脉血管环呈舒张作用；pH值升高对内皮完整和去除内皮胸主动脉血管环呈收缩作用；内皮完整组与去内皮组相比无显着性差异；②pH降低和升高对内皮完整和去除内皮血管环中NO含量无显着性影响；③pH降低和升高均可使内皮完整血管组织中亚硫酸盐含量减少，对去内皮血管中亚硫酸盐无显着性影响。结论：①pH可能是直接作用于血管平滑肌而引起血管舒张和收缩，其舒缩血管作用与内皮无关；②一氧化氮可能没有介导pH引起的血管舒张和收缩作用；③pH降低和升高可使得内皮完整血管环亚硫酸盐降低，亚硫酸盐的改变也可能介导了血管的舒张和收缩。3．双氧水对大鼠离体血管环张力的影响方法同2，结果：①NE预收缩后，加入10000μmol／L H_2O_2，内皮完整血管环表现为舒张作用；加入100μmol／L H_2O_2后血管环表现为收缩作用；H_2O_2对去内皮的血管环同样具有上述作用，与内皮完整组相比差异显着；②10000μmol／L H_2O_2可使得内皮完整及去内皮血管环中NO含量升高；100μmol／L H_2O_2可使得NO含量降低。去内皮组与内皮完整组相比具有显着性差异；③10000μmol／L H_2O_2可使得内皮完整血管环中亚硫酸盐含量升高；100μmol／L H_2O_2可使得内皮完整血管中亚硫酸盐含量降低。去内皮血管环在双氧水作用下，亚硫酸盐没有发生显着性变化。结论：①H_2O_2引起血管舒张和收缩与内皮有关；②一氧化氮可能介导了H_2O_2引起的血管舒张和收缩作用；③亚硫酸盐的改变也可能介导了H_2O_2引起的血管舒张和收缩。4．KCl对大鼠离体血管环张力的影响方法同2，结果：①血管稳定后加入KCl，内皮完整及去内皮血管环均呈浓度依赖性收缩；内皮完整组与去内皮组相比无显着差异；②KCl对内皮完整胸主动脉中NO含量没有明显影响，可使得去内皮后血管中NO含量降低；内皮完整组与去内皮组相比差异显着；③KCl对内皮完整血管中亚硫酸盐含量无显着性影响，但可使得去内皮后血管环中亚硫酸盐含量显着性升高，内皮完整组与去内皮组之间具有显着性差异。结论：①KCl可能是直接作用于血管平滑肌而引起血管收缩，其血管收缩作用与内皮无关；②NO可能没有介导KCl引起的血管收缩作用；③亚硫酸盐的改变也可能介导了KCl引起的血管收缩。
李欣[4]2007年在《溶血磷脂酸在急性心肌梗死诱发心律失常中的作用及电生理学机制》文中指出溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid ,LPA)是细胞膜磷脂代谢的中间产物。急性心肌梗死时由于血小板的聚集可产生并释放大量的LPA,而心肌细胞上又存在着对LPA敏感的特异性G-蛋白偶联受体。论文对LPA血浆浓度显着升高的卵巢癌患者和其它腹腔恶性肿瘤患者的心律失常发生率进行了比较,发现卵巢癌患者心律失常发生率明显高于其它腹腔恶性肿瘤患者的心律失常发生率;以体表心电为指标观察到心梗模型大鼠在给予外源性LPA后心律失常发生率增加;利用LPA试剂盒测定大鼠血浆LPA浓度,观察到心梗发生心律失常组的血浆LPA浓度明显升高;利用离体心脏灌流法观察到外源性给予LPA后离体心脏的心律失常发生率增加;在考察LPA对豚鼠乳头肌动作电位参数的影响时,发现LPA可显着延长乳头肌动作电位时程,增加动作电位幅值,并使心肌收缩力增强;利用膜片钳技术观察到LPA显着抑制心肌细胞延迟整流钾通道和内向整流钾通道;利用激光扫描共聚焦显微系统观察到LPA可增加心肌细胞游离钙浓度。上述结果提示:(1)LPA显着抑制心肌细胞延迟整流钾电流和内向整流钾电流,使细胞膜电位降低,易形成单向阻滞和慢传导,从而形成折返激动,可引起折返性心律失常,并且易诱发尖端扭转性室速或频发的单型性室性心律失常;而膜电位的降低使阈值降低,提高了心肌细胞的兴奋性,易引起异位心律;同时膜电位降低易引发早期后除极(EADs),产生触发激动。(2)LPA使心室肌细胞钙浓度升高,产生钙超载导致后除极(DADs),引发心律失常;(3)LPA可增加心肌细胞动作电位幅值(APA),主要由Na+电流经细胞膜钠通道所引起。钠电流的增加使心肌细胞不应期缩短,传导速度加快,易引起折返激动;同样会使原本没有自律性的细胞产生自律性,形成异位心律。本文从整体、器官、细胞分子多个水平,利用心梗模型、LPA试剂盒测定LPA浓度、离体心脏灌流术、乳头肌动作电位参数测定、膜片钳技术测定膜电流、激光扫描共聚焦显微系统测定细胞内钙浓度等多种技术系统的研究了LPA在急性心肌梗死诱发心律失常中的作用及机制。本文的创新之处:(1)观察到大鼠心肌梗死组血浆LPA浓度明显高于对照组,心肌梗死并发生心律失常组大鼠的血浆LPA浓度高于单纯心梗组;(2)观察到LPA可显着延长豚鼠乳头肌动作电位时程,增加动作电位幅值,并使心肌收缩力增强;(3)观察到LPA可显着抑制豚鼠心室肌细胞延迟整流钾通道,并呈剂量依赖性。LPA抑制心肌细胞延迟整流钾通道的作用可被Gi蛋白阻断剂PTX所阻断;(4)观察到LPA可抑制豚鼠心室肌细胞内向整流钾通道,并可被Gi蛋白阻断剂PTX所阻断;(5)观察到LPA可增加大鼠乳鼠培养心肌细胞的游离钙浓度,并可被LPA特异性受体阻断剂Ki16425所阻断。
季永[5]2008年在《硫化氢后处理激活线粒体ATP敏感性钾通道和PI3K/Akt保护缺血大鼠心肌》文中研究表明目的硫化氢是一种内源性气体信号分子,可以在半胱氨酸代谢过程中通过心血管系统胱硫醚-γ-裂解酶的作用下内源性合成。研究表明硫化氢预处理对缺血再灌注心肌有确切的保护作用。硫化氢后处理对缺血再灌注心肌是否有保护作用,以及其保护作用的内源性机制有待于研究。本实验用大鼠离体心脏Langendorff缺血再灌注模型和培养心肌细胞缺氧复氧模型,从器官、细胞、线粒体、分子水平研究硫化氢后处理对缺血再灌注心肌的作用。本实验的目的:(1)探讨再灌注早期给予硫化氢处理是否能减轻心肌缺血再灌注损伤;(2)探讨硫化氢后处理心肌保护作用机制是否与线粒体ATP敏感性钾通道开放有关;(3)研究PI3K/Akt/GSK3β信号通路是否参与了硫化氢和处理的心肌保护作用机制;(4)探讨硫化氢后处理诱导线粒体ATP敏感性钾通道开放和PI3K/Akt/GSK3β激活对线粒体通透性转换(MPT)是否有调节作用。方法1、再灌注早期硫化氢后处理保护心肌免受再灌注损伤所有离体灌注的大鼠心脏经受30分钟缺血和90分钟再灌注。后处理方式:再灌注即刻给予4次15秒缺血或含硫氢化钠的灌注液处理间隔15秒含氧灌注液灌注。48只大鼠随机分入以下6组,每组8只:缺血/再灌注(CON)、缺血后处理组(Pcon);0.1μmol/L硫氢化钠后处理组(NP0.1);1μmol/L硫氢化钠后处理组(NP1);10μmol/L硫氢化钠后处理组(NP10);100μmol/L硫氢化钠后处理组(NP100)。观察各组血流动力学指标、冠脉漏出液肌酸激酶、乳酸脱氢酶释放和心肌梗死面积变化。2、硫化氢后处理中线粒体ATP敏感性钾通道的作用灌注方案同实验一。大鼠随机分为7组,每组8只:0.2%dimethyl sulfoxide(DMSO)溶剂对照组(Vehicle);缺血再灌注对照组(CON);1μmol/L硫化氢后处理组(NP1);100μmol/L 5-羟葵酸拮抗NP1组(5-HD+NP1);10μmol/L格列本脲拮抗NP1组(Gli+NP1);100μmol/L 5-羟葵酸组(5-HD);10μmol/L格列本脲组(Gli)。观察各组血流动力学指标、冠脉漏出液肌酸激酶、乳酸脱氢酶释放和心肌梗死面积变化。3、硫化氢后处理中PI3K-Akt-GSK3β信号通路的作用缺血再灌注方案同实验一。大鼠随机分入以下5组,每组8只:0.2%DMSO溶剂对照组(Vehicle);缺血再灌注对照组(CON);1μmol/L硫化氢后处理组(NP1)、15μmol/L的LY294002拮抗NPl组(LY+NPl);15μmol/L的LY294002溶于0.02%DMSO组(LY)。观察各组心脏心功能、酶学、心肌梗死面积指标,免疫组化和Western blot检测磷酸化Akt和磷酸化GSK3β的表达。4、硫化氢后处理中线粒体通透性转换孔道的作用乳鼠心肌细胞培养后经受2小时缺氧2小时复氧复制缺氧/复氧模型。同批培养的心肌细胞随机分入以下6组:(CON)缺氧/复氧组;(NP1)1μmol/L硫氢化钠后处理组;(NP1+5-HD)1μmol/L硫氢化钠后处理+100μmol/L的5羟葵酸组;(NP1+LY)1μmol/L硫氢化钠后处理+15μmol/L的LY294002组;(LY)15μmol/L的LY294002组;(5-HD)100μmol/L的5-HD组。检测各组细胞存活率、线粒体游离钙、线粒体活性氧、线粒体膜电位、线粒体通透性转换、线粒体胞浆细胞色素C含量和线粒体电镜分析。5、统计学分析所有计量资料数据用((?)±s)表示。SPSS13.0统计学软件分析数据,组间比较用单因素方差分析,SNK检验。P＜0.05认为有统计学意义。结果1、硫化氢后处理保护大鼠心肌免受再灌注损伤再灌注60和90分钟,Pcon(69±5,66±7mmHg),NP0.1(65±6,63±5mmHg),NP1(67±6,65±7mmHg),NP10(61±5,60±6mmHg)各组的LVDP分别显着高于缺血再灌注CON组(48±8,43±6mmHg)(均P＜0.05);Pcon心肌梗塞面积(21.7±6.2%)低于CON(47.6±5.3%,P＜0.05)。与CON比较,0.1-10μmol/L硫氢化钠后处理各组剂量依赖性减少心肌梗塞面积(NP0.1,34.2±5.1%,NP1,23.4±4.6%,NP10,25.1±7.2%,P＜0.05与CON组比较),而100μmol/L NaHS未能减少梗死面积。与CON比较,Pcon明显抑制了冠脉漏出液中CK、LDH的释放(均P＜0.05);NP0.1、NP1、NPl0也剂量依赖性抑制了CK、LDH的释放(均P＜0.05)。2、硫化氢后处理开放ATP敏感性钾通道保护心肌根据实验一量效关系结果,选择1μmol/L的NaHS为后处理代表性硫化氢后处理剂量,进一步研究钾通道阻断剂是否能拮抗硫氢化钠的心肌保护作用。结果显示,10μmol/L格列苯脲和100μmol/L的5-HD均拮抗了NP1组减少心肌梗塞面积的保护作用(Gli+NP1,46.5±8.6%;5-HD+NP1,42.0±10.3%,P＜0.05与NP1组比较,23.4±4.6%)。再灌注早期给与10μmol/L格列苯脲或100μmol/L 5-HD均能拮抗硫化氢后处理再灌注60、90分钟提高LVDP的作用(均P＜0.05)。同时,还拮抗了NP1组抑制CK、LDH释放的保护作用(均P＜0.05)。3、硫化氢后处理激活PI3K-Atk-GSK3β信号通路保护心肌与CON组比较,NP1组心肌梗塞面积(23.4±7.2%)明显小于CON(47.6±5.3%,P＜0.05);NP1明显抑制冠脉漏出液CK,LDH的释放(均P＜0.05)。NP1组显着提高了磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3p(Ser9)的表达(均P＜0.05)。15μmol/L的LY294002拮抗了硫化氢后处理减少心肌梗塞面积的作用,LY+NP1组(44.5±6.7%)梗死面积高于NP1组(23.4±7.2%,P＜0.05)。LY294002拮抗了NP1组限制心肌CK、LDH释放的保护作用(均P＜0.05)。同时LY+NP1组的磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3p(Ser9)的表达显着低于NP1组(均P＜0.05)。4、硫化氢后处理激活ATP敏感性钾通道和PI3K-Ark-GSK-3β信号最终抑制线粒体通透性转换缺氧复氧末NP1组心肌细胞存活率高于CON(49.1±3.8%vs 31.9±4.1%,P＜0.05);线粒体游离钙浓度低于CON(424.3±14.7 vs 712.8±18.4 nmol/mg.pro,P＜0.05);线粒体活性氧产生速率低于CON(8.1±0.6 vs 13.2±0.7 fluorescenceunits/sec.mg.pro,P＜0.05);线粒体膜电位TMRE荧光相对值高于CON(73.6±4.5%vs51.6±6.1%,P＜0.05);Calcein荧光相对值高CON(提示抑制了线粒体通透性转换)(61.7±7.5%vs 39.4±5.2%,P＜0.05),增加了线粒体细胞色素C的含量保存(P＜0.05),减少了胞浆细胞色素C的释放(P＜0.05),保存了线粒体超微结构完整。100μmol/L的5-HD完全拮抗了NP1组以上保护效果(均P＜0.05)。15μmol/L的LY294002拮抗了NP1组在细胞存活率以及线粒体膜电位、MPTP方面、细胞色素C释放的保护作用(均P＜0.05),而未能拮抗NP1组对线粒体钙、活性氧的抑制作用。结论(1)硫化氢后处理能够保护缺血再灌注大鼠心脏免受再灌注损伤。其保护作用体现在:抑制线粒体游离钙超载和线粒体活性氧的产生,抑制线粒体通透性转换的发生,提高复氧心肌细胞膜电位,保护线粒体超微结构的完整,减少线粒体细胞色素C的释放。最终提高复氧细胞存活率,减少心肌梗塞面积,提高再灌注心肌收缩功能。(2)硫化氢后处理心肌保护机制包括线粒体ATP敏感性钾通道的开放。(3)硫化氢后处理激活线粒体ATP敏感性钾通道开放,抑制线粒体钙超载和活性氧产生,从而继发性抑制了线粒体通透性转换的发生。(4)硫化氢后处理心肌保护机制还包括激活PI3K-Atk-GSK3β信号通路,磷酸化GSK3β(ser9)抑制线粒体通透性转换的发生。
肖玉成[6]2004年在《作用于电压门控钠通道的蜘蛛毒素的结构与功能研究》文中提出虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena Wang [=Orni thoctonus huwena(Wang)])、海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana Liang[=Ornithoctonus hainana(Liang)])和雷氏大疣蛛(Macrothele raveni)是在我国南方发现的具有很强毒性的蜘蛛新种，其粗毒能使昆虫和小型脊椎动物致死。本项研究采用膜片钳技术在NG108-15细胞上首先检验了这叁种蜘蛛的粗毒对电压门控钠通道和延迟整流钾通道的影响。结果表明，叁种蜘蛛粗毒对外向延迟整流钾通道没有明显作用，但对TTX敏感型钠通道表现出较强的浓度依从性抑制效应，半有效抑制浓度(IC_(50))分别为：3.4、1.8和11.0mg／L。值得注意的是，叁种粗毒抑制钠通道的方式均与其它已知蜘蛛钠通道毒素不同，都不能影响通道的激活与失活时间，表明在这些蜘蛛粗毒中极有可能含有未曾报导过的新型钠通道毒素。 通过阳离子交换和反相高效液相色谱柱层析(HPLC)，进一步从海南捕鸟蛛粗毒中分离获得了一种新的神经毒素，命名为海南捕鸟蛛毒素-Ⅴ(hainantoxin-Ⅴ，HNTX-Ⅴ)。同时还利用膜片钳或双电极杆电压钳技术鉴定了该毒素以及其它叁种海南捕鸟蛛毒素(包括海南捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HNTX-Ⅰ)、海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ(HNTX-Ⅲ)和海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ))对离子通道的影响特征。四种海南捕鸟蛛毒素均是多肽类钠通道毒素，由33或35个氨基酸残基组成，其中6个Cys以Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅵ的方式配对形成3对二硫键。HNTX-Ⅴ是HNTX-Ⅳ的一种天然突变体，两者之间只有一个残基(Ser20Ala)不同。叁维结构测定和同源模建结果表明四者都属于抑制剂胱氨酸结(ICK)模体蛋白家族。四种HNTX均能抑制TTX敏感型钠通道的激活，但不影响TTX不敏感型钠通道。HNTX对TTX敏感型钠通道亚型的选择性不一样。HNTX Ⅲ-Ⅴ能完全抑制大鼠背根神经节(DRG)细胞TTX敏感型钠通道，IC_(50)分别是1.1、44.6和46.8 nM。但HNTX-Ⅰ对DRG细胞钠通道无影响，却能抑制不表达于DRG细胞上的rNa_v1.2／β1和昆虫钠通道para／tipE(外源表达于非洲爪蟾卵母细胞上)，IC_(50)分别是68.0和4.3μM。HNTX Ⅲ-Ⅴ还能使DRG细胞TTX敏感型钠通道的稳态失活曲线向超极化方向漂移约10 mV。同粗毒水平实验结果一样，中英文摘要四利，}一六以都不能延缓钠通道的失活时间，也没有漂移电压一「包流(l一V) 狡系曲线。特别是HNTX一工H和HNTX一IV(1 pM)还能完全阻断位点3毒素枷K{(.类。一蝎毒素，来自于东亚钳蝎But力:Is二rtensz’ Karsch粗毒)延缓的失活电流，表明海南捕鸟蛛毒素不是位点3毒素，其影响钠通道的机制应该有别于6一atraCotoxinS和协一agatoXinS等蜘蛛毒素。我们进 步推测HNTX在钠通道上的结合位点是位点l。通过固相化学合成的方法，将日NTX一丁v进行了四个点位突变(Ser12Ala、Arg26Ala、LyS27Ala和八以29A}的。其‘一1，，突变体LyS27Ala和Arg29Ala抑制钠通道的能力只有天然毒素的1/100，而Arg26Ala和serlZAla与天然毒素相差不大，证明}”一“和八r厂’应该是海南捕鸟蛛毒素结合钠通道的关键残基。 敬车l}缨毛蛛(凸ilobl妞‘加￡j’z’n那为、)是最近在我国海南省发现的 ，蜘蛛新种。通过阳离子交换和/或反相HPLC，我们从其粗毒中得到了两种一丰度较高的组分，并命名为敬钊缨毛蛛毒素一I(JZTX一I)和敬钊缨毛蛛一心索一日l(二仪Tx一工H)。MALD工一TOF质谱鉴定和Edman降解测序结果表明:、!/下X一I的分子量为3675.6 Da，含有33个氨基酸残基;而JZTX一工H的分广员为:份1 9.4 Da，含有36个残基。两毒素中均包含6个CyS。结合TCIi尸部分还原修饰、氨基酸序列测定和多酶酶解分析法等技术，鉴定出这6个C、、能够形成3对二硫键，连接方式均为卜工V、工工一V、工工卜V工。我们还采川〔、l)X八末端快速扩增(RACE)法获得了它们的CDNA序列，并由此推测出、J/’f一l和健限可工I的前体分别含有62和63个氨基酸残基。经分析发现!Z拭11!前体中含有一不常见的蛋白酶酶切位点(一X一Ser一)，而不是 丫八:、g一，_且其间隔蛋白区序列只含有5个残基，是目前蜘蛛毒素前体‘扫员脚的·个。!漠片钳实验结果表明JZTX一I和JZTX一IH都是电压门控钠通迈，扮素，子{!对钠通道亲和力与亚型的选择性不一致。JzTX江是日前首次报道的一源于蜘蛛粗毒的类Q一毒素，能抑制棉铃虫幼虫神经元细胞钠通道、少、鼠D既细胞‘I’TX敏感型钠通道和心肌细胞钠通道的快速失活，工C:‘，分别为8.86林M、0.99刚和31.6 nM，对叁种细胞__匕钠电流的峰值大小都无明!IJ娜洲lJ，也不改变通道I一V曲线和稳态失活特征，但能加速D尺G细胞卜通道的火活恢复速率。而有意思的是，JZTX一IH在粗毒中可能存在异构现象，因为在分离过程，}，，该毒素具有两个不同的吸收峰，_且彼此功能明显不户丰丫尽，’i’{:两种‘!Z‘fX一工H都能选择性地作用于心肌细胞竹X不敏感’(口钠通中英文摘要道，但一者为抑制电流的快速失活相，与JZTX一工类似;而另一者为抑制电流激活，10刚几乎可以完全抑制位点3毒素引起的电流失活部分。IC印分别为12.8哪和0.38哪。我们进一步推测:JZTX一工和JZTX一工H(抑制通道失活)应该是位点3毒素，而JZTX一IH(抑制通?
杨朝[7]2006年在《钙激活性氯离子通道在低氧大鼠肺动脉平滑肌中的作用及其机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景 目前，肺动脉高压和肺心病的发病率仍然居高不下。低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是最常见的类型，其发病机制目前尚不十分清楚，低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)和低氧性肺血管重建(hypoxic pulmonary vascular remodeling)是其两大病理生理基础。目前认为，低氧引起的肺血管收缩并非完全依赖于血管内皮细胞，血管平滑肌细胞也可介导血管收缩反应。在影响血管张力的各种因素中，离子通道在其中的作用是研究热点。本实验室已有的研究发现血管平滑肌细胞钾通道发挥着一定的作用。但用钾通道开放剂并不能阻止HPV的发生，故氯通道越来越为国内外学者所关注。研究发现氯通道与原发性高血压密切相关，但氯通道在肺动脉高压中是否起作用目前尚不清楚。 肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)膜主要有两种氯离子通道：钙激活性氯离子(Ca~(2+)-activated Cl~-，Cl_(Ca)))通道和容量敏感性氯离子(volume-sensitive Cl~-，Cl_(swell))通道。尼氟灭酸(Niflumic acid，NFA)、和indaryloxyacetic acid(IAA-94)是Cl_(Ca)通道特异性阻滞剂，且细胞浆内游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca~(2+) concentration，[Ca~(2+)]_i)升高是激活Cl~(Ca)通道的必要条件。研究已证实，生理条件下Cl_(Ca)通道参与了血管活性药诱导的肿动脉平滑肌细胞膜去极化和肺动脉收缩。大量研究表明急性或慢性低氧均引起PASMCs[Ca~(2+)]_i升高，而[Ca~(2+)]_i的升高又是激活Cl_(Ca)通道的必要条件，那么低氧是否激活Cl_(Ca)通道呢?用氰化物模仿低氧环境可以在鼠的PASMCs引起[Ca~(2+)]_i升高和激活钙激活性氯离子电流(Ca~(2+)-activated Cl~- currents，I_(Cl(Ca)))，但在真实低氧环境中[Ca~(2+)]_i与Cl_(Ca)通道的关系国内外尚未见报道。目前，Cl_(Ca)通道是否参与低氧性肺血管收缩和重建尚不清楚。 低氧时[Ca~(2+)]_i的升高是来自细胞外Ca~(2+)通过细胞膜钙通道内流还是来自细胞内钙库的Ca~(2+)释放或二者均参与目前国内外还存在争议，低氧首先触发外Ca~(2+)内流呢还是细胞内钙库的Ca~(2+)释放呢?如果是细胞内钙库的Ca~(2+)释放，来自细胞内库存的Ca~(2+)是由理阿诺碱受体敏感(ryanodine receptor-seneitive)钙库还是IP_3受体敏感钙库(IP_3 receptor-seneitive Ca~(2+) store)的钙释放呢?二者关系如何?上述问题国外有少量报道且研究结果不一致。Cl_(Ca)通道如果参与了低氧性肺血管收缩和重建，那么钙信号在其中又是如何作用的呢?基于此，本研究通过模拟生理、急性和慢性低氧环境，利用免疫组织化学技术、膜片钳技术，荧光光度法检测细胞内钙等多种实验方法，探讨Cl_(Ca)通道在低氧性肺血管收缩和重建中的作用及其作用机制，为HPH的发病机制研究和防治提供实验资料。 第一部分 生理条件下钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉张力中的调节作用及其机制 分题一 生理条件下肺动脉平滑肌细胞膜钙激活性氯离子通道的电生理特性及意义 目的：观察生理条件下肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)膜钙激活性氯离子通道(Cl_(Ca))的电生理特性，并探讨其意义。 方法：大鼠单个PASMCs获得采用急性酶分离法(胶原酶I型和木瓜蛋白酶)。分别通过含Ca~(2+)及无Ca~(2+)的细胞外液、苯福林(PE)和环匹阿尼酸(CPA)等引起细胞浆内游离钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)变化，用全细胞膜片钳技术测定PASMCs钙激活氯电流(I_(Cl(Ca)))的改变。 结果：(1)PE和CPA等均可引起[Ca~(2+)]_i升高，由(88.24±4.89)nmol／L升高到(246.73±13.95)nmol／L(P＜0.01)。(2)[Ca~(2+)]_i升高可以引出I_(Cl(Ca))，Cl_(Ca)通道阻滞剂尼氟火酸(NFA)和indaryloxyacetic acid(IAA-94)均可可逆性的抑制此电流，由(-241.3±59.7)pA，到(-96.7±24.3)pA，(P＜0.01)。 结论：生理条件下大鼠PASMCs具有Cl_(Ca)通道；细胞外Ca~(2+)内流及细胞浆内Ca~(2+)释放均可激活该通道，其参与了血管活性药诱导的肿动脉收缩。 分题二 生理条件下钙激活性氯离子通道对大鼠肺动脉张力的调节作用 目的：研究钙激活性氯离子通道及其通道阻滞剂尼氟灭酸(Niflumic acid，NFA)和indaryloxyacetic acid(IAA-94)在苯福林(phenylephrine，PE)引起的肺动脉收缩中的作用。 方法：常规离体血管灌流法检测肺动脉环张力；采用钙荧光探针(Fura-2／AM)负载急性酶分离法(胶原酶I型和木瓜蛋白酶)获得的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)，观察NFA和IAA-94对PE诱导的PASMCs胞浆游离钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)的影响，用荧光分光光度计法检测[Ca~(2+)]_i。 结果：钙激活性氯离子通道阻滞剂NFA和IAA-94可以舒张PE引起的肺动脉环收缩，舒张率分别达(89.9±3.7)％和(70.7±10.4)％(P＜0.01)；NFA和IAA-94对KCl引起的血管收缩无影响；PE可以引起[Ca~(2+)]_i升高，由(88.24±4.89)nmol／L到(243.83±5.30)nmol／L(P＜0.01)，NFA和IAA-94使升高的[Ca~(2+)]_i降低，由(243.83±5.30)nmol／L到(84.58±5.15)nmol／L(P＜0.01)。 结论：钙激活性氯离子通道在生理状态下与血管活性药(PE)引起的肺动脉张力变化有关，这为研究其在低氧性肺血管收缩中的作用提供了新的线索。 第二部分 急性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉舒缩中的作用及机制 分题一 急性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉舒缩中的作用目的：观察大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)膜钙激活性氯离子(Cl_(Ca))通道在急性低氧性肺血管收缩(HPV)中的作用。 方法：常规离体血管灌流法检测急性低氧时肺动脉环张力变化；钙荧光探针(Fura-2／AM)负载培养PASMCs，观察常氧(37℃、5％CO_2、21％O_2、74％N_2)和急性低氧(37℃、5％CO_2、2％O_2、93％N_2)条件下[Ca~(2+)]_i的变化；观察Cl_(Ca)通道阻滞剂尼氟灭酸(NFA)和indaryloxyacetic acid(IAA-94)对肺动脉张力和[Ca~(2+)]_i的影响。 结果：(1)常氧对肺动脉环张力无影响，急性低氧使肺动脉环收缩。Cl_(Ca)通道阻滞剂NFA和IAA-94可以舒张急性低氧引起的肺动脉环收缩，其舒张率分别达(52.2±19.2)％和(30.6±8.6)％(P＜0.01)；(2)急性低氧时[Ca~(2+)]_i升高：常氧状态下，PASMCs[Ca~(2+)]_i为(95.73±19.61)nmol／L，低氧时为(247.50±22.15)nmol／L(P＜0.01)；(3)常氧时，NFA和IAA-94对[Ca~(2+)]_i无影响(P＞0.05)；低氧时，NFA和IAA-94使PASMCs[Ca~(2+)]_i由(247.50±22.15)nmol／L降低到(126.19±11.10)nmol／L(P＜0.01)。 结论：急性低氧引起[Ca~(2+)]_i升高，这可能激活Cl_(Ca)通道，对[Ca~(2+)]_i起正反馈作用，Cl_(Ca)通道可能在低氧性肺血管收缩中起作用。 分题二：急性低氧时大鼠肺动脉平滑肌细胞内钙信号水平的变化及意义 目的：观察急性低氧对大鼠肺动脉平滑肌内质网游离钙离子水平的影响。 方法：细胞水平：通过钙荧光探针(Fura-2／AM)负载大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)，用荧光分光光度法，在细胞外液无Ca~(2+)的条件下，分别给予常氧(37℃、5％CO_2、21％O_2、74％N_2)和急性低氧(37℃、5％CO_2、2％O_2、93％N_2)气体，通过理阿诺碱(RD)和环匹阿尼酸(CPA)等工具药检测大鼠PASMCs细胞浆内游离钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)的变化；离体血管环水平：血管环在无Ca~(2+)的液体灌流下，给予上述条件，运用离体血管灌流方法检测肺动脉环张力变化。结果：(1)急性低氧时[Ca~(2+)]_i升高：常氧组PASMCs[Ca~(2+)]_i为(96.99±7.16)nmol／L，低氧组为(257.06±32.48)nmol／L(P＜0.01)。(2)与低氧组比较，预先用RD或咖啡因耗竭内质网理阿诺碱受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时[Ca~(2+)]_i不升高，为(108.71±10.38)nmo]／L左右(P＜0.01)；而用CPA或thapsigargin(TG)耗竭内质网IP_3受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时[Ca~(2+)]_i仍呈升高状态(P＞0.05)。(3)低氧引起离体肺动脉环收缩：常氧对基础张力无明显影响，低氧引起肺动脉环收缩，最大收缩张力达(49.28±8.64)mg／mg(P＜0.01)。(4)预先用RD或咖啡因耗竭理阿诺碱受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时，收缩的肺动脉环舒张，舒张率最高达(91.75±5.74)％(P＜0.01)；而用CPA或TG耗竭IP_3受体敏感钙库，随后再给予低氧刺激时，对收缩的肺动脉环无明显影响，舒张率最高达(12.1±4.26)％(P＞0.05)。 结论：急性低氧时主要是来自内质网理阿诺碱受体敏感钙库的Ca~(2+)释放参与了低氧性肺血管收缩的发病机理，而IP_3受体敏感钙库的Ca~(2+)释放在此无明显作用；这是PASMCs自身具有的，既不依赖细胞外Ca~(2+)经细胞膜钙通道内流，也不依赖血管内皮。 第叁部分 慢性低氧时钙激活性氯离子通道在大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及其相关基因表达中的作用 目的：探讨慢性低氧条件下钙激活性氯离子(Cl_(Ca))通道对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及其相关基因表达的影响。 方法：将PASMCs分别于常氧(37℃、5％CO_2、21％O_2、74％N_2)及慢性低氧(37℃、5％CO_2、2％O_2、93％N_2)条件下分为4组：(1)对照绀(N：常氧，H：低氧)(Nc，Hc)：(用不含药物的无血清培养基处理)：(2)10 NFA组(N_(10NFA)，H_(10NFA))：(含10 μmol／L尼氟灭酸(NFA)的无血清培养基处理)：(3)50 NFA组(N_(50NFA)，H_(50NFA))：(含50 μmol／L NFA的无血清培养基处理)；(4)IAA-94组(N_(IAA-94)，H_(IAA-94))：(含10 μmol／L indaryloxyacetic acid(IAA-94)的无血清培养基处理)。采用电镜观察低氧对PASMCs形态的影响；流式细胞术观察细胞的周期；应用荧光光度法检测细胞内钙；四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色分析法检测细胞的增殖；免疫细胞化学技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)及基因c-fos和c-jun的蛋白表达，以观察Cl_(Ca)通道阻滞剂对培养的PASMCs增殖的影响。 结果：(1)低氧使PASMCs表型从收缩型向合成型转换，电镜下合成型表现为胞浆内SM-α-actin减少，线粒体和粗面内质网增多；(2)慢性低氧时[Ca~(2+)]_i升高：常氧状态下，PASMCs[Ca~(2+)]_i为(123.63±18.98)nmol／L，低氧时为(281.75±16.48)nmol／L(P＜0.01)；常氧时，NFA和IAA-94对[Ca~(2+)]_i无影响(P＞0.05)，慢性低氧时，NFA和IAA-94使PASMCs[Ca~(2+)]_i由(281.75±16.48)nmol／L降低到(117.66±15.36)nmol／L(P＜0.01)；(3)MTT比色法中，慢性低氧状态下NFA和IAA-94引起升高的吸光度(A)值降低，由0.459±0.058到0.224±0.025(P＜0.01)；(4)慢性低氧时PCNA表达的阳性率明显增高，与常氧组比较差异有显着性(P＜0.01)；NFA和IAA-94处理组表达的阳性率明显下降，与低氧组比较差异有显着性(P＜0.01)；而NFA和IAA-94对常氧各组的阳性表达率无影响(与常氧对照组比较差异无显着性，P均＞0.05)；(5)流式细胞分析显示慢性低氧时S+G_2M期细胞所占比例增高，增殖指数明显增加，与常氧组比较差异有显着性(P＜0.01)；NFA和IAA-94处理组G_0G_1期所占细胞的比例增加，S+G_2M期细胞所占比例减少，增殖指数明显减少，与低氧组比较差异有显着性(P＜0.01)；而NFA和IAA-94对常氧时的各期细胞所占的比例及增殖指数无影响(与常氧对照组比较差异无显着性，P均＞0.05)；(6)图象分析显示，慢性低氧时c-fos和c-jun蛋白阳性染色平均积分光密度值(AIOD)明显增高，与常氧组比较差异有显着性(P＜0.01)；NFA和IAA-94处理组AIOD明显下降，与低氧组比较差异有显着性(P＜0.01)；而NFA和IAA-94对常氧各组的AIOD无影响(与常氧对照组比较差异无显着性，P均＞0.05)。 结论：慢性低氧引起细胞内Ca~(2+)浓度升高，细胞表型改变，促进细胞增殖；低氧条件下抑制Cl_(Ca)通道的活性可降低细胞内Ca~(2+)浓度，抑制细胞的增殖，提示Cl_(Ca)通道在低氧肺动脉高压中起作用。
闫福曼[8]2009年在《心肌微环境诱导间充质干细胞通道蛋白表达及丹参酮的干预作用研究》文中研究表明研究背景随着干细胞研究的逐渐深入,成体干细胞的心肌分化潜能给心肌损伤的治疗带来了新的希望。其中骨髓来源的间充质干细胞(Bone-derived Mesenchymal StemCells,BMSCs)具有取材方便、易于分离和体外培养扩增;免疫原性低、易于外源基因的导入和表达、可进行基因修饰;能分化为心肌细胞,内皮细胞和血管平滑肌细胞等诸多优势,成为治疗心脏疾患极有前景的种子细胞。诱导BMSCs向心肌分化的因素很多,其中胞嘧啶类化学物质5-氮胞苷(5-azachtine,5-aza)是最常用的化学诱导剂,除此之外,心肌的微环境是影响BMSCs在心脏局部存活和分化的重要因素。BMSCs和搏动心肌的接触,心肌细胞分泌的各种细胞因子都会影响BMSCs的分化。既往研究结果已经证实了,BMSCs移植后可以改善心功能。但是,人们更希望用有收缩力的细胞来替代坏死的心肌细胞,并且能与心肌同步收缩。同步收缩的前提是要产生同步兴奋。BMSCs是否具有产生生物电的基础,这是首先需要明确的问题,但这方面的研究较少。正常心脏的心电活动与节律性收缩,还有赖于心肌细胞之间信息通道传递的完整性,其结构基础是细胞间的间隙连接。连接蛋白43(connexin,Cx43)作为心肌细胞间隙连接组成中主要的连接蛋白,在维持心肌细胞的连接通讯功能,电信号传导和正常的节律性收缩中起重要作用。在近几年对BMSCs的研究中,研究者发现,移植单纯的BMSCs之后,移植细胞在宿主细胞局部的存活率低,影响长期治疗效果。如果BMSCs与SCF、G-CSF以及AKT等细胞因子联合,或将BMSCs修饰后再进行移植,其治疗效果会明显提高。丹参是临床上治疗心血管病的最常用中药之一,丹参酮ⅡA是其脂溶性成分。现代药理研究显示,丹参酮ⅡA具有扩张冠脉,抗心肌急性缺氧、抗心律失常、抗心肌肥厚和抗血小板聚集等作用。鉴于以上原因,我们拟在体外条件下,模拟心肌微环境,研究正常和缺氧心肌上清液对BMSCs细胞膜上离子通道和连接蛋白43的影响;观察丹参酮ⅡA和心肌的上清液联合治疗是否有助于提高BMSCs之间Cx43的表达。研究目的1、研究SD大鼠BMSCs的体外分离、纯化和扩增,建立成熟而稳定的BMSCs培养体系,为后续的实验研究提供充足的细胞来源。2、研究在未分化的BMSCs细胞膜上,5-aza诱导之后,正常心肌上清液和缺氧心肌上清液诱导之后,BMSCs细胞膜上的钠通道基因SCN2a、钾通道基因Kv1.4、Kv2.1、Kir1.1、EAG1和钙通道α亚单位基因CCHL2α的mRNA表达,推测心肌微环境对移植的BMSCs电生理特性的影响,为移植细胞在心肌局部微环境的作用下可能发生的离子通道的变化提供实验支持。3、研究5-aza诱导后,正常心肌上清液和缺氧心肌上清液诱导后Cx43的表达量的变化;探讨心肌微环境在促进BMSCs之间电通讯连接的作用;进一步观察丹参酮ⅡA是否可促进BMSCs之间Cx43的建立以及与心肌上清液联合应用后的效果。探讨在BMSCs移植治疗心肌梗死的时候,丹参酮ⅡA是否具有协同作用,为中药联合细胞移植提高治疗效果提供实验基础。研究方法1、BMSCs的体外分离,纯化、扩增和鉴定。采用全骨髓贴壁筛选法分离培养SD大鼠的BMSCs,用免疫荧光染色法和流式细胞技术来检测BMSCs表面蛋白标志CD34、CD29、CD44和CD45抗原的表达情况,以鉴定BMSCs和判断BMSCs的纯化效果。2、心肌微环境对大鼠BMSCs离子通道mRNA表达的影响。体外培养乳鼠心肌细胞,制备缺氧心肌细胞模型。取培养的正常心肌细胞和缺氧心肌细胞的上清液诱导BMSCs3周,同时用10μmol/L5-aza诱导。用逆转录-集合酶链式反应(reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法分别检测BMSCs细胞膜上与心肌细胞动作电位相关的离子通道的mRNA表达情况,包括钠通道基因SCN2a、钾通道基因Kv1.4、Kv2.1、Kir1.1、EAG1和钙通道α亚单位基因CCHL2α。3、心肌微环境对BMSCsCx43的影响以及丹参酮ⅡA的干预作用。采用RT-PCR技术观察5-aza诱导后,正常心肌细胞和缺氧心肌上清液对BMSCsCx43mRNA表达的影响。采用Westernblotting和免疫荧光技术检测其Cx43蛋白的表达,分别观察高、低剂量丹参酮ⅡA是否可促进BMSCs之间Cx43的建立。将不同剂量的丹参酮ⅡA与缺氧心肌上清液联合应用,观察其促进Cx43表达的作用是否更佳。研究结果1、采用全骨髓贴壁筛选法分离BMSCs。原代取材后48h首次换液,即可去除未贴壁的血细胞和部分造血干细胞。3天后细胞进入对数生长期,增殖迅速,形态多为长梭形。原代第9-10天细胞可铺满瓶底,90%以上的细胞发生融合,呈放射状或漩涡形。传代后的细胞较快贴壁,无潜伏期,迅速进入生长期。5天左右即可进行下一次传代。在传代后的生长过程中,细胞排列较规律,多呈旋涡状。随着代数的增加,其他非BMSCs细胞逐渐减少,传代至第3代细胞时,细胞已比较纯化。传代到第6代之后,细胞的增殖能力开始下降,形态变扁平,折光性变差。部分细胞在形态上出现向脂肪细胞分化的趋势。取第3代细胞进行鉴定,用免疫荧光染色法检测表面蛋白标志CD44(BMSCs表面标志)和CD45抗原(造血干细胞表面标志),结果为CD44阳性表达、CD45阴性表达。用流式细胞技术检测表面蛋白标志CD29(BMSCs细胞表面标志)和CD34抗原(造血干细胞及内皮细胞表面标志),结果为送检细胞CD29阳性率占99.27%,CD34阴性率为1.28%。2、取第3代BMSCs进行RT-PCR实验。结果显示,未分化的BMSCs细胞膜上表达与心肌动作电位相关的离子通道基因mRNA,包括钠通道基因SCN2a,钾通道基因Kv2.1、Kv1.4、Kir1.1,EAG1和钙通道α亚单位基因CCHL2α,但对于同一目的基因而言,在BMSCs上的表达量要低于心肌细胞(p＜0.01)。经10μmol/L5-aza诱导之后,BMSCs首先发生形态上的改变。细胞体积较前增大,由长梭形逐渐变为短棒状或不规则。2周后细胞开始融合,3周后形成肌管样结构,部分细胞形成球状。采用RT-PCR技术检测离子通道mRNA的改变,结果显示,SCN2a、Kv2.1、Kir1.1、EAG1和CCHL2α表达增加(p＜0.01),Kv1.4表达量变化不明显。经心肌细胞培养液和缺氧心肌细胞培养液诱导后,形态上的改变不明显。RT-PCR检测结果为,经正常心肌上清液诱导之后,SCN2a和Kv2.1mRNA的表达升高(p＜0.05),Kv1.4变化不明显,Kit1.1,EAG1和CCHL2αmRNA的表达明显升高(p＜0.01)。缺氧心肌上清液诱导后,各离子通道基因的mRNA表达与对照组相比,表达量均升高。在整个实验过程中,未见到BMSCs自发收缩现象。3、取第3代BMSCs进行RT-PCR实验。BMSCs诱导3周后,可见未分化的BMSCs上Cx43mRNA有弱的表达;经5-aza诱导之后,正常心肌上清液以及缺氧心肌上清液诱导之后Cx43mRNA的表达量升高,P＜0.01。经丹参酮高剂量(1.5×10~(-7)mol/L)处理之后的BMSCs,其Cx43mRNA的表达量增加(P＜0.05),经丹参酮低剂量组(1.5×10~(-8)mol/L)处理之后,Cx43的表达明显升高(P＜0.01);经缺氧心肌上清液和丹参酮共同干预后,Cx43较对照组均有明显升高。但仍是丹参酮低剂量组作用更加显着(P＜0.01);缺氧心肌上清液和丹参酮低剂量组联合干预之后Cx43的表达接近心肌细胞组(p＞0.05),阳性对照组心肌细胞有强的Cx43的表达。与不同浓度丹参酮诱导BMSCs比较,缺氧心肌上清液和丹参酮的联合作用更强(p＜0.05)。Cx43mRNA在心肌细胞上有强表达。经western-blotting结果显示,各组均有不同强度的特异性条带出现,分子量约为43KD。进一步发现,在未分化的BMSCs上有Cx43蛋白的出现,经5-aza诱导之后,正常心肌上清液以及缺氧心肌上清液诱导之后Cx43的表达量升高;丹参酮ⅡA作用之后的变化与RT-PCR的结果一致,说明在蛋白质水平,丹参酮ⅡA仍可以上调Cx43的表达。采用Cx43抗体免疫荧光标记后的检测结果表明,各组细胞在荧光显微镜下均可见大致的细胞轮廓,细胞核呈蓝色(DAPI染色),胞浆和胞膜中有不同强度的点状绿色荧光。不同组间荧光强度的变化与RT-PCR和westernblotting的结果一致。结论1、本研究建立了成熟的SD大鼠BMSCs的体外培养方法,细胞增殖迅速,状态良好,生物学性状稳定,无过多的非BMSCs的干扰,经细胞形态和表面蛋白标志鉴定为BMSCs。2、本研究证明了5-aza可诱导BMSCs细胞膜钠通道基因SCN2a,钾通道基因Kv2.1,Kv1.4,EAG1和Kir1.1和钙通道α亚单位CCHL2αmRNA表达量增加,从离子通道方面说明了5-aza可诱导BMSCs向心肌细胞方向分化;正常心肌上清液和缺氧心肌上清液在不依赖化学诱导剂的作用下,可促进BMSCs细胞膜上以上离子通道基因mRNA的表达,说明心肌细胞分泌的可溶性细胞因子可促进BMSCs表达离子通道蛋白,提示BMSCs移植后,心肌微环境有助于BMSCs在心脏局部分化,产生与心肌动作电位相关的离子通道蛋白。3、本研究证实了5-aza可诱导BMSCs表达Cx43,证明了正常心肌上清液和缺氧心肌上清液均可促进Cx43在BMSCs上的表达,心肌微环境也有助于BMSCs之间连接蛋白的建立。不同浓度丹参酮ⅡA可上调BMSCs表达Cx43的作用,但丹参酮ⅡA和缺氧心肌上清液联合诱导作用更强。提示在BMSCs移植时联合应用丹参酮ⅡA可以提高细胞间的电信号通讯,在电生理改善方面提高移植效果。成果与创新点我们在体外条件下,从离子通道和连接蛋白角度探讨了化学诱导剂,心肌分泌的可溶性因子和中药丹参酮对BMSCs的作用。实验结果①本实验从与心肌动作电位产生相关的离子通道角度,证实了5-aza可诱导BMSCs向心肌细胞方法分化,丰富了5-aza作为心肌定向分化诱导剂的理论研究内容。②我们通过采用正常心肌/缺氧心肌的培养液对BMSCs的影响作用观察,来更加方便在体外观察心肌细胞的分泌环境对BMSCs的作用,了解移植细胞在宿主微环境下的变化。本研究证实了心肌可通过其分泌的细胞因子调节移植细胞离子通道和连接蛋白的表达,且此作用不依赖化学诱导剂的作用。这对于移植细胞在心肌局部因素作用下细胞膜离子通道和连接蛋白的改变提供了实验依据,为移植细胞在宿主局部是否会产生生物电以及具有致心律失常作用提供一定的理论参考。③国内研究中药单体或复方在BMSCs的影响方面,多集中在是否具有和5-aza同样的诱导分化作用,但诱导率比较低。本课题的创新之处在于,证明了丹参酮联合缺氧心肌上清液可明显提高BMSCsCx43的表达,作用要强于单独一种因素的作用。说明在细胞移植治疗心肌梗死过程中,联合应用活血化瘀中药,不仅有利于移植细胞在宿主局部的存活,而且可以提高细胞之间的电生理通讯,有助于移植细胞和宿主细胞发生同步兴奋,进而提高移植效果。为扩展中药的临床用途,为中医药进入细胞移植领域提供了新的切入途径。
郭守利[9]2007年在《15-KETE致大鼠缺氧性肺血管收缩的离子通道机理》文中认为HPV由Euler和Liljestrand于1946年首次提出,此后被广泛研究。但是其发生的确切机制至今尚不完全明了。目前认为内皮细胞衍生的血管活性物质在HPV中起重要的作用,并在在体HPV发生中是必须的,但很可能HPV的始发因素仍是PASMCs内部因素。我们前期的研究结果表明:慢性缺氧情况下,15-LO活性增强,从缺氧肺细胞浆转移至细胞膜,作用于AA,生成15-HETE、15-KETE等代谢产物,提示缺氧条件下15-LO的花生四烯酸代谢产物有其相应的细胞分布、细胞内定位及相应的作用位点。15-HETE以剂量依赖方式收缩PA环,缺氧的情况下尤为明显。由于15-HETE在动物体内不是AA的15-LO终产物,它可进一步代谢为15-KETE、8(S),15(S)-DiHETE等产物。通过对15-LO的花生四烯酸代谢产物对大鼠肺动脉作用的筛选,我们发现15-KETE具有强烈收缩大鼠肺动脉作用,以缺氧更明显。因此15-KETE在HPV中的作用有待于进一步研究。本文通过应用离体组织浴槽血管环实验技术、全细胞膜片钳技术、激光扫描共聚焦显微镜技术、Western Blot和RT-PCR技术、,从血管功能、电生理、蛋白质、mRNA水平上全面揭示15-KETE收缩大鼠肺动脉的离子通道机理。实验结果表明15-KETE以浓度依赖性的方式强烈收缩大鼠肺动脉,并且以缺氧组更显着。15-KETE抑制了大鼠PASMCs IKv,使大鼠PASMCs去极化,促进了细胞外液钙离子的内流,使大鼠PASMCs游离钙离子浓度增加,同时降低了Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.4蛋白质和mRNA的表达,可能是介导缺氧与肺动脉收缩的一个新的重要因子。
杜冠华[10]1995年在《丹酚酸药理作用及作用机制》文中进行了进一步梳理丹酚酸(Salvianolic acids)是从传统中药丹参(Radix Salvia miltiorhizae)中提取的有机酸类物质。丹酚酸可分为数种，主要有丹酚酸A，丹酚酸B(Sal A，Sal B)及其类似化合物。在此基础上对丹酚酸的化学结构进行改造，分别得到了乙酰化丹酚酸A(Sal AA)，乙酰化丹酚酸B(Sal BA)等化合物(见本文第65页)。 为了对丹参的药理作用有更深入更广泛的认识，本文对丹参的主要水溶性成分--丹酚酸的药理作用进行了研究，并对其作用机制进行了探讨，为丹酚酸可能的临床用途和丹参的全面研究提供了实验依据。本研究的主要内容有以下几个方面： 1．抗氧化及清除自由基的作用特点： 1．1 丹酚酸抗肝微粒体脂质过氧化作用，丹酚酸类化合物及其乙酰化物对VitC-NADPH系统和半胱氨酸-Fe~(2+)反应系统引起的大鼠肝微粒体或脑组织脂质过氧化反应均有很强的抑制作用，其抑制肝微粒体脂质过氧化反应的IC50分别为：Sal A 0.76 μ mol·L~(-1)，Sal AA 2.32 μ mol·L~(-1)，SalB 1.25 μ mol·L~(-1)，Sal BA 36.4 μ mol·L~(-1)，Ros 27.3 μ mol·L~(-1)。比维生素E的IC50低数百至数千倍。 1．2 清除羟自由基的作用．丹酚酸及其乙酰化物，对EDTA-Fe~(2+)反应系统产生的羟自由基具有很强的清除作用，与阳性对照药甘露醇比较，同样作用时，丹酚酸A的浓度比甘露醇小近1000倍，表现出很强的清除自由基作用。 1．3 捕捉超氧阴离子的作用．丹酚酸对黄嘌呤代谢过程中产生的超氧阴离子具有很强的清除作用，其IC50分别为：Sal A 1.71，Sal AA 0.67，SalBA 39.5，Ros 0.722 μ mol·L~(-1)．但丹酚酸对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用较弱，表明捕捉超氧阴离子可能是这些药物的直接作用。
参考文献：
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