（泉州医学高等专科学校 福建 泉州 362011）
【摘 要】目的：探讨米非司酮对小鼠植入前胚体外发育的影响及作用机制。方法：体外培养小鼠2-细胞胚，实验分M16对照组、米非司酮组（2.5，5，10和20μmol/L）；比较各组囊胚发育率；检测囊胚三磷酸腺苷（ATP）和囊胚内氧化应激活性氧（ROS）水平。结果：M16体外培养48h后囊胚发育率为83.47％，明显高于10和20μmol/L米非司酮组（P＜0.05）；培养72h后M16对照组囊胚发育率为85.95％，显著多于10和20μmol/L米非司酮组（P＜0.01）；10μmol/L米非司酮组囊胚发育率显著多于20μmol/L米非司酮组（P＜0.05）；M16对照组囊胚ATP含量明显高于10和20μmol/L米非司酮组（P＜0.01）；10μmol/L米非司酮组囊胚ATP含量高于20μmol/L米非司酮组；M16对照组囊胚内ROS相对荧光密度值明显低于10和20μmol/L米非司酮组（P＜0.01）；10和20μmol/L米非司酮组间囊胚内ROS相对荧光值比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：10和20μmol/L米非司酮可降低囊胚ATP含量和增加ROS水平，抑制植入前胚发育。
【关键词】米非司酮；植入前胚；三磷酸腺苷；活性氧
【中图分类号】R961 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0470-02
Study of Mechanism and effects of Mifepristone
on mouse preimplantation embryo development in vitro
Yanqin Zhang
Quanzhou Medical College, Quanzhou,Fujian 362011
【Abstract】Objective Study of Mechanisms and effects of Mifepristone on mouse preimplantation embryo development in vitro.Methods 2-cell embryos from mouse were cultured with M16 and Mifepristone.The number of blastaed was compared in different times.ATP levels and ROS contents of blastaed were measured.Results The development of blastaed in M16 control group as 83.47％ was superior to 10 and 20μmol/L Mifepriston group(P＜0.05). After cultured for 72h,the development of blastaed in normal saline as 85.96％ was superior to 10 and 20μmol/L Mifepriston group(P＜0.01),and 10μmol/L Mifepristone was higher than 20μmol/L(P＜0.05).ATP level of blastaed in M16 group was higher than 10μmol/L and 20μmol/L Mifepristone(P＜0.01).10μmol/L was higher than 20μmol/L(P＜0.01).The relative fluorescence intensity for ROS in 10 and 20μmol/L groups was higher than M16(P＜0.01).ROS in 20μmol/L was higher than the 10μmol/L(P＜0.01).Conclusion 10 and 20μmol/L Mifepristone could reduce ATP level and increase ROS in blastaed,and inhibits development of preimplanatation embryo.
【Key words】Mifepristone；preimplantation；ATP；ROS
当前，不孕不育、自然流产以及出生后缺陷等发病率逐年升高[1]，生殖功能受多种因素影响，其中环境雌激素近年得到广泛关注。米非司酮（Mifepristone）为人工合成药用雌激素，对大鼠早期胚胎发育在形态结构和细胞分裂上无明显作用[2]。然而，国外研究认为米非司酮对胚胎早期发育有显著抑制作用[3]。因此，米非司酮是否明显影响胚胎早期发育尚存在争议。本研究常规植入前胚体外培养，对囊胚体外发育行米非司酮干预，检测米非司酮对囊胚内三磷酸腺苷（ATP）含量和氧化应激活性氧（ROS）的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雌性C57BL/6小鼠和雄性C3H/He小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司（雌鼠4~6w，雄鼠8w以上）；B6C3F1雌鼠由上述饲养的雌雄鼠杂交所得；所有动物在恒温（21±1）℃和恒湿（55％±5％）条件下饲养；自由取食饮水；光周期调控：12h/12h。
1.2 实验试剂和仪器
米非司酮片（山东端信堂大禹药业有限公司，国药准字H20083077）；人绒毛膜促性腺激素（hCG）购自美国Sigma公司；孕马血清促性腺激素（PMSG）购自以色列ProSpecTechnoGene公司；M2、M16培养液购自北京迈晨公司；其他体外培养所需常规试剂购自美国Sigma公司；恒温C02培养箱（371型，Thermo Forma公司）；超净工作台（BCN-1360B，哈尔滨东联公司）；倒置相差显微镜（OLYMPUS，IX70-S8F）。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠植入前胚体外培养[4]
B6C3F1雌性小鼠腹腔注射6IUPMSG，46~48h后注射6IUhCG，随后与KM雄性小鼠1:1合笼（♀B6C3F1×♂KM）；于hCG注射后42h，收集2-细胞胚分别置于M16培养液以及含有不同浓度的米非司酮（2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）培养液滴中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；体外培养48h和72h后，记录各培养液滴中囊胚发育情况。
1.3.2 检测指标 ①ATP含量检测 采取多功能酶标仪测定，实验重复3次；②ROS测定 采取荧光探针二氯荧光乙酞乙酸盐检测，实验重复3次。
1.4 统计学处理
采用SPSS19.0统计学软件分析数据，以 为计量资料，用t检验比较，用χ2检验分析计数资料，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 米非司酮明显降低B6C3F1小鼠2-细胞胚体外培养囊胚的发育率
体外培养48h和72h后，2.5和5μmol/L米非司酮较M16对照组降低囊胚发育率不显著（P＞0.05）；10和20μmol/L米非司酮组均能明显降低囊胚发育率（P＜0.05，P＜0.01）；72h后，20μmol/L组囊胚发育率显著低于10μmol/L组（P＜0.05）（见表1）。
3 讨论
米非司酮是人工合成甾类化合物，对胚胎发育的影响及其可能的作用机制尚待阐明[5]。本研究采取PMSG-hCG法获得2-细胞胚，用不同浓度米非司酮干预。结果显示：培养48h和72h后，相对于M16对照组，10μmol/L米非司酮和20μmol/L米非司酮均明显阻滞小鼠2-细胞胚体外发育至囊胚，且在72h后米非司酮的抑制呈剂量依赖性。以上结果提示，米非司酮对小鼠植入前胚体外发育呈明显抑制作用。
在植入前胚早期发育中，线粒体可通过氧化磷酸化作用进行能量转换，为细胞的活动提供能量[7]。卵子和胚胎发育均受线粒体ATP含量影响，线粒体氧化磷酸化功能降低造成ATP生成不足，可导致卵子受精失败[8]。本研究显示，相对于M16对照组，10μmol/L、20μmol/L米非司酮组均明显降低了囊胚ATP含量，且20μmol/L米非司酮组较10μmol/L组下降更显著，这一结果进一步证实了ATP对小鼠植入前胚体外发育的重要性。
一般情况下，胚胎中超氧化物歧化酶活性较低，当ROS生成超过组织细胞的清除量时，机体将发生氧化应激，氧化应激增加可促进胎儿的先天性畸形[9]。本研究中，米非司酮较M16对照组可显著提高囊胚ROS相对荧光密度值，且20μmol/L米非司酮组较10μmol/L组ROS水平提高更明显，这或许也是米非司酮降低小鼠囊胚体外发育率的原因之一。
参考文献：
[1]刘关羽,姜小雪,何俊琳,等.发展中国家（地区）青少年人群性与生殖健康问题及成因分析[J].中华医学教育探索杂志,2011,10(4):497-500.
[2]张晏,乔根梅,朱蓬弟,等.三种不同剂量米非司酮用于紧急避孕的临床观察[J].中国计划生育杂志,1998(6):343-345.
[3]Chen S,Dharmarajan AM,Wallech E,et a1.RU 486 inhibits ovulation,fertilization and early embryonic development in rabbits:in vivo and in vitro studied[J].Fertil Steril,1995,64(3):627-633.
[4]张传颂.砷暴露对小鼠植入前胚胎体外发育的影响及作用机制的研究[D].北京协和医学院,2010:16-17.
[5]Li HZ,Sun X,Stavreus-Evers A,et al.Effect of mifepristone on the expression of eytokines in the human Fallopian tube[J].Mol Hum Reprod,2004,l0(7):489-493.
[6]陈慧,苏迎春,孙莹璞.线粒体在卵子和早期胚胎发育中的研究[J].国外医学计划生育/生殖健康分册[J].2007,26(2):60-63.
[7]Lee SH,Lee S,Jan HS,et a1.Expression ofthe mitochondrial ATPase6 gene and Tfam in Down syndrome[J].Mol Cells,2003,15(2):181-185.
[8]张雷,方南洙,李井春.长期氧化应激导致葡萄糖对小鼠胚胎发育损伤的机制[J].细胞生物学杂志, 2006,28(5):661-666.
论文作者:张燕琴
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月供稿
论文发表时间:2015/10/22
标签：囊胚论文; 小鼠论文; 体外论文; 胚胎论文; 对照组论文; 培养液论文; 线粒体论文; 《河南中医》2015年8月供稿论文;