（扬州大学第二临床医学院 江苏 扬州 215000）
【摘要】目的：研究缺血预处理(IP)对大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)损伤中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）及超微结构的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(每组5只)。正常组(N组)；缺血再灌注(I/R)组；缺血预处理(IP)组。各组均在术后3h后取组织进行检测。酶标仪检测肝脏匀浆超氧化物歧化酶（SOD）及一氧化氮（NO）的含量；用透射电子显微镜观察各组心肌组织的超微结构，并进行线粒体评分。结果：与单纯I/R相比，IP预处理明显增加SOD含量同时减少NO释放 (P<0.05)；电镜显示肝癌细胞N组结构正常，I/R组损伤最严重，IP组介于N组与I/R组之间。N组、IP组线粒体评分均低于I/R组(P<0.05)。结论：缺血/再灌注可对肝脏细胞超微结构造成严重损伤，使线粒体评分分值增加，造成肝脏损害。缺血预处理可产生肝脏保护作用。
【关键词】肝脏缺血再灌注；缺血预处理；SOD、NO；超微结构
肝脏缺血预处理（IP）是指一次或多次短暂性肝脏缺血再灌注后．诱导肝脏组织产生内源性保护机制，使其对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受[1]。本实验旨在探究IP减轻大鼠肝脏I/R损伤的相关机制，SOD、NO，线粒体超微结构激的影响。
1.材料与方法
1. 1实验动物分组：健康雄性SD大鼠,鼠龄10-12周, 体质量250-300g, 共15只，随机分为3组(每组5只)。所有动物术前12h禁食，自由进水，采用戊巴比妥麻醉，固定动物，常规脱毛消毒。取上腹部正中直切口约3cm，进腹后找到肝十二指肠韧带（所有动物实验符合扬州大学动物伦理委员会要求）。各组大鼠处理：N组：仅行麻醉、剖腹，保持开腹时间与IR组相同IR组：游离肝周韧带，解剖肝门，完成Pringle法，用无创血管夹夹闭第一肝门，完全阻断入肝血流，持续30min后撤除血管夹，恢复入肝血流，记时间点，逐层关腹，术后自由饮食。IP组：在I/R前先阻断肝左、叶血流10 min，然后开放血流10 min，其余步骤同I/R模型组。各组均在灌注3h后取材检测。
1.2检测方法
1.2.1 SOD及NO含量测定
肝脏再缺血再灌注后收集肝脏组织，置入0.9%氯化钠盐水中清洗表面血液后置入液氮中冻存，使用时利用生理盐水制成10%组织匀浆，采用采用比色法测定肝脏组织匀浆中NO的含量及SOD的活性；采用SOD及NO试剂盒（南京凯基生物科技有限公司），SOD、NO含量。
1.2.2 肝脏超微结构的观察
透射电镜观察：移植后取新鲜肝组织约1×1×1(mm)，用2.5％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，梯度乙醇脱水后氧化丙烯浸透，环氧树脂包埋，超薄切片，将超薄切片置于透射电子显微镜下观察并拍照。同时进行线粒体损伤评分。每个电镜标本随机选择5个视野，每个视野随机选择20个线粒体，使线粒体总数达100个，采用Flameng评分标准 (见表1) ，将观察到的每个线粒体损害程度按0~4级，分别计为0~4分，最后将100个线粒体所得总分除以100，既为该标本得分，分数越高，表示线粒体损伤越重，具体标准参考文献[2]制定。
1.3统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1肝脏SOD、NO含量变化
与N组比较，IR组和IP组肝脏组织NO水平升高，SOD活性降低(P<0.05)。与I/R组相比，IP组NO含量降低，有统计学意义(F=18.64,P<0.05)；与I/R组相比，IP组SOD含量增高，有统计学意义(F=50.82,P<0.05)。
2.3线粒体评分
线粒体评分采用线粒体Flameng评分法，对各组大鼠肝脏组织线粒体评分，结果显示：N组为（0.201±0.051）分，IP组（1.031±0.061）分，I/R组为（3.201±0.037）分。I/R组明显高于IP组，差异有显著性（P<0.01）；IP组明显高于N组，差异有显著性（P<0.01）。
3.讨论
研究表明一定的缺血预处理可以减轻器官的损伤，比如脑，心脏[3]。缺血预处理对于肝脏的相关保护机制目前研究较少，因此我们运用SD大鼠作为动物模型，建立缺血再灌注模型，并进行缺血预处理，阐释缺血预处理去肝脏缺血再灌注损伤的保护作。
SOD是一种天然的超氧化物清除剂,其活性高低反映组织清除氧自由基的能力。本实验研究发现肝脏缺血再灌注后细胞超微结构显示肝细胞有明显损伤。肝细胞缺血缺氧后ATP减少，乳酸水平增加，游离脂肪酸增多，使脂质过氧化增加，从而SOD活性降低。在I/R组我们发现SOD的活性与N组和IP组相比明显降低(P<0.05)。说明肝脏缺血再灌注可以明显降低细胞SOD的活性。同时IP组SOD 活性和I/R组相比明显升高，说表明其清除氧自由基的能力增强。
在应激或者疾病状态下产生的NO，参与疾病的病理过程，发挥其细胞毒性作用。因为由诱导型NOS(iNOS)诱生的NO可以通过作用于巯基、与超氧阴离子反应、或直接损伤DNA等加重细胞损伤。同时NO是粒细胞黏附的介质，在缺血再灌注过程中可形成氧化氮物，从而导致血管收缩。肝脏缺血再灌注后可使窦状间隙停滞产生无再流现象。本研究中I/R组与N组和IP组比较，NO明显增加(P<0.05)，说明缺血再灌注损伤可以使NO释放，参与细胞毒性损伤。同时IP组NO较I/R明显降低，说明缺血预处理可以抑制NO释放，参与肝脏缺血再灌注后细胞的保护作用。
线粒体是肝细胞主要的供能结构，当肝脏发生缺血再灌注时，线粒体可产生大量ROS，使线粒体膜磷脂、呼吸链蛋白产生强烈的氧化损伤，导致氧化磷酸化障碍，造成线粒体结构及功能损伤，从而损害肝脏功能。我们运用电镜观察各组的线粒体损伤情况，可见I/R组线粒体损伤明显，多数线粒体水肿，空泡增多，线粒体膜崩解，线粒体嵴断裂或嵴消失。而IP组线粒体线粒体结构基本完整，膜基本完整，部分轻度肿胀，嵴突少许破坏但是脊排列整齐。
综上所述，本研究结果表明，缺血预处理减轻再灌注所致肝细胞超微结构损伤，其具体机制可能为IP增加了肝细胞SOD活性，同时减少NO释放，保护线粒体免受损伤，由此可推测出肝脏缺血预处理可产生肝脏保护作用。
参考文献
[1]陶立德,薛同敏,张杰,等. 缺血预处理对大鼠缺血再灌注肝组织NF-κB表达、炎症及氧化应激反应的影响[J].中国普通外科杂志, 2015,24(1):70-74.
[2]王颖,张永国,侯伟波,等.吡那地尔后处理对缺血/再灌注大鼠离体心脏超微结构的影响[J].遵义医学院学报, 2014,37(6):595-597.
[3]张琼,喻田,傅小云等.缺血预处理对大鼠离体心脏心肌线粒体功能的影响[J].中华麻醉学杂志, 2007,27(8):745-747.
【基金项目】：江苏省扬州市自然科学基金面上项目（编号：YZ2014064）
【通讯作者】马克杰 作者单位，江苏扬州，扬州大学第二临床医学院225002
论文作者:焦秀萍 张淼 马克杰,薛同敏 张杰 陶立德
论文发表刊物:《徐州医学院学报》2015年11月第35卷总第21期
论文发表时间:2016/4/28
标签：线粒体论文; 肝脏论文; 损伤论文; 结构论文; 大鼠论文; 超微论文; 组织论文; 《徐州医学院学报》2015年11月第35卷总第21期论文;