1. *河北医科大第一医院核医学科 石家庄 050081
2. *河北医科大第二医院核医学科 石家庄 050000
3. 四川大学华西医院核医学科 成 都610041
【摘要】目的 制备脂质体包裹胞嘧啶(Cytosine C)鸟嘌呤（Guanine G）含量低离启动子位置较近的99Tcm–HYNIC(联肼尼克酰胺)–survivin ASODN （Antisense oligodeoxynucleotide反义寡脱氧核苷酸），行荷人肝癌SMMC-7721裸鼠体内分布研究，探讨此反义药物制备过程及动物体内的分布，筛选出最佳反义制剂碱基序列，提高诊断和治疗效果。方法 以survivin为靶序列制备G、C含量均为10%的20个碱基单链ASODN和SODN，偶联HYNIC，99Tcm标记后经Cellufine GH-25纯化后脂质体包裹。对荷瘤裸鼠行生物学分布，ASODN和SODN两组计量资料比较均通过SPSS13.0统计软件，所有数据均采用均数 标准差，用两样本t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。结果：此反义药物经优化筛选序列，HYNIC耦联，99Tcm标记-脂质体包裹-cellufine GH-25 纯化后稳定性较好，在血清中培育前后标记率无明显变化，放化纯均可高达95%。在4h时荷瘤鼠内肝、肾%ID/g值分布相对较低分别为肝内ASODN,2.47 0.02;SODN,2.05 0.04；肾内ASODN,1.50 0.06; SODN,1.96 0.03；T/NT值ASODN较高为 4.73 0.02;SODN为1.48 0.03二者差异有统计学意义（t=3.622 p<0.05）。结论：反义序列的选择是反义药物制备的关键，该研究使用全长基因寻靶技术并使G、C含量少、离启动子位置近的碱基序列制备出的反义药物具有肿瘤聚集率高，副作用少的优点，可进一步指导临床，提高诊断与治疗效果，减少副作用。
【关键词】锝标记；反义药物；制备；动物实验
目前恶性肿瘤发病率日趋增高，迄今诊断及治疗恶性肿瘤的方法很多其中反义药物与靶序列的结合具有特异性，能提高恶性病变诊断效率，故反义探针的制备很关键 [1]。国内外有关肿瘤反义显像及反义治疗的文献报道多数由于效果差及副作用难以在临床上广泛应用，为了提高显像与治疗效果，减少副作用，需要优化反义药物，笔者已研究证实了反义寡核苷酸中G启动子位置[2]和C等碱基在体内影响肿瘤特异性聚集。通过在体外筛选到的最佳靶点制备出的反义寡核苷酸在体内可能由于非特异性作用而失去了最佳显像及治疗效果，并且可能会引起肾损害等副作用，为了克服上述缺点，笔者将优化反义药物的制备过程阐述如下。
1.材料与方法
1.1实验动物与人肝癌细胞株SMMC-7721
BALB/C雄性裸小鼠20只，4周龄，体重15~18克，购于中国药品生物制品检定所实验动物中心，合格证号：0158085，饲养于白求恩国际和平医院实验动物中心。人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.2人SMMC-7721肝癌裸鼠模型的制备
用无菌注射器抽取人SMMC-7721肝癌细胞悬液7×106/0.2ml，接种于健康BALB/C裸小鼠右侧髂窝皮下，并在SPF环境继续饲养6~8w后，待肿瘤直径达0.8cm~1.0cm时，选取生长良好大小无显著性差异的荷瘤小鼠进行实验。
1.3主要仪器与试剂
主要仪器:美国GE公司产Infiniavc Hawkeye SPECT/CT显像仪,C18反向层析柱北京师范大学化学学院陆洁博士赠予,CellufineMini-Column及Chisso纤维素基凝胶填料CellufineGH-25由北京慧德易公司提供，N-1001旋转蒸发仪产于上海爱朗仪器有限公司。Scl-10AVP型HPLC仪，Packard Bioscience company。试剂:ASODN、SODN上海生工公司提供，HYNIC北京师范大学化学学院陆洁博士赠予，脂质体Lipofectamine 2000为美国Invitrogen公司产品。99Mo-99Tcm发生器中国原子能科学研究院提供。其他试剂由河北医科大第一、二医院核医学科实验室提供。
1.4脂质体包裹99Tcm -HYNIC- DNA的制备
survivinASODN的靶序列的选择：先通过全长基因寻靶技术[3]经细胞学验证后筛选出12条20mer的序列。我们曾对G及与启动子相对位置是否影响反义寡核苷酸的非特异性聚集进行研究发现G含量越高，离启动子距离越远非特异性聚集率越高。之后对C研究中发现胞嘧啶含量越高，非特异性聚集越明显，主要表现在双肾内放射核素浓聚水平越高。故我们最后选择离启动子位置近，G/C含量相对较低的1条序列来制备显像剂。
序列正义链SODN(596-615) 5’-ATTTTCAAATTAGATGTTTC-3’
反义链ASODN（10%G/10%C）5’-GAAACATCTAATTTGAAAAT-3’。
HYNIC与DNA的偶联：1将HYNIC溶于纯二甲基甲酰胺（DMF）中，质量浓度为10mg/ml；2将DNA离心一万转1~2分钟，慢慢打开盖，加每管114ul共228ul缓冲液后盖上管盖，充分震动5~10分钟；3取DNA 68.6ug (22.8nmol)）以25mmol/L碳酸氢盐缓冲液（ph值8.5）溶解，终质量浓度为5ug/ul（13.72ul）于60°C水浴10min后，立即浸入冰水中冷却半分钟或更久；4在n（DNA）：n（HYNIC）=1：20（22.8nmol：456nmol）振荡条件下HYNIC逐滴加入DNA中，室温下反应60min。
经Sep-pakC18反相层析柱纯化后分步洗脱：用10ml 25mmol/L碳酸氢铵溶液；②用10ml 25mmol/L(25umol/ml)碳酸氢铵溶液和体积分数5%乙睛溶液20ml三蒸水和体积分数5%乙睛溶液；③用4ml 三蒸水和体积分数30%乙睛溶液洗脱含HYNIC-DNA的部分④收集流出液，经紫外分光测定260nm处吸光度，收集峰管，按每管10ug分装，经旋转蒸发仪悬蒸约20~30分钟以除去有毒溶剂乙腈溶液。
HYNIC-DNA的锝标记：标记时直接取悬蒸后的HYNIC-DNA液0.5ml（7.5ugASODN）加入质量浓度为70g/L的tricine溶液1ml、新鲜配置溶于0.1mmol/L盐酸的Sncl2溶液（1g/L）0.1ml和99Tcm 222~259MBq，混匀后100℃水浴30分钟，静置1h后4℃冰箱冷藏备用。
99Tcm-HYNIC-DNA纯化：将99Tcm标记DNA后用Cellufine Mini-Colu-mn（内装有Chisso纤维素基凝胶填料CellufineGH-25，分子量＞3kD的物质可被滤出）纯化经ZD-600099Tcm分析仪，测定收集放射峰管，然后脂质体包裹备用。
99Tcm-HYNIC-survivinASODN脂质体包裹：将1mlDNA液稀释于2.5mlDMEM中，室温下5min，将100ul（脂质体）稀释于2.4mlDMEM中室温下5min，将两部分混合用吸管轻轻吹打室温放置20分钟。
1.5标记寡核苷酸的质量鉴定
标记率的测定:高效液相色谱仪（HPLC）测定，取反应物12μL加入C18反相柱中，液相为乙腈和水，流速为1ml/min。标记物在生理盐水及血清中的稳定性：将标记物分别置于生理盐水和血清中37℃保温6h后用HPLC法测定其标记率以评价标记物的稳定性。
1.6 脂质体包裹99Tcm -HYNIC-DNA对荷人肝癌裸鼠的体内分布研究
实验分正义和反义两组，每组随机取5只裸鼠，均眼静脉取血后脱颈处死，迅速分离其肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、对侧肌肉等脏器组织，生理盐水洗涤后滤纸粘干、称重，置于试管中用γ井型探测仪计数并计算各器官组织（包括肿瘤组织）的放射性计数占标准源总放射性计数的百分注入活度（%ID/g）值及4h时T/NT值。
2. 结果
2.1脂质体包裹99Tcm -HYNIC- DNA的质量鉴定HPLC检测99Tcm -HYNIC-DNA呈单峰，保留时间约18min见Fig.A与DNA紫外峰保留时间相吻合见Fig.B即刻标记率70%±0.69%，n=5。放化纯为95%左右，与生理盐水及人新鲜血清37℃保温6h后放化纯分别约93%、90%。
2.2生物学分布：
两组小鼠的各组织%ID/g值及T/NT值见表1，结果比较：正义组T/NT值明显低于反义组。经统计学分析显示差异有统计学意义（t=3.622
p=0.022<0.05）。
Fig.1 The HPLC peak time of 99Tcm-HYNIC- survivinASODN(A) was similar to the single peak time (B)
ASODN、SODN制剂分别在注射后4h荷瘤鼠体内的生物分布
ASODN肿瘤内分布较显著，SODN肿瘤内分布较少，两组
T/NT值差异有统计学意义（t=3.622 p<0.05）。
3讨论
反义核酸通过碱基配对与细胞内核酸特异结合在转录和翻译水平调节靶基因的表达,合成简单,具有理论上的高度靶特异性，在体液中也比较稳定。通常选择15~20个碱基的ASON，过短将影响其结合的特异性，易出现同源重复序列，过长则易扭曲或形成二级结构[4]。本实验选用20个碱基的正反义链。研究发现G含量越高，离启动子距离越远非特异性聚集率越高[3]。之后又发现C含量越高，非特异性聚集越明显，主要表现在双肾内放射核素浓聚水平越高。王丹等通过全长基因寻靶技术[4]通过细胞学验证后筛选出12条序列。我们从中选离启动子较近、长度合适、G、C含量较少，包含有效结合位点的正反义制剂均含20个碱基，用于肝癌裸鼠模型体内研究。
因未经修饰的反义寡核苷酸在细胞中易被核酸酶降解,硫代修饰是目前研究最多、应用最广[5]。但硫代修饰每修饰一次，解链温度下降0.5~1℃，这样杂交性能降低，细胞摄取下降[4]。目前许多报道[6] 建议仅对核苷酸链末端进行硫代化。蒋洪超等[7]学者认为硫代修饰两端的各一个磷酸基在约50%的人血清中非常稳定，与全部磷酸基修饰的核酸几乎有同样的抗降解效果。本研究将核酸两端五个磷酸基硫代修饰。由于核酸相对分子量大水溶性高以及带有很强的负电荷,不能通过细胞膜,反义DNA必须通过细胞膜和核膜两道屏障,需借助于一定的载体，其中阳离子脂质体是近年来倍受研究者重视的非病毒类载体之一[8]。故将标记纯化后的核酸用脂质体2000包裹以增加细胞摄取，其机制可能由于脂质体膜与细胞膜结构相似，致使细胞膜容易吸附大量脂质体并通过大胞饮或介导内吞入胞[9] 。核素反义技术是利用放射性核素标记人工合成的ASODN引入体内后,通过碱基互补原则与病变组织中过度表达的目标DNA或mRNA发生序列特异性结合，在体外对病变组织进行显像及治疗,从而达到在基因水平诊断及治疗疾病的目的。目前基因显像最常用的放射性核素是99Tcm,由于空间位阻效应等原因常不能直接标记需用螯合剂[10]。本实验将核酸的5’-末端氨基修饰后偶联HYNIC再用99Tcm标记，后经旋转蒸发仪悬蒸约20~30分钟除去有毒溶剂乙腈液, 99Tcm-HYNIC-survivinASODN
即刻标记率较低约70%需纯化后使用。Cellufine Mini-Column内装有Chisso纤维素基凝胶填料 CellufineGH-25，该填料是球形多孔纤维素质粒，可使分子量＞3kD的物质被滤出，99Tcm - YNIC-survivinASODN分子量＞19kD故可被滤出，游离锝及锝胶体在一定时间内（一般＞1min）被滞留于柱内[3]。纯化后测定放化纯可达到95%。本实验通过将标记物分别与生理盐水及人新鲜血清在37℃保温6h后，测定标记率及放化纯，二者变化不明显，说明此标记物血清蛋白结合率低，稳定性好，从而证实了通过HYNIC耦联，99Tcm标记-脂质体包裹cellufine GH-25 纯化后基因显像剂稳定性较好，可供进一步实验研究。
Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，大多数肿瘤组织如乳腺癌、肝细胞癌、肺癌等都有表达，而正常组织不表达或低表达，可调节细胞增殖和促进血管形成，与肿瘤发生、发展及预后密切相关[11]。Survivin基因起始密码子上游-1430至+30是survivin的启动子基因片段[12]。以往的反义核酸研究中发现反义核酸由于肿瘤摄取率低本底高等缺点限制了其临床运用。如何提高肿瘤特异性摄取率，提高反义药物的诊断和治疗效果的研究有重要的学术价值。该研究使用全长基因寻靶技术并使G、C含量少、离启动子位置近的碱基序列制备出的反义药物具有肿瘤聚集率高，副作用少的优点，可进一步指导临床，提高诊断与治疗效果，减少副作用。
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论文作者:贾红丽,冯珏,赵祯,张秀梅2方凤宁2杨阳2张建阳,
论文发表刊物:《健康世界》2015年7期
论文发表时间:2015/9/30
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