（怀化市溆浦县食品药品工商质量监督管理局 419300）
摘要：目的 分析高效液相色谱（HPLC）法测定肾康（通肾络）超微粉胶囊中大黄（大黄素、大黄酚汁）含量的方法。方法 采用紫外检测器，以大黄素和大黄酚为对照品对自制的肾康胶囊中大黄（大黄素、大黄酚汁）进行含量测定，其中色谱柱：Phenomsil BDS-C18柱（250 mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液-甲醇（体积比为45：15：40），柱温：30℃，进样量：10μl，流速：1.0 mL/min。结果 大黄素和大黄酚分别在3μg/ml~30μg/ml、10μg/ml~50μg/ml范围内保持着较好的线性关系，其各自平均回收率分别为98.91%、98.58%，RSD分别为1.84%、1.52%；精密度试验显示二者的RSD分别为0.9%、0.6%。结论 高效液相色谱法可作为测定肾康（通肾络）超微粉胶囊中大黄（大黄素、大黄酚汁）含量的方法，其具有灵敏度、准确度高、操作简单及无干扰、重现性好等优点，可在临床检验中推广使用。
关键词：高效液相色谱；HPLC；肾康超微粉胶囊；大黄；大黄素；大黄酚汁
[Abstract] objective：to analyze the method of HPLC（HPLC）in determining the content of rhubarb（rhubarb and rhubarb juice）in renal capsule. Methods using uv detector，emodin and rhubarb phenol as reference substance of homemade rhubarb in the renal capsule（emodin，rhubarb juice）for content determination，the chromatographic column：Phenomsil BDS - C18 column（250 mm x 4.6 mm，5 microns），mobile phase：acetonitrile - methanol - 0.1% phosphoric acid solution（volume ratio for the forth：40），column temperature：30 ℃，sample quantity：10 mu l，flow rate：1.0 mL/min. Results in the range of 3 mu g/ml ~ 30 mu g/ml，10 mu g/ml ~ 50 mu g/ml ~ 50 mu g/ml，the average recovery rate was 98.91 %，98.58 %，RSD 1.84 % and 1.52 % respectively. The accuracy test showed that the RSD was 0.9 % and 0.6 % respectively. Conclusion HPLC method can be used as the determination of renal（kidney）winding superfine powder capsule in rhubarb（emodin，rhubarb juice）content，the method of its sensitivity，high accuracy，simple operation and no interference，the advantages of good reproducibility，can be used widely in clinical test.
[Keywords] high performance liquid chromatography；HPLC；Capsule of renal capsule；Rhubarb. Emodin；Rhubarb phenol juice
近年来临床慢性肾功能患者的比例不断增加，患者多采取药物保守治疗，其中临床使用范围较为广泛的药物之一-肾康胶囊，因其具有显著的补肾益气、活血化瘀以及消肿利水的功效而颇受临床医师和患者的青睐[1]。为进一步了解该药物成分中的大黄含量，我们利用高效液相色谱（HPLC）法进行相关测定[2]。现报告如下。
1 仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪（美国Agilent100），二极管阵列检测器，四无梯度泵，电子天平（Sartorius BP211）。试剂与标准品：大黄素和大黄酚对照品均购自于中国药品生物制品检定所（批号分别为110756-201013、110796-201017）；自制肾康（通肾络）胶囊中大黄素和大黄酚总量大于0.55%；甲醇为国产分析纯；超纯水。
2 方法与结果
2.1 制备对照品溶液及样品溶液
分别取对照品大黄素10μg、大黄酚25μg，将其溶入1ml甲醇中制成大黄素和大黄酚混合对照溶液；另单取大黄酚25μg，将其溶入1ml甲醇中制成大黄酚对照溶液。采用电子天平（感量0.01mg）精密量取5.0062mg通肾络胶囊内容物（相当于0.4g大黄）置入装有40ml甲醇的量瓶中，经功率为500W，频率为40kHz超声提取0.5h，自然冷却，加入甲醇至量瓶50ml刻度，轻摇均匀并进行滤过处理，将续滤液作为供试品溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱：Phenomsil BDS-C18柱（250 mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液-甲醇（体积比为45：15：40），柱温：30℃，进样量：10μl，流速：1.0 mL/min。
2.3 专属性
将2.1中制得的大黄素和大黄酚混合对照溶液、大黄酚对照溶液、供试品溶液与阴性对照溶液分别注入液相色谱仪进行测定。测定结果显示：供试品和对照品色谱图中色谱峰分离度均较好且二者保留时间基本一致，同时基线表现平稳；而阴性对照品则在同等保留时间未有无色谱峰。
2.4 线性关系
精密秤取适当大黄素、大黄酚对照品并分别加入甲醇制成3μg/ml、6μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、30μg/ml的大黄素混合液及10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml的大黄酚溶液，分别轻摇均匀并各提取10μl样品进行线性回归分析，其中纵坐标均为峰面积，横坐标分别为为大黄素浓度、大黄酚浓度。分别分析后得到回归方程：Y1（大黄素峰面积）=0.001421X+1.086（X为大黄素浓度），相关系数r=0.9990；
Y2（大黄酚峰面积）=0.00491X+1.096（X为大黄酚浓度），相关系数r=0.9992。大黄素和大黄酚分别在3μg/ml~30μg/ml、10μg/ml~50μg/ml范围内峰面积与各自浓度保持着较好的线性关系。
2.5 稳定性及回收率试验
分别取8μl对照品混合液及5μl供试品溶液，每间隔2h进行一次含量测量，一共测量5次，结果显示大黄素峰面积RSD值为1.12%，大黄酚RSD为0.39%，二者8h内稳定性均较好。另取已知含量的样品两份，分别加入适量的对照品混合液，结果显示大黄素、大黄素的平均回收率分别为98.91%、98.58%，RSD分别为1.84%、1.52%。
2.6 精密度试验
精密秤取10μl对照品混合溶液样品，按照以上试验方法分别重复进行6次以上试验，测得各次峰面积。通过分析，大黄素对照品相对标准偏差（RSD）为0.9%，大黄酚对照品RSD为0.6%，二者RSD均小于2.0%，符合精密度规定。
2.7 样品测定
分别按供试品溶液制备供试液，精密吸取供试液10L，对照液10L，依法进行大黄含量的测定，结果见表1。
3 讨论
3.1 波长的选择
参照《中国药典》2010版中相关试验测定[3]证实，大黄素和大黄酚在54nm处紫外线吸收良好，且峰型保持较好，相应值也较明显，因此本文于该方法下进行测定并选用254nm作为测定波长。
3.2 流动相的选择
本文采用不同比例的乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液及甲醇-水（80：20）、乙腈-0.2%磷酸（83：17）、乙腈-冰醋酸-水（60：1：40）、乙腈-0.1%磷酸-甲醇（42：35：23）分别进行预实验，结果显示用乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（45：15：40）时，分离度符合要求且峰型较好，基线也稳定[4]。故本文最终将乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（45：15：40）作为流动相。
3.3 提取条件的选择
预实验中将回流提取法和超声提取法进行了对比，结果显示超声提取和回流提取分别在0.5h和1h效率差异无明显差异，而超声提取效率高且操作相对简单，故本研究将超声作为提取法[5]；且通过不同超声提取时间分析发现超声提取在0.5h以后提取量不变，因此本研究最终确定超声提取时间为0.5h。另一方面在对甲醇、乙醇、氯仿等提取溶剂分别比较发现，三者中仅甲醇提取杂质峰相对较少且分峰面积较大，故最终选用甲醇作为提取溶剂。
4 结语
高效液相色谱法可作为测定肾康（通肾络）超微粉胶囊中大黄（大黄素、大黄酚汁）含量的方法，其具有灵敏度、准确度高、操作简单及无干扰、重现性好等优点，可在临床检验中推广使用。
参考文献
[1]张文玉，李金萍，常文秀. 肾复康胶囊联合百令胶囊治疗慢性肾小球肾炎的疗效观察[J]. 现代药物与临床，2016，31（6）：823-825.
[2]陈秀杰，段秀君，焦太雨. HPLC测定肾益康胶囊中大黄酚和大黄素的含量[J]. 北方药学，2015，12（10）：2-4.
[3]国家药典编委会.中华人民共和国药典[S] .2010年版一部.22-23，457-459.
[4]刘桂英，张治国，宋长义. 高效液相色谱法测定肾炎康片中大黄素的含量[J]. 辽宁中医杂志，2005，32（6）：591-591.
[5]李静，赵排风. HPLC法测定肾康丸中大黄酚、大黄素的含量[J]. 中国药师，2012，15（9）：1354-1356..
论文作者:伍蓉
论文发表刊物:《航空军医》2017年第13期
论文发表时间:2017/8/28
标签：大黄论文; 溶液论文; 甲醇论文; 色谱论文; 胶囊论文; 黄素论文; 含量论文; 《航空军医》2017年第13期论文;