长沙医学院临床学院 湖南 长沙 410219
摘要：目的研究胶质母细胞瘤模型中的BDNF/TrkB信号通路及miR-185对其的调控。方法构建miR-185表达载体。体外培养胶质母细胞瘤，后将其随机分为正常组、胶质母细胞瘤组、正常+BDNF组、胶质母细胞瘤+BDNF组、正常转染miR-185组、胶质母细胞瘤转染miR-185组、胶质母细胞瘤转染miR-185+BDNF组。免疫荧光、膜片钳及免疫印迹技术观察转染miR-185后BDNF/TrkB通路的表达变化。结果胶质母细胞瘤+BDNF组海马神经元细胞的TrkB蛋白磷酸化水平较正常+BDNF组降低，有统计学意义（P<0.05)正常+BDNF组TrkB蛋白的磷酸化水平比正常组的磷酸化水平升高，有统计学意义（P<0.01);胶质母细胞瘤+BDNF组TrkB蛋白磷酸化水平比胶质母细胞瘤组升高，有统计学意义(P<0.05);而胶质母细胞瘤+miR-185+BDNF组的TrkB蛋白磷酸化水平较胶质母细胞瘤+BDNF组和胶质母细胞瘤转染miR-185组升高（P<0.001)。结论BDNF可以激活BDNF/TrkB信号通路，转染miR-185后可以消除对胶质母细胞瘤状态下BDNF/TrkB信号传导通路的抑制。
关键词：miR-185；BDNF；TrkB；胶质母细胞瘤
脑胶质瘤的病理分级越高，侵袭性越强，肿瘤组织与正常脑组织的界限就越模糊，手术不易切除，对放疗、化疗的耐药性更高。其血管丰富、浸润性生长及高复发率等生物学行为使脑胶质瘤患者的预后一直很差，这是长期影响神经外科发展的重大难题。MicroRNA(miRNA)是一类长度为21〜22个核苷酸左右的非编码的小RNA，其序列具有高度保守性目前，越来越多的研究表明miRNA参与了一些神经系统疾病形成的分子调控机制。可以通过不同信号通路参与基因调控及改变靶蛋白表达，其在脑组织生理功能及脑胶质瘤细胞的表面受体、癌基因、抑癌基因等的表达及引起的信号转导和效应方面引起了广泛关注，广泛分布于中枢神经系统，在大脑皮层、海马等部位含量较丰富，对神经元的存活、分化、生长发育起着重要作用。TrkB是BDNF的特异性功能受体，在人体的各种组织细胞中均有表达。它能表达3种亚型，完整型(TrkB-FL)和2种C端缩短型（T1/T2)。完整型已经有很多研究，缩短型TrkB的生物学功能研究较少。BDNF与TrkB的结合触发了该受体胞内激酶域（kinasedomain)的磷酸化和二聚化，继而BDNFTrkB复合体被内吞，并在这一转运过程中引发一系列的胞内下游信号转导，从而发挥调节神经元存活、突起生长和突触可塑性等生物学作用。对胶质母细胞瘤的miRNAs研究才刚刚起步，国内关于胶质母细胞瘤miRNA-185的研究甚少。本实验将miR-185转染大鼠胶质母细胞瘤细胞后，观察其对BDNF-TkB通路调控作用的影响，以期对胶质母细胞瘤的诊疗提供实验基础。
1材料与方法
1.1构建miR-185慢病毒表达载体用Trizol法提取RNA，鉴定浓度及纯度，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。经逆转录及PCR扩增后与Lentivector质粒载体连接，并转化宿主菌。将重组质粒导入293了细胞并收集上清液。
1.2实验动物健康SD大鼠，雌性12只，雄性4只，在室温下（常温26°C)按雌雄比为3=1合笼，取24h内新鲜胶质母细胞瘤进行体外培养。
1.3胶质母细胞瘤细胞的体外培养及分组分离新鲜胶质母细胞瘤，经胰蛋白酶消化后置于DMEM/F12培养基中终止消化，吹打并计数，接种在培养皿中，放在孵育箱中培养7d，进行分组。随机分为7组：正常组、胶质母细胞瘤组、正常+BDNF组、胶质母细胞瘤+BDNF组、正常转染miR-185组、胶质母细胞瘤转染miR-185组、胶质母细胞瘤转染miR-185+BD-NF组。胶质母细胞瘤细胞模型加入“无镁”细胞外液处理3h制备；各转染组在制备模型后，重新放入含镁的正常细胞外液中，培养2h后进行转染，转染组加入慢病毒稀释液20pL。转染48〜72h后提取蛋白。各BDNF组在提取蛋白前10min加入2μ，L100μg/LBDNF干预处理。
1.4 MAP2和DAPI双染鉴定将培养7d的胶质母细胞瘤用多聚甲醛固定、TritonX-100通透，并加入山羊血清工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司），再加入抗MAP-2兔抗大鼠IgG(1=50，北京康普森生物技术有限公司）及二抗FITC-山羊抗兔IgG(1=50，北京康普森生物技术有限公司），滴加DAPI染核，用甘油封片，最后在倒置相差显微镜下釆集图像。
1.2免疫印迹（Western blot法）检测蛋白表达
用RIPA细胞裂解液将7组细胞裂解后收集细胞，经超声机粉碎、离心，取上清液与上样缓冲液（中国碧云天公司）煮沸制成蛋白质样品。取等量样品依次经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，偏二氟乙烯（PVDF)膜（北京中杉金桥生物技术有限公司）转膜，脱脂奶粉及Western blot封膜液封闭，然后分别加入TrkB及p-TrkB兔抗大鼠多克隆抗体（稀释比分别为1:75、1:1000，北京中杉金桥生物技术有限公司）及大鼠抗pactin单克隆抗体1:1000(北京中杉金桥生物技术有限公司），再加入山羊抗兔及山羊抗鼠二抗1:5000(北京中杉金桥生物技术有限公司），采用化学发光检测系统，将化学发光底物加于PVDF膜上，并在SYNGENE ChemGenius成像系统成像。
1.7统计学分析数据使用SPSS21.0统计软件包进行分析。对数据进行方差齐性检验（Levene)，单因素方差分析，组间多重比较（LSD^)，检验水准a=005。
2结果
2.1免疫荧光技术鉴定胶质母细胞瘤细胞形态与正常组有显著差异（图1)。
2.2Western blot检测p-TrkB蛋白的表达结果 胶质母细胞瘤+BDNF组的TrkB蛋白磷酸化水平较正常+BDNF组降低，有统计学意义(P<0.05)。正常+BDNF组TrkB蛋白的磷酸化水平比正常组的磷酸化水平升高，有统计学意义(P<0.001);胶质母细胞瘤+BDNF组TrkB蛋白磷酸化水平比胶质母细胞瘤组升高，有统计学意义(P<0.05)。而胶质母细胞瘤+miR-185+BDNF组的TrkB蛋白磷酸化水平较胶质母细胞瘤+BDNF组和胶质母细胞瘤转染miR-185组升高。
3讨论
BDNF是神经营养因子（NT)家族的一员，除了调控神经元的存活、分化，还影响正常及损伤后神经轴索外向性生长、神经递质合成。实验证实BDNF对神经元有保护作用，其机制可能为，BDNF诱导TrkBmRNA表达上调，最终引起细胞核内转录调节因子发生改变而发挥保护作用。先前研究发现，BDNF与胶质瘤有关，在胶质瘤发生中具有某种因果关系。TrkB是BDNF的高亲和力受体，在人体的各种组织细胞中，TrkB能表达3种亚型，全长型及两种缩短型。其中全长型TrkB是介导BDNF主要生物学活性的受体，缩短型TrkB缺失胞内结构域的大部分，不显示蛋白-酪氨酸激酶受体活性。近年来，KAPLAN等通过免疫组织化学和免疫印迹检测发现，在星形细胞瘤的BDNF-TrkB蛋白表达明显增加。而在经替莫唑胺治疗后，BDNF/TrkB蛋白表达大幅下调，可见BDNF-TrkB信号通路存在致瘤作用。N-甲基-D^天冬氨酸型谷氨酸受体（N-methyl-Daspartatetypeof glutamate receptors，NMDARs)的过度激活导致神经元化生在胶质瘤、和慢性神经退行性疾病中起着至关重要的作用，这种状态即为兴奋性中毒。Tang等研究表明LLRC4和miR-185表达在正常脑组织中高于胶质瘤组织和多种胶质瘤细胞株（U251、SF126、SF767），在胶质瘤细胞中LLRC4能提高miR-185的表达。该研究发现miR-185直接靶向CDK6、DNMT1、CDC42、RhoA，通过CDC42、RhoA抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭，而CDC42和RhoA也可影响VEGFA的表达。miR-185也通过CDK6诱导细胞G0/G1期阻滞，阻滞肿瘤的进展。Zhang等研究发现miR-185则通过DNMT1诱导DNA甲基化，从而促进神经胶质瘤的发展和恶化。miR-185靶向不同mRNA发挥作用，研究信号通路有利于研究特定靶点药物，抑制信号通路的级联放大效应。另有研究将CH0K1细胞仅转染具有全长型的TrkB时，用免疫印迹法可以检测到pTrkB，说明全长型TrkB可以自磷酸化，当加入BD^NF后，全长型的TrkB磷酸化水平升高，但是没有显著变化，说明全长型的TrkB自磷酸化作用较弱；仅转染缩短型TrkB未检测到pTrkB;当同时转染全长型TrkB和缩短型TrkB时，与仅转染全长型TrkB相比，TrkB磷酸化水平显著下降；当加入BDNF处理细胞后，TrkB磷酸化程度下降水平更加显著。经BDNF处理同时转染全长型TrkB和缩短型TrkB的细胞和未经BDNF处理的同时转染全长型TrkB和缩短型TrkB的细胞相比，前者的磷酸化水平较低。也有实验用缩短型TrkB转染体外培养的海马神经元，结果显示转染组细胞TrkB磷酸化水平较无转染组细胞磷酸化水平低，且降低了BDNF对TrkB诱导的磷酸化作用。上述实验说明缩短型TrkB对TrkB蛋白的磷酸化起到负性调节作用，故降低了TrkB的磷酸化水平，而全长型TrkB对于自身磷酸化水平的调节作用微弱。
近年来，对于miRNA在神经系统疾病中所起作用的研究已经成为神经病学的研究热点之一。研究表明处于胶质瘤的动物模型大脑中miR-NAs表达水平发生了选择性变化。关于胶质瘤患者体内miRNAs表达变化已经有所研究，尤其是在神经元处于瘤化状态时变化更为显著，这些研究表明miRNAs可能在胶质瘤发生机制中具有重要的调节作用。现有学者发现在自杀者的神经生物学过程中会出现额叶皮层缩短型TrkB表达的下调，他们利用miRNA芯片技术检测了缩短型TrkB表达下调的自杀者额叶皮层中几乎所有的miRNA的表达情况。在额叶皮层的Brodmannarea10区域，发现自杀者miR-185水平较正常者表达升高，且差异有统计学意义。在细胞中加入miR-185拮抗剂，检测到缩短型TrkB表达增高，同时在细胞中转染miR-185mimics并检测各类TrkB表达情况，发现miR-185mimics只下调缩短型TrkB的表达。总结这些实验结果说miR-185只对截短型TrkB表达具有下调作用。
本实验结果显示正常组和胶质瘤组经BDNF处理后，TrkB的磷酸化水平均较未处理时显著升高，胶质瘤+miR-185+BDNF组较miR-185转染胶质瘤组的TrkB蛋白磷酸化水平升高，说明加入BDNF后可激活BDNF/TrkB信号传导通路，BDNF处理的胶质瘤组与BDNF处理后的正常组相比，TrkB的磷酸化水平明显下降，说明在瘤化状态下BDNF/TrkB信号传导通路受到抑制。胶质瘤+miR-185+BDNF组的TrkB蛋白磷酸化水平较BDNF处理后的胶质瘤组升高，说明转染miR-185后可以解除胶质瘤状态下BDNF/TrkB信号转导通路的抑制状态。综上所述，miR-185可以改善胶质瘤BDNF/TrkB通路的抑制状态，从而对胶质瘤的诊疗提供了又一条新的研究途径。
参考文献
[1]金世光,戴燕,李城,李昌熙,王大新.MiR-17-5p/BTG3调节胶质瘤的作用机制[J/OL].实用医学杂志,2019(05):715-719
[2]韩刚,杨扬,胡胜利.替莫唑胺通过调控miR-216a/PRKCA抑制胶质瘤细胞U251增殖和侵袭作用的研究[J/OL].现代肿瘤医学,2019(10):1713-1717
[3]Jovcevska,I.,N.Kocevar,and R.Komel,Glioma and glioblastoma-how much do we (not) know?Mol Clin Oncol,2013.1(6):p.935-941.
[5]余振兴,邓磊,张先斌,胡祖力,祝新根,吴淼经.miR-182靶向调控FOXO3a表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响[J/OL].安徽医科大学学报,2019(04):559-563
[6]Ciafre, S.A.,etal.,Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma. Biochem Biophys Res Commun,2005.334(4):p.1351-8.
[7]刘洪超,史康克,张雨,魏志豪.多形性胶质母细胞瘤相关miRNAs的鉴定与分析[J].华南国防医学杂志,2019,33(02):86-91.
[8]Deorah,S.,etal.,Trends in brain cancer incidence and survival in the United States:Surveillance,Epidemiology,and End Results Program,1973 to2001.Neurosurg Focus,2006.20(4):p.E1.
[9]Maussion G, Yang J, Yerko V, etal.Regulation of a truncated form of tropomyosin-related kinase B (TrkB) by Hsa-miR-185 in frontal cortex of suicide completers[J]. PLoS One.2012,7(6):e39301.
[10]戚前生,赵红,刘建雄.环状RNA在神经胶质瘤中的研究进展[J].中国肿瘤外科杂志,2019,11(01):60-64.
[11]雷波,詹傲,张召,张孝礼,万晓强.长链非编码RNA ATB调控miR-144对胶质瘤迁移和侵袭的影响[J].安徽医学,2018,39(10):1189-1193.
[12]孙春黎,王丰,马宏.长链非编码RNA在胶质瘤放疗中的研究进展[J].生命科学仪器,2018,16(Z1):98-105.
[13]Fenner B M.Truncated TrkB: beyond a dominant negative receptor[J].Cytokine Growth Factor Rev.2012,23(1-2):15-24.
[14]张照楠,宿伟鹏,张洋,张宋安,赵化荣.脑胶质瘤组织中微小RNA-21水平及其与EGFR和VEGF表达的关系[J].临床肿瘤学杂志,2018,23(06):514-518.
[15]张波.三种遗传性癌症MicroRNA异常表达网络的研究[D].吉林大学,2018.
[16]范恒怡.miR-183通过LRIG1调控EGFR/AKT通路在胶质母细胞瘤放疗耐受中的作用及机制研究[D].南昌大学,2018.
[17].Girardet C, Lebrun B, Cabirol-Pol M J,etal.Brain-derived neurotrophic factor/TrkB signalingregulates daily astroglial plasticity in the suprachiasmatic nucleus:electron-microscopic evidence in mouse[J].Glia.2013,61(7):1172-1177.
[18]张青.胶质瘤患者脑脊液中miRNA-221/miRNA-222的异常表达及其潜在诊断价值分析[D].南京医科大学,2018.
论文作者:黄震宇,连天,李远翰
论文发表刊物:《总装备部医学学报》2019年第03期
论文发表时间:2019/5/23
标签：细胞论文; 胶质论文; 磷酸化论文; 转染论文; 胶质瘤论文; 水平论文; 蛋白论文; 《总装备部医学学报》2019年第03期论文;