马海利[1]2008年在《O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫》文中认为在分析FMDV抗原表位和免疫特性的基础上,结合FMD的流行特点,设计了O型FMDV复合表位与CTB的融合基因CTB-Th2-VP1和CTB-VP1-2A-Epi,将其克隆入表达载体pGEX-6P-1,在BL21中获得诱导表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在,具有O型FMDV和CTB双重反应原性。融合蛋白复性后具有CTB的生物活性,腹腔接种小鼠后可诱导产生特异性的体液、细胞和黏膜免疫,其中CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白产生的免疫水平高于或接近灭活疫苗。将CTB-VP1-2A-Epi融合基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体pBC38C中,构建了CTB-VP1-2A-Epi重组枯草芽孢杆菌,免疫小鼠可产生O型FMDV特异性的细胞免疫和黏膜免疫。将重组枯草芽孢杆菌与重组鸡痘病毒vUTAL3CP1、核酸疫苗pIRES3CP1及O型FMDV灭活苗以不同的组合方式联合免疫小鼠。结果显示,重组枯草芽孢杆菌能够增强这叁种疫苗的免疫效果,其中以核酸疫苗首免、重组鸡痘病毒加强免疫,结合重组枯草芽孢杆菌灌服的免疫策略的免疫效果最佳,可诱导机体产生较高水平的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。研究结果表明设计和表达的CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白具有良好的FMDV免疫原性和CTB佐剂作用,为研制和使用新型、高效的FMD基因工程疫苗奠定基础。
张洪英[2]2003年在《口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究》文中提出口蹄疫是一种烈性传染病，通过空气传播，有广泛的动物宿主，并对人也有感染性，是受到广泛关注的人畜共患病之一。根据国际兽疫局(OIE)1996年文件规定，一旦口蹄疫暴发，所有感染和相接触的动物都必需屠杀。大量动物死亡以及因口蹄疫而引起其他无疫情国家的贸易壁垒将会给经济带来沉重的打击。因此，预防是解决问题的唯一办法。尽管传统的灭活苗已经在很多国家有效地控制了口蹄疫的发生，但是疫苗中灭活不完全的病毒又导致了疾病的暴发。科学家们曾试图用含有病毒表位的合成肽或细菌表达的蛋白制备亚单位疫苗。这些疫苗比灭活苗安全，可以诱导实验动物产生抗体有效地中和病毒，但不能有效地保护家畜抵抗病毒的攻击。然而，DNA疫苗提供了一种选择，因为它的免疫原性和安全性，特别是它不存在任何与活病毒可能相关的危险。 口蹄疫是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒引起的。病毒颗粒由60个亚单位组成，每个亚单位包含各一分子的VP1，VP2，VP3和VP4，这4个分子组成了病毒壳蛋白P1。据报道，编码P1和病毒蛋白酶3C的非复制型DNA疫苗可以诱导产生抗病毒免疫应答。包含病毒全基因组的复制型DNA疫苗可以在易感细胞中复制，并可以产生更强的免疫应答。然而，在强毒攻击实验中，两种DNA疫苗对免疫猪的保护率只有20％。这可能是由于病毒蛋白酶3C和L抑制了宿主细胞的蛋白合成所致。据报道，这两个蛋白水解酶能水解宿主细胞的翻译起始因子eIF4A或eIF4G，其最终结果是导致细胞凋亡。 因此，科学家们将研究焦点集中在表位DNA疫苗上。最近的一篇报道显示编码口蹄疫病毒位点1的DNA疫苗对猪产生了100％的保护。位点1包括VP1上的141AA—160AA和200AA—213AA两个B细胞表位，是VP1上的优势位点，可以诱导动物产生免疫保护。除了位点1以外，现在已经在O型口蹄疫病毒粒子上发现了4个包含B细胞表位的位点。但是位点1与其他4个位点组合的DNA疫苗至今没有报道。这4个位点分别是位于VP1的位点3，包含40AA—60AA；位于VP2的位点2，包含70AA—78AA和131AA—134AA；位于VP3的位点4，包含56AA—58AA；以及位点5，只有一个氨基酸，即VP1上的149AA。 在本论文中，我们根据GeneBank中O型口蹄疫病毒序列(accession no.X00871)以及相对应的5个位点的序列和VP1上一个通用T细胞表位的序列设计并合成了多表位基因，命名为SG。采用含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头以避免因表位直接连接而产生的相互干扰以及新表位的出现。用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ将SG克隆到DNA疫苗载体——pVAXI而获得pVAX一SG重组质粒。将pVAX一SG质粒DNA体外转染PKI细胞、BHK一21细胞或体内转染肌肉细胞，用抗O型口蹄疫病毒的阳性血清进行免疫组化检测，都能在转染细胞胞浆中发现明显的阳性信号，表明表达的病毒表位被阳性血清识别。而空载体对照转染的细胞中未发现阳性信号。 为了比较这5个位点的不同组合效果，一共构建了5个质粒载体，并在小鼠体内进行效力实验的比较。42只小鼠(雌性，4一6周龄)随机平均分成7组，每组6只。1组和2组是阴性对照组，只注射PBS和pVAXI空载体。组3到组7分别注射构建的5个质粒载体DNA:pVAX一SG，pVAX一N4，pVAX一Nsl，pVAX一Tsl和pVAX一51。所有的小鼠都注射2次，每次间隔3周，每次注射体积是100微升，量是200微克。血清中抗O型口蹄疫病毒的抗体用ELISA检测。脾脏淋巴细胞增殖用标准附T法测定。脾细胞分泌的工FN一Y和IL一4用ELISA试剂盒定量分析。脾细胞CTL活性用CTL检测试剂盒检测。CTL的靶细胞是用FuGENE6转染试剂将线形化的pcDNA一SG转染PS 15细胞，然后用G4 18(0.4 mg/ml一，)筛选得到的病毒表位的稳定表达克隆。这些阳性克隆的表达进一步用ELISA和RT一PCR得到确定。阳性克隆维持在含G418(0 .1 mg/ml一{2的培养基中。效应细胞是将分离的脾脏淋巴细胞在体外与全病毒蛋白(10林9 ml一，)共孵育7天而得到。结果表明只有pVAX一SG，pVAX一N4和pVAX一T51能诱导抗体产生，但是所有的重组质粒都能诱导细胞免疫应答，如淋巴细胞增殖和明显的CTL活性，以及诱导不同水平的IFN一Y和IL一4。通过比较发现编码位点5，1和T细胞表位的重组质粒能诱导全面的免疫应答，并且包含所有5个位点和T细胞表位的质粒pVAX一SG诱导了最强的免疫应答。 然而，pVAX一SG质粒DNA诱导产生的抗体水平(1:64，n二6)比灭活苗诱导的抗体水平(1:512，下6)显着低(p司.01)。体液免疫又一直被认为是抵抗病毒攻击最重要的。所以我们就采取了一系列策略以期提高抗体水平。首先，尝试加大DNA用量:其次，将人工L一2 cDNA与SG基因顺式表达，中间连接一个工RES片段;第叁，用直径12微米的海藻酸钠微球包裹DNA。病毒特异性抗体用ELISA检测。结果表明叁种策略可以不同程度地提高抗体水平。首先，通过增加注射的DNA量可以提高抗体水平，其中，注射总量为3毫克的最高剂量组(每隔2周注射一次，共注射3次)获得最高的抗体水平 (1:640)。顺式表达的人工L一2也帮助SG增加了1到2倍的抗体滴度。包裹入微粒的DNA则腹腔注射提高了2到6倍，肌肉注射提高1到2倍。口服和空载体对照都没有测到抗体。总之，?
黄力[3]2004年在《口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性》文中认为口蹄疫是一种烈性传染病，通过空气传播，有广泛的动物宿主，并对人也有感染性，是受到广泛关注的人畜共患病之一。根据国际兽疫局（OIE）1996年文件规定，一旦口蹄疫暴发，所有感染和相接触的动物都必需屠杀。大量动物死亡以及因口蹄疫而引起其他无疫情国家的贸易壁垒将会给经济带来沉重的打击。因此，预防是解决问题的唯一办法。尽管传统的灭活苗已经在很多国家有效地控制了口蹄疫的发生，但是疫苗中灭活不完全的病毒又导致了疾病的暴发。科学家们曾试图用含有病毒表位的合成肽或细菌表达的蛋白制备亚单位疫苗。这些疫苗比灭活苗安全，可以诱导实验动物产生抗体有效地中和病毒，但不能有效地保护家畜抵抗病毒的攻击。然而，DNA疫苗提供了一种选择，因为它的免疫原性和安全性，特别是它不存在任何与活病毒可能相关的危险。1 候选疫苗的结构分析口蹄疫是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒引起的。病毒颗粒由60个亚单位组成，每个亚单位包含各一分子的 VP1, VP2, VP3 和 VP4，这4个分子组成了病毒壳蛋白P1。据报道，编码P1和病毒蛋白酶3C的非复制型DNA疫苗可以诱导产生抗病毒免疫应答。包含病毒全基因组的复制型DNA疫苗可以在易感细胞中复制，并可以产生更强的免疫应答。然而，在强毒攻击实验中，两种DNA疫苗对免疫<WP=4>猪的保护率只有20%。这可能是由于病毒蛋白酶3C和L抑制了宿主细胞的蛋白合成所致。据报道，这两个蛋白水解酶能水解宿主细胞的翻译起始因子eIF4A或 eIF4G， 其最终结果是导致细胞凋亡。因此，科学家们将研究焦点集中在表位DNA疫苗上。最近的一篇报道显示编码口蹄疫病毒位点1的DNA疫苗对猪产生了100%的保护。位点1包括VP1上的 141AA—160AA和200AA—213AA 两个B细胞表位，是VP1上的优势位点，可以诱导动物产生免疫保护。除了位点1以外，现在已经在O型口蹄疫病毒粒子上发现了4个包含B细胞表位的位点。但是位点1与其他4个位点组合的DNA疫苗至今没有报道。这4个位点分别是位于VP1的位点3，包含40AA—60AA；位于VP2的位点2，包含70AA—78AA和131AA—134AA；位于VP3的位点4，包含56AA—58AA；以及位点5，只有一个氨基酸，即VP1上的149AA。我们根据GeneBank中O型口蹄疫病毒序列(accession no. X00871)以及相对应的5个位点的序列和VP1上一个通用T细胞表位的序列设计并合成了多表位基因，命名为SG。采用含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头以避免因表位直接连接而产生的相互干扰以及新表位的出现。用 EcoR I 和 Xba I将SG克隆到DNA疫苗载体——pVAX1而获得pVAX-SG重组质粒。将pVAX-SG质粒DNA体外转染PK1 细胞、BHK－21细胞或体内转染肌肉细胞，用抗O型口蹄疫病毒的阳性血清进行免疫组化检测，都能在转染细胞胞浆中发现明显的阳性信号，表明表达的病毒表位被阳性血清识别。而空载体对照转<WP=5>染的细胞中未发现阳性信号。关键词：口蹄疫病毒；DNA疫苗；多表位疫苗2 DNA疫苗的免疫原性为了比较这5个位点的不同组合效果，一共构建了5个质粒载体，并在小鼠体内进行效力实验的比较。42只小鼠（雌性，4-6周龄）随机平均分成7组，每组6只。1组和2组是阴性对照组，只注射PBS和pVAX1空载体。组3到组7分别注射构建的5个质粒载体DNA： pVAX-SG, pVAX-N4, pVAX-N51, pVAX-T51 和pVAX-51。所有的小鼠都注射2次，每次间隔3周，每次注射体积是100微升，量是200微克。血清中抗O型口蹄疫病毒的抗体用ELISA检测。脾脏淋巴细胞增殖用标准MTT法测定。脾细胞分泌的IFN-γ和IL-4用ELISA试剂盒定量分析。脾细胞CTL 活性用CTL检测试剂盒检测。CTL的靶细胞是用FuGENE 6转染试剂将线形化的pcDNA-SG转染P815细胞，然后用G418（0.4 mg/ml-1）筛选得到的病毒表位的稳定表达克隆。这些阳性克隆的表达进一步用ELISA和RT-PCR得到确定。阳性克隆维持在含G418（0.1 mg/ml-1）的培养基中。效应细胞是将分离的脾脏淋巴细胞在体外与全病毒蛋白(10 μg ml-1 )共孵育7天而得到。结果表明只有pVAX-SG, pVAX-N4 和pVAX-T51 能诱导抗体产生，但是所有的重组质粒都能诱导细胞免疫应答，如淋巴细胞增殖和明显的CTL活性，以及诱导不同水平的IFN-γ和IL-4。通过比较发现编码位点5, 1 和 T细胞表位的重组质粒能诱导全面的免疫应答，<WP=6>并且包含所有5个位点和T细胞表位的质粒pVAX-SG诱导了最强的免疫应答。
邵军军[4]2011年在《Asia 1、O型口蹄疫病毒多表位疫苗的研究》文中指出口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄兽猪、牛、羊等主要经济畜种发病的重大动物疫病。FMDV灭活疫苗作为FMD综合防控体系的重要组成部分,为有效防控和净化口蹄疫做出了十分重要的贡献,但灭活疫苗也存在诸多的缺点和不足,如需要区分疫苗免疫动物和自然感染动物,需要建设生物安全实验室;最为严重的是,病毒有逃逸生产车间的危险。分子生物学技术的发展以及合成肽免疫原性的证实,为研制FMDV抗原表位疫苗提供了理论依据和技术支持,人们对FMDV抗原表位疫苗进行了广泛的研究,在小动物模型显示出了良好的免疫效力,但是对本动物的免疫效果并不理想。近年来我国口蹄疫疫情有所抬头,出现A,O,Asia 1多个血清型交替流行的态势,严重地威胁我国畜牧业的健康发展,为了有效控制和净化在我国流行的FMDV,本研究针对我国目前流行的Asia 1型和O型FMDV毒株,利用分子生物学,蛋白质工程及其相关技术进行羊口蹄疫病毒Asia 1多表位疫苗和猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗的研究,为我国有效防控FMD提供优质安全的疫苗储备。针对目前流行的Asia 1型江苏毒株,设计并合成了病毒主要抗原VP1的135-160肽段和197-211肽段的重复串联表位基因(RE)。采用RT-PCR技术克隆了羊的免疫球蛋白重链恒定区基因(OIgGC)和Asia 1病毒的3D基因,将3D、RE、OIgGC分别或融合插入pET-30a构建了一系列重组表达质粒pRE-OIgGC,p3D,pOIgGC,将RE插入pGEX-4T-1构建了pGST-RE重组表达质粒,并实现了这些重组蛋白在E.coli的规模化表达及高通量纯化,所有重组蛋白以包涵体形式表达。Western blotting结果显示,重组蛋白RE-OIgGC,3D和GST-RE能与FMDV阳性血清发生免疫反应,OIgGC能与兔抗羊血清发生免疫反应。将适量的重组抗原与等体积的ISA206佐剂混合制备一系列疫苗,即OIgGC(100μg/ml),RE-OIgGC(100μg/ml),RE-OIgGC(100μg/ml)+3D(50μg/ml)和GST-RE(100μg/ml)。通过免疫豚鼠和羊体,测定血清中和抗体效价、淋巴细胞增殖实验和攻毒保护实验对候选疫苗进行免疫效力评价。免疫豚鼠结果显示,除了PBS和OIgGC组外,重组蛋白RE-OIgGC,RE-OIgGC+3D和GST-RE均能诱导产生保护性中和抗体,加强免疫后能保护动物抵抗103 ID50口蹄疫病毒的攻击。添加FMD病毒3D的多表位疫苗组的中和抗体水平最高,与灭活疫苗诱导的中和抗体效价没有明显的不同。以GST和为载体蛋白的重组抗原免疫豚鼠后血清中和抗体并没有明显差异。另外,添加3D蛋白的疫苗组诱导了最高水平的淋巴细胞增殖,充分说明了3D蛋白具有改善体液免疫反应和诱发T细胞免疫反应的能力。羊免疫结果显示,以宿主自身分子IgG重链恒定区为载体蛋白的2组多表位疫苗的中和抗体水平明显高于以GST分子为载体蛋白组,加强免疫后血清中和抗体效价明显快速升高,说明OIgGC发挥了生物学功能,明显改善了多表位抗原的免疫原性,而3D蛋白的免疫佐剂功能不是特别明显。设计并合成了FMD病毒O型主要抗原VP1的140-160肽段和200-213肽段的重复串联表位基因(RE)。利用RT-PCR扩增了猪的免疫球蛋白重链恒定区基因(SIgGC)和O型病毒的3D基因,将3D、RE、SIgGC分别或融合插入pET-22b成功构建了重组表达质粒pRE-SIgGC和p3D,并实现了RE-SIgGC和3D重组蛋白在E.coli的规模化表达及高通量纯化,以包涵体形式表达的重组蛋白经Western blotting证实具有免疫反应性。RE-SIgGC和3D重组蛋白经纯化后按照适当比例进行混合,并与与氢氧化铝、完全弗氏佐剂和ISA206等多种佐剂配伍成10种不同形式的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗,通过本动物猪免疫效力试验筛获了一种候选疫苗,单剂免疫猪体后免疫效力达到甚至优于传统灭活疫苗。随后用试制的叁批疫苗进行了候选疫苗的最小免疫剂量、免疫效力(PD50)、保存期和免疫持续期以及抗体消长情况测定,全面评价疫苗的免疫效力。结果显示,用抗原含量为83μg的疫苗免疫猪,不仅能诱发机体产生高滴度的保护性中和抗体,而且能保护猪只抵抗103 ID50口蹄疫病毒感染,5/5保护;叁批候选疫苗的PD50为5.20~10.05达到甚至高于国家标准(3.0 PD50);免疫动物后30天,血清中和抗体达到峰值,此后,随时间的延长中和抗体效价开始下降,免疫后7个月内血清中和抗体水平仍然维持在较高水平,大多数(70%)免疫动物能够抵抗病毒的感染;疫苗于2~8℃保存12个月并不影响疫苗的免疫效力。这些结果充分说明了本研究研制的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗是一种具有良好开发前景的疫苗,有望替代灭活疫苗用于我国口蹄疫病毒的防控。总之,通过本研究我们成功设计、构建了Asia 1和O型口蹄疫病毒的多表位疫苗的组装体系和表达体系,并实现了重组抗原的规模化原核表达和高通量纯化。通过引入具有重要免疫学功能的宿主自身分子IgG和具有佐剂功能的FMDV的3D蛋白,明显提高了多表位疫苗的免疫效力,并诱发了T细胞免疫反应。通过豚鼠和本动物羊和猪筛获了具有良好免疫效力的候选疫苗,尤其是筛获的猪口蹄疫病毒O型多表位候选疫苗不仅具有良好免疫效力,而且抗原用量少、免疫持续期长,疫苗在2~8℃保存稳定,是一种十分具有开发前景的疫苗,对其他动物病毒抗原表位疫苗的研制具有借鉴意义。
胡成玉[5]2012年在《O型FMDV多抗原表位基因克隆、表达及其免疫原性研究》文中提出口蹄疫(Foot-and-Mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth dis ease virus,FMDV)引起的偶蹄类动物共患的一种热性、急性、高度接触性传染病,被国际兽医局(OIE)列为A类疾病。口蹄疫传播迅速,给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失,直接威胁着人类食品安全,因此受到人们的重点关注。与发达国家采取捕杀的方式控制口蹄疫疫情不同的是我国目前对FMD的预防和控制主要是通过接种灭活苗,灭活疫苗虽然具有完整的免疫原性和很好的保护效果,但存在灭活不彻底、活毒逃逸等隐患。因此,研制安全、稳定、保护性好的FMD新型疫苗成为研究的重点,随着基因工程技术的发展,出现了多肽疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗、基因工程亚单位疫苗、植物疫苗等新型疫苗。针对目前流行的华南地区口蹄疫病毒毒株,设计合成Invasion immunstimula tory sequence+VP1(21-60)+VP1(141-160)+VP1(200-213)+VP4(20-40)+NSP3A(21-35)+T helper epitopes以及Invasion immunstimulatory sequence+[VP1(21-60)+VP1(141-160)+VP1(200-213)]3+T helper epitopes两段目的基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)上,经BamHI/HindIII双酶切鉴定及测序比较,结果显示,成功的构建了融合型表达载体pET32a-multi和pET32a-3re。将构建好的表达载体pET32a-multi和pET32a-3re转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析显示重组融合蛋白以包涵体的形式表达。目的蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量分别约为：38KD、50KD,与理论蛋白分子量一致。重组融合蛋白经尿素变性复性后,通过镍亲和层析得到纯化的融合蛋白fmdv-multi和fmdv-3re,经Western-blotting鉴定融合蛋白具有良好的免疫活性,为研究重组蛋白的免疫活性奠定了基础。将适量纯化后的fmdv-multi和fmdv-3re蛋白,与等体积弗氏佐剂充分混合乳化制备疫苗,皮下注射免疫Balb/c小鼠,以灭活商品苗作为对照组。免疫后通过间接ELISA检测诱导抗体,对候选疫苗进行免疫效力评价。结果显示fmdv-multi和fmdv-3re均能诱导小鼠产生抗O型口蹄疫抗体,和商品苗对照组效果相当,其中fmdv-3re蛋白免疫效果要优于fmdv-multi蛋白。此项研究为今后研制口蹄疫基因重组疫苗奠定了基础。总之,通过本研究我们成功设计、构建了O型口蹄疫病毒的多表位疫苗,实现了重组抗原的规模化原核表达和高通量纯化。通过引入具有重要免疫增强作用的T-helper使本研究的候选疫苗具有较强的免疫效力。在大生产过程中,通过对FMDV的时时监控,及时了解FMDV抗原表位的变异,及时制备多抗原表位疫苗,为研制廉价、高效的多表位疫苗奠定了基础
张攀[6]2013年在《亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒多抗原表位DNA疫苗免疫原性研究》文中研究说明为了构建AsiaⅠ型FMDV多抗原表位DNA疫苗，选择AsiaⅠ型FMDV的B细胞表位VP1135-159aa、VP1194-211aa及T细胞表位3A21-45aa、3D789-805aa。采用重复串联的策略，人工合成多抗原表位基因片段F。利用限制性内切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ将片段F克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)，构建出重组质粒pc-F；将PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析为阳性的重组质粒pc-F利用LipofectamineTM2000转染进入BHK-21细胞；通过Western Blot、间接免疫荧光标记法检测重组质粒pc-F在BHK-21细胞内的表达情况。通过RT-PCR技术从伴刀豆球蛋白A刺激培养的牛外周血淋巴细胞中扩增出牛IL-4基因，进行测序鉴定；利用PCR技术扩增出不含信号肽序列的IL-4基因片段SIL4，利用限制性内切酶NheⅠ/KpnⅠ将基因片段SIL4克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组质粒pc-SIL4。经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析后，将阳性重组质粒pc-SIL4转染BHK-21细胞，利用间接免疫荧光技术鉴定重组表达载体pc-SIL4在BHK-21细胞中的表达情况。为研究重组质粒pc-F作为DNA疫苗对实验动物BALB/C小鼠的免疫效果，将重组质粒pc-F单独或与重组质粒pc-SIL4联合以肌肉注射的方法免疫实验动物小鼠。同时设立对照组，包括PBS免疫组、pcDNA3.1(+)免疫组和灭活苗免疫组。结果显示：1)合成的目的基因片段F长759bp，编码244个氨基酸。片段F被成功的克隆到载体pcDNA3.1(+)上，且该基因片段F与合成报告中所提供的片段F的相似性为100%。2)牛IL-4基因序列长576bp，编码136个氨基酸，且与GeneBank上登录的牛IL-4基因序列相应片段的同源性为99.7%。不含信号肽的牛IL-4基因片段SIL4长342bp，编码氨基酸113个，被成功克隆到载体pcDNA3.1(+)上，且基因片段SIL4与GeneBank上登录的牛IL-4基因序列相应片段的同源性为100%。3)间接免疫荧光检测结果显示所构建的重组质粒pc-F和pc-SIL4能够在BHK-21细胞中正确表达，表达的蛋白有良好的反应原性。Western Blot结果显示重组质粒pc-F所表达蛋白的大小为25.4Ku。4)与PBS组和pcDNA3.1组相比，各疫苗免疫组小鼠血清特异性抗体IgG水平升高，淋巴细胞增殖能力增强，细胞因子IL-4、IFN-γ含量有不同程度升高。5) pc-F+pc-SIL4联合免疫组小鼠的特异性抗体水平略高于DNA疫苗pc-F单独免疫组。同时，pc-F+pc-SIL4联合免疫组小鼠外周血中INF-γ含量低于DNA疫苗pc-F单独免疫组，IL-4含量要高于DNA疫苗pc-F单独免疫组。
张春玲[7]2003年在《猪繁殖与呼吸综合征多表位疫苗的基础研究》文中指出猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度传染性疾病。其主要特征是引起妊娠母猪的繁殖障碍及各年龄特别是仔猪的呼吸道疾病，新生仔猪至断乳前病死率可高达80%以上。对世界各养猪国家造成了巨大的经济损失。目前对PRRSV的免疫主要运用传统的弱毒疫苗和灭活疫苗。传统疫苗在控制PRRSV上取得一定的效果，但是仍有一些不足之处：弱毒疫苗对与疫苗毒株遗传差异较大的异源毒株的攻击所产生的保护非常有限，且有散毒的可能；灭活疫苗所产生的保护力往往适应不了病毒自身很强的变异性。长期使用传统疫苗不利于根除PRRSV。本实验希望通过对PRRSV表位的研究，为PRRSV表位疫苗的研制提供基础依据。在对PRRSV的诊断中，酶联免疫吸附试验具有诊断速度快，敏感性高，特异性强等优点，是一种便于普及的好方法。但目前的诊断用抗原存在有种种缺点。本研究拟将串联的多表位在体外表达并纯化后作为诊断用抗原，以期建立诊断PRRSV感染的方法。该诊断抗原在理论上将比以全蛋白或单个结构蛋白作为抗原特异性强，敏感性高。本实验在查阅大量文献的基础上，比较了各种PRRSV的序列，根据已发表的文章，结合电脑软件，初步查找出了大量抗原表位。然后根据同源性选择高度保守的线性表位，其中包括结构蛋白GP5的四段线性表位和衣壳蛋白N蛋白的四段线性表位。各线性表位之间通过使用甘氨酸连结肽，人工的将其串联在一起。将串联线性表位8EP使用限制性内切酶PvuП从中间切开，分成两个小片段，其中一段含有ORF5的2个表位、ORF7的1个表位，共3个表位命名为3EP，另一段含有ORF5的2个表位和ORF7的3个表位，共5个表位，命名为5EP。将二者分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1。构建原核表达质粒pGEX-3EP和pGEX-5EP，转化受体菌BL-21后，IPTG诱导培养，均有目的蛋白表达。Western-blot分析表明，目的蛋白的具有良好的反应活性。将串联后的线性表位（8EP）亚克隆到杆状病毒表达载体pFASTBACHTa，命名为pFBH-8EP。将重组杆状病毒表达质粒pFBH-8EP转化大肠杆菌DH10BAC感受态细胞，得到重组转座子rBacmid8EP,将此重组转座子用脂质体介导的方法转染Sf9亚单层细胞，获得重组杆状病毒rBacmid8EP，PCR扩增分析证实目的基因片段已重组到杆状病毒基因组中。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明，串联线性表位8EP片段<WP=6>在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中获得表达。本研究为PRRSV以抗原表位为基础的基因免疫，及多表位DNA疫苗和亚单位疫苗的研究奠定了理论和物质基础。同时，原核表达产物纯化后，可作为PRRSV的诊断抗原。
杜进鑫, 王永录[8]2009年在《口蹄疫疫苗研究新进展》文中研究说明口蹄疫是世界性重大动物疫病之一。接种疫苗是预防该病的重要手段之一,而研制高质量、安全有效的疫苗,不但是决定疫苗免疫效果的关键,也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件。目前,除传统疫苗仍然在口蹄疫防控中扮演重要角色以外,国内外诸如亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、可饲疫苗和多表位疫苗等的研究和探索已全面展开,有望为口蹄疫的有效防控提供新的途径。
汪雪[9]2009年在《禽传染性支气管炎病毒B、T细胞抗原表位EpiW-GST多肽疫苗研究》文中认为禽传染性支气管炎是危害养禽业的重大传染病之一,它是由冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性高度接触性传染病,IBV在复制过程中很容易发生变异,血清型多,且各型之间交叉保护力弱,所以传统的灭活疫苗和弱毒疫苗还需改进。表位肽疫苗是一种纯粹抗原性疫苗,它安全、稳定,对多种血清型有交叉保护,已成为未来疫苗发展的重要途径之一。本研究采用本实验室前期设计的EpiW序列即包含了IBVB,T细胞抗原表位的一段基因序列为基础材料,对EpiW多肽进行生物信息学的验证分析,结果表明:目的片段保持了较高的同源性;其亲水性、抗原指数性和表面可能性较高;表位之间的连接序列(linker)不会干扰表位的独立性,可被切割成预计大小片段,保证了表位加工和递呈;表位肽主要位于重组蛋白结构表面,便于和抗原呈递分子结合,从理论上保证实验设计的准确性。将EpiW序列片段经过PCR定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建含IBVB,T细胞抗原表位序列EpiW的原核表达载体pGEX-EpiW,并经过PCR和酶切鉴定基因克隆正确后转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,EpiW基因片段获得了融合表达。利用GST谷胱甘肽凝胶,纯化了相应的抗原表位多肽EpiW-GST,并将其作为包被抗原,检测IBV标准阳性血清,初步研究表明抗原表位多肽能和阳性血清产生免疫反应;进一步采用Western blot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。为了评价多肽疫苗的免疫效果,将纯化的抗原表位融合多肽EpiW-GST配以弗氏佐剂进行动物免疫试验,并以灭活苗、GST和PBS为试验对照组,细胞免疫采用流式细胞仪(FACS)对免疫鸡外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞数进行检测,IBV特异性抗体采用ELISA法进行检测,并进行攻毒试验。结果表明:EpiW-GST能有效激发鸡体特异性体液和细胞免疫,EpiW-GST多肽组检测到特异性抗体,与对照组差异显着(P＜0.05)。EpiW-GST多肽疫苗免疫后能刺激CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类水平增高,与对照组差异显着(P＜0.05)。攻毒试验表明,EpiW-GST多肽保护效果较好,略低于灭活苗。本研究进行了IBV多肽疫苗免疫原性的研究,为传染性支气管炎的多肽疫苗和血清学抗体诊断的研制提供了一种基础材料。
李登科[10]2014年在《口蹄疫A型病毒AF72株多抗原表位重组蛋白的免疫原性研究》文中提出为构建A型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)AF72株多表位重组蛋白亚单位疫苗并评估其免疫原性,本研究在以下几个方面进行了探索：1.从伴刀豆球蛋白A刺激培养的牛外周血淋巴细胞中扩增出牛IL-2基因,再利用PCR技术扩增出不含信号肽的牛IL-2基因(PIL2)并将其克隆至原核表达载体pGEX4T-1中,以BL21(DE3)宿主菌进行诱导表达,获得牛IL-2蛋白；将纯化的蛋白与ISA206佐剂乳化造苗后免疫豚鼠制备牛IL-2蛋白的豚鼠抗血清。2.将AF72株上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VPl200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来,构建多表位基因B；通过PCR技术扩增出不含信号肽的牛IL-2基因,并利用限制性内切酶ApaI与KpnI将其克隆至多表位基因B,构建融合多表位基因BIL2；将上述的两个基因利用限制性内切酶BamH I与Xho I克隆至杆状病毒表达载体pFastBacTMHTB,并将经酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBacTMHTB-B与pFastBacTMHTB-B转化至E.coli DH10Bac感受态细胞,进行蓝白斑筛选,将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用Cellfectin(?) Ⅱ Reagent转染至Sf9细胞,分别通过间接免疫荧光(IFA)和Western-blot检测表达情况,并摸索了表达条件,进行重组蛋白大量表达与纯化。3.将得到粗提蛋白与ISA206佐剂乳化制备疫苗,并以豚鼠评价其免疫效果。利用间接ELISA方法和微量细胞中和试验分别检测了豚鼠血清中特异性抗体滴度定。通过对细胞因子IL-4与IFN-γ的检测,淋巴细胞增殖能力测定,外周血T淋巴细胞CD4-CD8亚群和IgG亚群鉴定分析,评估了体液和细胞免疫应答情况。研究结果显示：1.成功的从牛外周血中克隆出牛IL-2基因,基因序列全长为477bp,编码158位氨基酸,将不含信号肽牛IL-2基因进行原核表达得到38kDa左右的蛋白,乳化造苗后免疫豚鼠制备的豚鼠抗血清效价在1：12800～1：25600之间。2.将构建的基因B与基因BIL2,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行表达,以A型FMDV猪抗阳性血清为一抗,通过IFA和Western-blot进行检测分析,分别得到了21.3kDa和35.2kDa左右的蛋白；以制备的牛IL-2蛋白的豚鼠抗血清,通过IFA和Western-blot进行检测分析得到了35.2kDa左右的蛋白,并实现了目的蛋白的大量表达。3.将提取的粗蛋白乳化造苗后免疫豚鼠,经测定v-B免疫组、v-BIL2免疫组和A型灭活苗免疫组豚鼠均产生较高水平的特异性抗体；v-BIL2免疫组的IFN-γ、IgG2a抗体以及CD4-CD8T淋巴细胞水平明显高于v-B免疫组,并且以v-BIL2免疫组特异性T淋巴细胞增殖能力最强。上述结果表明,两种正确表达重组蛋白均在豚鼠体内诱导产生了体液免疫应答和细胞免疫应答,并且细胞因子IL-2在一定程度上能够增强豚鼠体内的细胞免疫应答。
参考文献：
[1]. O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫[D]. 马海利. 吉林大学. 2008
[2]. 口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究[D]. 张洪英. 第二军医大学. 2003
[3]. 口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性[D]. 黄力. 河北医科大学. 2004
[4]. Asia 1、O型口蹄疫病毒多表位疫苗的研究[D]. 邵军军. 甘肃农业大学. 2011
[5]. O型FMDV多抗原表位基因克隆、表达及其免疫原性研究[D]. 胡成玉. 湖南农业大学. 2012
[6]. 亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒多抗原表位DNA疫苗免疫原性研究[D]. 张攀. 中国农业科学院. 2013
[7]. 猪繁殖与呼吸综合征多表位疫苗的基础研究[D]. 张春玲. 新疆农业大学. 2003
[8]. 口蹄疫疫苗研究新进展[J]. 杜进鑫, 王永录. 生物技术通报. 2009
[9]. 禽传染性支气管炎病毒B、T细胞抗原表位EpiW-GST多肽疫苗研究[D]. 汪雪. 四川农业大学. 2009
[10]. 口蹄疫A型病毒AF72株多抗原表位重组蛋白的免疫原性研究[D]. 李登科. 中国农业科学院. 2014
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