张惠中[1]1997年在《单链可变区抗体在HIV-1感染基因治疗中的应用及其标准化制备》文中进行了进一步梳理单链可变区抗体(Single Chain Antibody Variable Region Fragments sFv)由完整抗体的可变区轻链(L_H)及可变区重链(V_H)组成，中间由一多肽链相连。近年来抗体工程技术的飞速发展使得这一具备完整抗体高特异性和结合性的最小结构单位，可通过适当的表达载体被导入靶细胞内的特定区域，并稳定、持续地表达目的基因，从而起到阻断或开放某缺陷基因的作用，故这一技术在当今肿瘤性疾病及病毒感染性疾病基因治疗中显示出广泛的应用前景。HIV-1为一具有包膜的逆转录病毒，含有2个拷贝的单链RNA(9800bp)。HIV-1借高亲合性的受体(CD_4)进入靶细胞，在宿主细胞酶的作用下脱去包膜并在病毒酶的作用下逆转录成cDNA进而整合于宿主细胞基因组，完成其生命周期。因此整合过程是其生命周期中不可缺少的关键步骤，阻断HIV-1整合酶将遏制HIV-1感染于早期阶段，从而起到治疗目的。据此，我们特构建了抗HIV-1整合酶的sFv(Anti-HIV-1 IN sFv)及带有核内定位信号的抗HIV-1整合酶的sFv(Anti-HIV-1 IN／Nu sFv)。 一、抗HIV-1整合酶sFv的功能鉴定 为探讨IN-sFv在HIV-1感染中的临床应用意义。作者对其进行了功能测试。首先以免疫染色法对该结构的细胞内表达及分布进行了观察。结果显示。转染有IN-sFv及IN／Nu-sFv的NIH3T3细胞分别于胞浆及胞核中有明确的sFv表达。然后对其进行了感染实验，以MOI=0.04-0.06的NL_(4-3)病毒株同时感染10~6个转染有IN-sFv的SupT1细胞及转染有CAT、HBVcore-sFv及抗HIV-1 Rev-sFv的SupT1对照组细胞。通过ELISA法测定培养细胞上清中的P~(24)蛋白含量证实IN-sFv阻断病毒复制的作用达
李昌[2]2008年在《新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究》文中认为本研究针对当前AIDS/HIV治疗中面临的病毒变异快、病毒感染细胞贮存池难以清除、病毒感染造成机体免疫功能损伤等关键问题,以构建具特异杀伤和免疫治疗双重功能的基因工程制剂为目标,筛选能够与HIV-1膜蛋白特异结合的抗病毒蛋白西诺维恩(CVN)、格瑞弗森(GRFT)以及免疫诱导因子金黄色葡萄球菌外毒素A(SEA)为研究对象,利用细菌和酵母表达系统,获得了重组抗病毒蛋白CVN、GRFT及其偶联SEA的重组导向制剂CS、GS,对其进行初步活性分析。同时制备了稳定表达中国流行株HIV-1膜蛋白的靶细胞模型,利用该模型,通过免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光测定(IFA)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤试验等,对CVN、GRFT及其重组导向制剂CS、GS的体外结合活性、细胞结合活性及细胞杀伤活性进行研究。结果表明,成功获得了抗病毒蛋白和重组导向制剂,并且都具有良好的细胞结合活性。重组导向制剂可非特异性活化PBMCs、特异性介导CTLs杀伤表达HIV-1膜蛋白的靶细胞,为该制剂进一步推向临床奠定了基础。
许四宏[3]2004年在《人源抗人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）结构蛋白基因工程抗体的研究》文中研究指明目前，HIV-1感染的预防和控制对人类来说仍然是一个未解的难题。HIV-1为单链RNA病毒，属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒亚科(Lentivirus)。该病毒为圆形或椭圆形，直径约90～140nm，外层为类脂包膜，表面有锯齿样突起，内有圆柱状核心，病毒的包膜是糖蛋白gp160(由gp120和gp41组成)，为该病毒的结构蛋白，其中gp120为外膜蛋白，gp41为跨膜蛋白(trans-membrane protein)。gp120与CD4结合后相互作用，引起gp120发生一系列构象变化，进而形成高亲和力的CCR5／CXCR4结合位点，协助HIV-1进入宿主细胞。结构蛋白还包括p24核心蛋白和p18基质蛋白。目前的许多研究表明，针对该病毒的中和表位主要存在于gp160。 本课题运用噬菌体抗体库技术，以期获得人源抗HIV-1 gp160基因工程抗体。首先采集无症状、HIV-1抗体滴度高的HIV-1感染者全血，分离淋巴细胞后提取总RNA，反转录为cDNA第一链，然后利用一组人源抗体IgG1 Fab段基因的引物对抗体的轻链和重链Fd段基因进行PCR扩增，再将扩增后的轻链、重链基因先后克隆到pComb3X载体，转化XL1-Blue，在辅助噬菌体的辅助作用下，构建了噬菌体抗体库，库容为8×10~6，最后用预包被gp160的ELISA板对噬菌体抗体库进行筛选，经过三轮“吸附—洗脱—富集”的筛选过程，将获得的克隆进行诱导表达，表达产物经ELISA检测，结果获得11株抗HIV-1 Fab克隆。 在pComb3X载体中，轻链和重链Fd基因的信号肽分别为ompA和pelB，以这两个信号肽为模板，分别设计了轻链和重链的测序引物，对所获得的11株阳性克隆的轻链和重链基因进行了测序。运用EMBL EBI数据库提供的ClustalW对所获得的轻链基因序列和重链基因序列进行了同源性比较，结果获得了10条轻链基因(κ、λ链各5条)，8条重链基因；通过与HIV序列数据库中的基因
王俊霞[4]2007年在《犬传染性肝炎DNA疫苗的构建和免疫原性研究》文中研究说明核酸疫苗是90年代兴起的新型疫苗,已在多种疾病的防治中显示出巨大的潜能。新一代DNA疫苗能全面的诱发免疫反应,且生产易于标准化,从而得到人们的重视。随着核酸疫苗研究的不断深入,一个又一个预防动物传染性疾病的核酸疫苗将应运而生。本实验针对犬传染性疾病预防需要新型核酸疫苗这一趋势,进行了如下研究:①构建预防犬传染性肝炎的核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop,并对其免疫效果进行评价;②构建原核蛋白表达质粒pET28a-Loop,表达、纯化Loop蛋白;③制备鼠抗Loop蛋白单克隆抗体并对克隆细胞株进行鉴定。犬传染性肝炎是由犬传染性肝炎病毒感染引起。犬传染性肝炎病毒又称犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV),属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属成员,是已发现的哺乳动物腺病毒属中致病性最强、形态结构研究得较清楚的一种动物病毒[1]。犬腺病毒广泛分布于全世界,是对我国养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的疫病之一。CAV分为两种抗原相关型,即犬腺病毒I型(CAV-1)和犬腺病毒II型(CAV-2)。其中CAV-1称犬传染性肝炎病毒(CIHV),主要引起犬传染性肝炎和熊、狐脑炎。Loop1、Loop2为犬传染性肝炎病毒中和抗原决定簇,本研究设计并合成了Loop1和Loop2基因,连接两个基因命名为Loop ,①将Loop克隆到质粒载体pVAX1-CpG ,构建核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop。采用脂质体体外转染,共聚焦观测结果显示构建的真核表达质粒可表达目的蛋白;采用ELISA法测定抗体效价,流式细胞检测CD4+和CD8+构成比,IFN-γ测定和中和抗体检测等实验方法,对pVAX1-CpG-Loop诱导小鼠的免疫效果进行了评价,结果显示各实验组小鼠均可产生体液免疫和细胞免疫应答。②将Loop基因片段克隆到质粒pET28a载体,构建原核表达质粒pET28a-Loop,表达Loop蛋白,制备了抗Loop蛋白的单克隆抗体,得到四株能产生中和抗体的克隆株,其中2-7F9,2-1B1中和抗体效价较高,可作为单抗诊断、治疗犬传染性肝炎的候选克隆株。
参考文献：
[1]. 单链可变区抗体在HIV-1感染基因治疗中的应用及其标准化制备[D]. 张惠中. 第四军医大学. 1997
[2]. 新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究[D]. 李昌. 吉林大学. 2008
[3]. 人源抗人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）结构蛋白基因工程抗体的研究[D]. 许四宏. 中国药品生物制品检定所. 2004
[4]. 犬传染性肝炎DNA疫苗的构建和免疫原性研究[D]. 王俊霞. 第二军医大学. 2007
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