摘要：采用不同浓度的氨苄青霉素处理雨生红球藻，用以确定氨苄青霉素这种抗生素对雨生红球藻生物量、色素含量、虾青素积累、油脂和多糖等生物质的影响程度。研究结果表明：低浓度对雨生红球藻生长略起促进作用；随着浓度变化，氨苄青霉素对虾青素、油脂、多糖的影响较为显著。
关键词：雨生红球藻；氨苄青霉素；虾青素；油脂和多糖
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是淡水单细胞绿藻，在分类学上隶属于红球藻科、红球藻属，在特定条件下可以产生大量虾青素。雨生红球藻积累虾青素高达干重的3~4%，被认为是生产虾青素的一种很有前途的细胞工厂。大量文献报道，雨生红球藻利用环境因子积累虾青素，例如光照、温度、pH、营养饥饿等。但利用抗生素诱导雨生红球藻的研究鲜有报道。据研究，抗生素对细菌生长繁殖的抑制作用较强[1，2]。由于微藻对抗生素耐受程度比细菌更强，可利用抗生素处理微藻，得到无菌藻株。
氨苄青霉素（Ampicillin），是一种β-内酰胺类抗生素，广泛用于人类和动物的抗菌疗法。抗菌机制是阻止细菌合成细胞壁，不仅能抑制其增殖，而且能直接杀灭细菌。氨苄青霉素的过度使用和不完全代谢导致其在废水中的浓度范围从μg/L到mg/L水平，使得抗生素检出浓度较高。含抗生素废水具有抑菌作用，废水微藻耦合培养是微藻资源化利用的一种有效处理方式。有文献报道，氨苄青霉素质量浓度为 10~200 μg/mL时，对FACHB-712藻株生长具有促进作用[3]。本实验首先探究氨苄青霉素对雨生红球藻生物量、色素、虾青素、油脂、多糖等生物质的影响，为进一步药物废水微藻资源化利用提供基础参数和理论依据。
1.材料与方法
1.1实验培养
雨生红球藻（Haematococcus?pluvialis，FACHB-712），购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。藻种保存及扩大培养均在光照培养箱（MGC-400B）采用BG11培养基，其培养条件：温度为22 ℃，光照强度为50 μmol m-2 s-1，光暗比12 h：12 h。气升柱式玻璃管的光生物反应器利用毛细管持续通入5% CO2体积，使藻种悬浮生长。利用柱式光生物反应器研究双氯芬酸钠对雨生红球藻生长的影响，设置浓度梯度为：0 mg/L（空白）、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。每组实验三个平行样，将藻种接种于0.7 L培养基，初始接种浓度为0.3 g/L，室温培养14 d后检测分析。
1.2分析方法
用重量法测定雨生红球藻生物量干重[4]。
虾青素含量测定采用分光光度法[5]。
根据文献[6]测量雨生红球藻的色素含量，用96%乙醇溶液提取测定。
采用氯仿/甲醇抽提的方法[7]，测定总脂含量。
利用蒽酮硫酸法测定多糖含量，利用葡萄糖标准品制作标准曲线。
2.结果与讨论
2.1生物量
雨生红球藻在不同浓度氨苄青霉素的影响下，生物量变化如图1所示。由图可以看出，不同浓度氨苄青霉素作用下，其生物量均稍高于对照组，呈直线增加，从最初0.29~0.35 g/L到1.95~2.03 g/L。结果表明，氨苄青霉素略促进雨生红球藻生长，但不同浓度的氨苄青霉素对生物量影响不大。低浓度的起略促进作用，但高浓度并未产生明显的抑制作用，这与郑凌凌等研究改变了细胞数[3]相反，可能是因为氨苄青霉素增加细菌的粘附力和破裂长度、改变细胞粗糙度[8]，但并未减少其生物量；或者浓度不够高不足以产生抑制作用。
图1 氨苄青霉素对雨生红球藻生物量影响
2.2色素含量
类胡萝卜素含量在不同浓度氨苄青霉素变化如图2所示。不同浓度的影响与对照组趋势一致，类胡萝卜素先直线增到最大值6.1~6.8 mg/L，随后迅速降到3.1~3.4 mg/L，再缓慢增加。不同浓度的氨苄青霉素略起促进作用，尤其是10 mg/L的影响更为明显。结果表明氨苄青霉素对雨生红球藻的光合作用可能产生了影响，进而影响其类胡萝卜素含量。
图3 氨苄青霉素对雨生红球藻虾青素影响
2.4油脂和多糖
雨生红球藻在光生物反应器中培养12 d后，收获后测其油脂和多糖含量。不同浓度氨苄青霉素对油脂和多糖含量的影响如图4所示。由图可知，不同浓度氨苄青霉素的油脂含量均远低于空白对照组油脂含量（9.40 ± 0.28%）；随氨苄青霉素浓度的增加，其抑制作用更强。结果表明，不同浓度的氨苄青霉素的添加对油脂合成均产生明显地抑制作用。随氨苄青霉素浓度的增加，多糖含量也逐渐增加，其多糖含量均高于对照组的5.14 ± 0.15%，最高达到9.89 ± 0.92%，结果表明氨苄青霉素有利于促进多糖的合成。研究表明，氨苄青霉素对细菌细胞壁中肽聚糖的生物合成具有抗菌作用，这将导致形态和细胞质膜损伤，进一步影响微生物的正常功能。不同浓度的氨苄青霉素对雨生红球藻的油脂、多糖具有显著影响，可能是因为抗生素引起了微藻细胞损害。
图4 氨苄青霉素对雨生红球藻油脂和多糖影响
3.结论
低浓度氨苄青霉素略促进雨生红球藻生长，但不同浓度的氨苄青霉素对雨生红球藻生物量生长影响不大。不同浓度的氨苄青霉素对类胡萝卜素含量略起促进作用，尤其是10 mg/L影响较为显著。低浓度的氨苄青霉素可用以促进虾青素的积累。不同浓度的氨苄青霉素对油脂合成产生明显地抑制作用，却促进多糖的合成。由此可知，低浓度的氨苄青霉素有助于雨生红球藻积累生物量、虾青素、油脂，较高浓度的反而利于多糖的增长。
参考文献：
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[3] 郑凌凌，张琪，李天丽，等. 雨生红球藻无菌化处理及其对生长和生理的影响[J]. 福建师大学报（自然科学版），2017（1）：44-50.
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[8] Laskowski D，Strzelechi J，Pawlak K，et al. Effect of ampicillin on adhesive properties of bacteria examined by atomic force microscopy[J]. Micron，2018：S0968432818300696.
论文作者:周婧斐
论文发表刊物:《防护工程》2019年第5期
论文发表时间:2019/6/5
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