王冰山[1]2000年在《Germin基因的克隆和人溶菌酶基因的合成及其在烟草和油菜中的表达》文中指出草酸作为真菌分泌的毒素并参与致病，目前已在核盘菌属等9个属中有报道。草酸是核盘菌致病过程的决定因子，核盘菌在油菜、大豆、向日葵与十字花科蔬菜等植物上引起严重的菌核病。油菜菌核病位于油菜叁大病害之首，由于核盘菌属广谱性非专化病原菌，油菜中至今未找到对病原菌免疫的抗源。 鉴于草酸在致病中的重要作用，我们试图利用具有草酸氧化酶活性的germin，从分解草酸入手进行抗菌核病的研究。本研究通过PCR扩增克隆了小麦germin基因，构建了35S启动子驱动的germin基因植物表达载体，经遗传转化获得了转基因烟草植株。经Southern杂交证明germin基因已整合到烟草的基因组中。酶活性检测表明，源于单子叶植物小麦的germin基因能够在双子叶植物烟草中表达并正常装配成具有酶活性的同源五聚体蛋白。 对病原菌细胞壁降解酶的利用一直是抗病基因工程育种的一条重要途径。人溶菌酶（human lysozyme，HL）是一种双功能酶，同时具有溶菌酶和几丁质酶活性，并且杀菌活性较强。因此HL基因可能介导转基因植物对细菌和真菌同时产生抗性。为了提高HL在植物中的表达量，我们根据植物偏爱密码子，修饰、合成了适于在植物中表达的HL基因。设计的HL基因序列中总G+C含量从原有的20.3％提高到了51.3％，密码子第叁位碱基的G+C含量由原来的41.5％提高到了59.2％。序列设计中还避免出现mRNA多聚腺苷化的识别位点AATTAAA和mRNA代谢的识别信号ATTTA等，以免导致mRNA不稳定。为验证合成的HL基因能否表达，我们构建了HL的酵母表达载体，Western杂交表明HL基因能够在酵母中表达。进而我们构建了35S启动子驱动的HL基因植物表达载体并转入烟草，为提高表达蛋白的积累量并使其更有效发挥作用，我们将HL基因与大麦α-淀粉酶基因的信号肽连接，指导HL表达产物分泌至细胞外。Southern杂交证明HL基因已整合到烟草基因组。Western杂交证明了HL蛋白在转基因烟草中的表达。 为了提高植物对核盘菌的抗性，我们构建了 germin基因和 HL基因的 双价植物表达载体，并转化了烟草和油菜。western杂交和草酸氧化酶活 性检测分别证明了双价基因中的 HL和 g6rmin在烟草中的表达。点杂交证 明了双价基因在油菜基因组的整合。
张海[2]2009年在《pCAOxO-PMI表达载体的构建及导入甘蓝型油菜的研究》文中认为甘蓝型油菜是世界重要的经济作物之一,但是由于长期受到菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)等多种病害的危害,其产量和品质受到严重影响。在中国,菌核病居油菜叁大病害之首,严重影响了我国的油菜生产。目前,其近缘种中还没有发现完全抗或免疫的种质资源。油菜对菌核病的抗性表现为数量性状,易受环境的影响,加之缺乏准确可靠的病害鉴定方法,使得常规育种难以选择到真正抗病植株。因此,利用植物基因工程,转入外源抗真菌基因使油菜获得对菌核病的抗性无疑成为油菜抗病育种的一条可行的新途径。根据致病的关键因子去寻求控制策略是最根本的途径。已知草酸是核盘菌侵染油菜的关键因子,因此引入编码草酸降解酶的基因来获得对分泌草酸病原真菌的抗性是一个极具前途的方法。但是,转基因植株中的除草剂或抗生素抗性标记基因的环境和食品安全性一直颇具争议,这限制了转基因工作的发展和转基因植物的更大面积推广。基于此,本研究将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的6-磷酸甘露糖异构酶基因(Phosphomannose isomerase,PMI)已被证明对人体健康和环境安全无害,作为选择标记基因和来源于大麦的草酸氧化酶基因(Oxalate oxidase,OxO)构建于同一载体上,并以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)为试材,进行了农杆菌遗传转化,主要工作及结果如下:1.OxO及PMI基因的克隆:分别利用RT-PCR技术和PCR技术克隆大麦OxO基因和大肠杆菌PMI基因。测序后,经比对发现两个克隆基因片段与已发表序列的同源性均为100%,且具有完整的编码框。2.植物表达载体的构建及农杆菌的转化:以pCAMBIAl301为原始载体构建了含抗病基因OxO和标记基因PMI的植物表达载体pCAOxO-PMI,利用冻融法将载体转入了根癌农杆菌EH105中。3.甘露糖筛选浓度的确定:通过油菜对甘露糖敏感性的测试,确定了油菜甘露糖筛选培养基甘露糖渐次提高的浓度为0.5%,1%,1.5%。4.甘露糖抗性苗的获得:以甘蓝型油菜常规品种川油21为材料,油菜下胚轴作为转化受体,用于农杆菌的侵染。用对数分裂中期OD_(600)为0.3～0.4左右的农杆菌菌液稀释3～5倍侵染3～5min,通过与农杆菌共培养,经甘露糖筛选,得到油菜甘露糖抗性苗14株。利用特异引物对抗性苗进行PCR检测,14株油菜甘露糖抗性苗中11株表现阳性。初步证明来自大麦的草酸氧化酶基因已整合到了油菜的基因组中。
韩长磊[3]2007年在《转基因油菜衰老特异性表达病程相关基因CH5B和HvOxOh的研究》文中提出油菜是世界上重要的油料作物之一,是食用油的重要来源。菌核病是油菜中很流行的腐生性病害,它由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)感染所致,它主要在油菜生长的成熟期发作,严重影响油菜的产量和品质。已有的研究表明,目前暂没有发现抗菌核病的油菜品种,品种之间只有耐性的不同,油菜本身没有抗性的资源,这一局限成为了油菜抗菌核病育种的瓶颈。然而,转基因技术为油菜抗病育种带来了新的契机。针对油菜菌核病的发病特点,本研究采用了在油菜中衰老特异表达病程相关基因—几丁质酶编码基因CH5B和大麦草酸氧化酶HvOxOh,来提高油菜的抗病性。表达载体SAG12:CH5B、SAG12:HvOxOh和35S:CH5B被用来转化甘蓝型油菜品种Westar10,本实验研究了转化过程中影响转化的限制性因素,包括外植体苗龄大小、共培养时间、激素浓度和抗生素浓度。研究表明:4d苗龄的外植体最适合转化;共培养2d时间较为合适;4mg/L的6-BAP影响外植体的分化;500mg/L的羧苄青霉素限制外植体的生长。分别得到了13株转化SAG12:CH5B、5株转化SAG12:HvOxOh和14株转化35S:CH5B的转基因植株。对部分转基因植株进行了Southern杂交分析,结果证明外源基因已经插入到了转基因植株基因组中。RT-PCR和Northern杂交分析了外源基因在RNA水平上的表达,证实了外源基因在转化SAG12:CH5B和SAG12:HvOxOh的转基因植株中衰老时期特异表达。对几丁质酶活性和草酸氧化酶活性的分析结果表明外源基因的表达产物具有活性,同时具有在衰老时期特异表达的特性。对3种不同类型的转基因植株离体叶片进行了菌核病接种,接种受体分别为转化SAG12:CH5B和SAG12:HvOxOh的转基因植株的下部衰老叶片,转化35S:CH5B的转基因植株的幼嫩叶片,结果表明转基因植株在目前的接种胁迫条件下没有明显表现出对核盘菌抗性的增强。
胡杰[4]2014年在《草酸氧化酶基因（OxO）遗传转化拟南芥及其抗病机理的初步分析》文中认为草酸氧化酶（oxalate oxidase，OxO，E.C.1.2.3.4）不仅参与植株生长发育过程，而且也在少数禾谷类植物的某些抗菌核病害过程中有重要作用。草酸氧化酶可以把草酸毒素分解为H2O2和CO2，从而减少它们对植物的伤害。其分解产物H2O2可能是植物应答胁迫信号通路的重要信号分子，参与调解Ca2+内流，改变细胞膜的通透性，并作用于植物细胞壁的结构蛋白，从而参与植物的防御过程。所以草酸氧化酶被广泛地应用于植物基因工程改良，来减少其他作物的菌核病病害。菌核病害是由死体营养型腐生菌核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）引起的一种能够危害400多种植物的病害，其中最严重的是十字花科作物,每年都给全世界带来巨大的经济损失。但是，草酸氧化酶的作用并不仅限于抗菌核病。转草酸氧化酶基因植物不仅能够抗菌核病，还能够被其他环境胁迫诱导表达，例如盐胁迫、重金属胁迫等氧化胁迫。目前为止，普遍认为转OxO作物的抗菌核病机理：第一、草酸氧化酶能够分解毒素草酸；第二、草酸氧化酶产生的H2O2有重要作用；第叁、草酸氧化酶还能够被植物激素诱导表达。但是，鉴于植物在受到病原菌感染以及其他非生物胁迫时，植物的活性氧（Reactive oxygen species. ROS）与植物的抗逆过程的密切关系。草酸氧化酶是否能够通过其他方式，参与了转OxO植物的防御反应？因此，考虑到在植物防御反应中植物自身存在的两大防御系统，包括抗氧化酶系统和非酶促类抗逆物质。本研究以模式植物拟南芥为实验对象，构建了转OxO基因拟南芥，探讨了转OxO拟南芥对菌核病的抗性以及在菌核病感染过程中外源草酸氧化酶的表达对植物自身的防御反应的影响。本实验以农杆菌介导的花器官原位转化法，以及一系列的筛选验证包括PPT选择筛选、GUS组织化学染色、PCR和RT-PCR验证，转化获得了转OxO拟南芥。然后，以草酸毒素法和菌核病菌丝体接种法鉴定了其对菌核病的抗性。然后分别通过酸性茚叁酮法、蒽酮-硫酸比色法、二氨基联苯胺（DAB）染色法测定了转OxO拟南芥的脯氨酸、可溶性糖和H2O2的含量的变化。并分别通过氯化硝基四氮胺蓝比色法（Nitroblue tetrazolium,NBT）比色法、愈创木酚法和紫外吸收法分别检测了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的酶活性变化。主要实验结果如下：1、优化农杆菌介导的拟南芥花器官原位转化技术。农杆菌生长期（农杆菌菌悬液的OD600值）决定了农杆菌的活力。用于转化处理的渗透培养基中农杆菌的密度决定了农杆菌进入植物花器官开放结构的几率。所以，本实验对这两个因素的研究结果证明农杆菌生长至OD600为1.6，渗透培养基农杆菌OD600为1.0时，转化率最高。2、获得了转OxO拟南芥。本研究采用农杆菌介导的Flor-dip法与Flora-drop法相结合，经PPT选择培养基筛选法、GUS组织化学染色法、PCR验证以及RT-PCR验证，成功获得了转OxO拟南芥植株。3、转OxO拟南芥的抗病分析。本实验利用草酸毒素法与菌丝接种法对转OxO拟南芥进行了抗病分析。结果证明转OxO拟南芥比野生型拟南芥具有更强的抗病性。4.转OxO拟南芥的抗病机理的初步分析。本实验通过对抗氧化酶SOD、POD和CAT的酶活检测，以及脯氨酸和可溶糖在菌核病感染处理12h后的变化，对转OxO拟南芥进行了抗氧化分析和渗透调节分析。相对于未经菌丝体接种处理的野生型拟南芥，菌核病感染12h后的野生型拟南芥和转OxO拟南芥的可溶糖含量、脯氨酸含量均上升。可溶糖含量分别上升至204.4%和324.4%，脯氨酸含量分别上升至113.6%和137.7%。因此，它们在转OxO拟南芥的含量变化更大。抗氧化酶也发生了明显的变化，其中SOD酶活的相对百分比分别为106.3%和173%，POD酶活的相对含量比分别为90.5%和209.9%，CAT的表达变化相反，分别下降为69.5%和61%。
刘飞[5]2015年在《大麦草酸氧化酶与WRKY转录因子参与调控核盘菌抗性的分子机理》文中指出菌核病是我国油的主要油菜病害之一,对我国油菜生产造成了严重的影响;对于油菜对菌核病的反应机制的研究有助于我们了解油菜-菌核病互作,对于我们油菜抗病育种具有重要意义。研究工作主要分两个方面进行的:1.核盘菌在侵染植物时会分泌草酸以帮助其入侵植物组织,而草酸氧化酶可以分解草酸为二氧化碳和过氧化氢,我们通过农杆菌转化的方法将大麦草酸氧化酶(Y14203)转入甘蓝型油菜,提高了对菌核病的抗性。在接种核盘菌72h后,与对照相比,转基因植株的病斑面积减少15-61%,表现出对核盘菌显着的叶片抗性。而且,转基因植株接种核盘菌后的草酸盐水平下降,同时伴随过氧化氢水平的上升。另外,涉及到过氧化氢信号路径的基因表达水平在转基因植株中表现出上升的趋势。因此,我们将转化大麦草酸氧化酶基因提升抗性的原因归结为增强植株对草酸盐的代谢升高的过氧化氢水平以及过氧化氢信号路径上的基因表达水平的上升。2.基于本实验室之前抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)的结果,检测并分离到一个受到核盘菌诱导上调表达的基因Bn WRKY33;基于内含子多态性标记,将其定位于A5连锁群上;在Westar材料中过表达Bn WRKY33可以提高核盘菌抗性,而且在转基因植株中合成camalexin的基因表现出上调表达;对其启动子分析发现其受到水杨酸及核盘菌的诱导,对启动子进行截短实验获得含有3个W-box的受到核盘菌诱导的区段,利用这个区段进行酵母单杂交筛选Bn WRKY33上游调控其转录水平的转录因子,结果筛选到一个与At WRKY15同源的WRKY转录因子Bn WRKY15;利用EMSA和拟南芥原生质体瞬时表达验证了这种互作的真实性,同时也检测到Bn WRKY33与这段区域的结合;转录激活检测发现Bn WRKY15是一个弱的转录激活子,而Bn WRKY33是一个典型的转录激活子,转录激活/抑制结构域作图发现Bn WRKY33存在两个转录激活结构域,而Bn WRKY15存在一个转录抑制结构域;Bn WRKY15在拟南芥原生质体中会降低Bn WRKY33对自身的转录激活,同时在Bn WRKY15过表达植株中Bn WRKY33及其调控合成camalexin相关的基因都表现出表达量下降的情况,并且过表达植株的菌核病抗性初步鉴定也表现出抗性下降;利用转录激活和EMSA竞争性试验研究发现Bn WRKY15对Bn WRKY33对自身激活能力的影响机制可以归结为两个方面:1.Bn WRKY15抑制Bn WRKY33的转录激活能力;2.Bn WRKY15与Bn WRKY33一起竞争WRKY33启动子上的W-box,而且Bn WRKY15具有更强的W-box结合能力。另外,也检测到受核盘菌诱导表达的Bn WRKY28和Bn WRKY40也可以结合到Bn WRKY33的启动子上,说明Bn WRKY33在植物环境的刺激反应中可能处于调控的中心。
陈晓婷[6]2008年在《拟南芥与草酸互作的分子机制研究》文中研究说明许多在生态、生理学上不同的真菌都可以产生草酸(Oxalic acid, OA)。这些草酸产生菌如核盘菌、灰葡萄孢等寄主范围广泛,可以引致上百种植物病害,造成世界范围的粮油、蔬菜等农作物的严重减产。草酸在病菌致病过程中可能起着关键性的作用。因此研究植物对草酸产生菌的防卫机制,挖掘抗病资源,提高农作物抗性,是急需解决的重要科学问题,也是生产上首先要解决的实践问题。拟南芥具有基因组小、结构简单、形体小、生长周期短、繁殖系数高、自花授粉、基因组序列已知、与高等植物的基因组间有较高同源性等特点,是研究植物防御机制的良好模式植物。因此本论文着眼于拟南芥与草酸的互作机制的研究。分为叁部分:1.通过筛选草酸抗性突变体,并对突变体进行分子分析。最终目的是分离草酸抗性基因来获得作物的菌核病抗性,从而减少农药的使用,提高环境的质量和食品安全;2.草酸可以通过氧化与脱羧两条途径降解,本研究从枯草芽孢杆菌中克隆草酸脱羧酶,从大麦中克隆草酸氧化酶,构建其植物表达载体,转化拟南芥,对转基因植株进行菌核病抗性分析;3.对草酸胁迫下拟南芥全基因表达谱和microRNA的差异表达谱进行分析,进一步明了草酸致病的分子机制,为草酸产生菌的生物防治提供理论基础。获得的主要结果如下:1.通过拟南芥Col-0的浓度梯度的实验,确定了筛选草酸抗性突变体的筛选压为1.2mmol/L OA;建立并优化了草酸抗性突变体的筛选体系;2.通过对中国科学院遗传与发育生物学研究所左健儒实验室构建的化学诱导型功能获得和缺失性突变体库(公开释放的6,000余个突变体)进行两代的筛选,得到5株草酸抗性增强突变体,并通过TAIL-PCR扩增获得T-DNA插入的侧翼序列;BLAST结果显示这5株突变体中有4株突变体(D630、D282、D154、D74)均插在At5g10450的第一个内含子上,并且验证了At5g10450基因的SALK T-DNA插入缺失突变体的SALK_068774(插入位点为外显子)的纯合体并没有草酸抗性。D33突变体插入位点为At2g39720和At2g39730两个基因间区;3.半定量RT-PCR表明D33突变体的At2g39690、At2g39700、At2g39720及At2g39750表达上调;4.构建了At2g39690,At2g39700和At2g39720的过表达载体,进行了拟南芥浸花转化,将对转基因植株进行菌核病抗性和草酸抗性分析;5.对突变体分别进行了核盘菌的离体叶片接种和活体接种,发现无论是离体接种还是活体接种,突变体都比野生型植株更抗菌核病。说明通过筛选草酸抗性突变体来筛选抗菌核的材料是可行的。有可能通过分离草酸抗性基因来获得作物的菌核病抗性,从而减少农药的使用,提高环境的质量和食品安全;6.从枯草芽孢杆菌Bs168中克隆了草酸脱羧酶基因(Yvrk),从大麦中克隆了草酸氧化酶基因(Y14203)并构建了植物表达载体,对拟南芥进行转化,获得了转基因植株。转草酸脱羧酶的拟南芥植株表现出对核盘菌的抗性,这为草酸产生菌的生物防治提供了一条新途径;7.首次利用拟南芥全基因组Oligo芯片研究草酸胁迫下差异基因表达谱。通过对两张生物学重复的表达谱芯片数据的生物信息学分析表明:草酸胁迫诱导了拟南芥的JA/ET途径,而不是SA途径。此外,苯丙烷代谢途径、WRKY转录因子家族、细胞色素P450家族、ABC转运蛋白、热激蛋白基因家族上调表达,表明这些途径或基因家族参与了拟南芥对草酸的抗性反应。8.首次利用拟南芥microRNA芯片研究草酸胁迫下microRNA差异基因表达谱。获得叁个差异表达microRNA和9个差异表达的Predicted_miRNA。其中下调表达的小立碗藓Ppt-miR1211,根据miRU找到一个最匹配的靶mRNA是一个萜烯合成酶(At3g14520);另一下调表达的毛果杨Ptc-miR3991 (与Ath-miR399b同源),对应的靶mRNA是一个泛素连接酶(At2g33770);这两个靶基因在表达谱芯片中的Ratio值都上调。上调表达的Ath-miR858有叁个靶mRNA,分别为At2g47460(转录因子)、At3g08500(转录因子)、At3g20310(ethylene responsive element- binding family protein),它们在表达谱芯片中对应的Ratio值都分别下调。说明microRNA对其靶mRNA确有负调控功能。
沙日娜[7]2007年在《农杆菌介导草酸氧化酶（OXO）基因转化向日葵的研究》文中研究指明向日葵籽实含油量高,具有较高的经济价值,是我区重要的经济作物。但向日葵菌核病危害对向日葵生产威胁日益严重,至今未找到菌核病抗源。根据菌核病致病的关键因子—草酸,引入编码草酸降解酶的基因来获得对分泌草酸病原真菌的抗性是一个极具前途的方法。本实验通过研究建立向日葵高效的遗传转化系统,将来自于小麦的草酸氧化酶(Oxalate Oxidase, OXO)基因通过农杆菌介导转化星火花葵,取得以下结果:向日葵茎尖转化再生系统中适宜培养基为:I.分化培养基:MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.25 mg/L IAA + 0.1mg/LGA,pH 5.8II.共培养培养基:分化培养基+100μmol/LAS,pH 5.8III.筛选培养基:分化培养基+ 50mg/L Kan + 500mg/L Cef,pH 5.8Ⅳ.生根培养基:1/2 MS + 25mg/L Kan + 300mg/L Cef + 0.5mg/L NAA,pH 5.8用OD600为0.3～0.4左右时的农杆菌侵染茎尖9 min～10min,进行农杆菌介导OXO的遗传转化。通过与农杆菌共培养3d后,经卡那霉素筛选,得到向日葵卡那霉素抗性苗14株,最后经PCR检测阳性为2株,转化率为0.4%。
王冰山, 窦道龙, 张猛, 王志兴, 贾士荣[8]2003年在《germin基因的克隆及其在烟草中的表达》文中进行了进一步梳理克隆了具有草酸氧化酶活性的小麦(Triticumaestivum )Germin蛋白的基因,构建了植物表达载体并用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens )介导法转化烟草。Southern杂交和酶活性检测表明,germin基因在转基因烟草(Nicotianatabacum )中得到整合、表达,并正确组合成具有草酸氧化酶活性的同源六聚体蛋白。离体实验表明,外源germin基因的表达提高了转基因烟草离体叶片对草酸的耐受性。
陈芳芳[9]2007年在《拟南芥抗草酸突变体的筛选和分析》文中进行了进一步梳理拟南芥具有基因组小、结构简单、形体小、生长周期短、繁殖系数高、自花授粉等优点，且其基因组全序列测定工作已于2000年12月完成。为此，我们以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料，建立并优化拟南芥草酸突变体筛选体系，取得了如下主要结果：1、用草酸平板筛选法筛选拟南芥草酸抗性增强突变体，并确定了筛选压为1.2mmol／L。2、经过两轮在含有1.2mmol／L草酸的培养基上筛选得到草酸抗性增强突变体5株，通过TAIL-PCR扩增得到T-DNA插入侧翼序列，其中4株突变体D630、D282、D154、D74的T-DNA为同一插入位点，均插在At5g10450基因内部。另外1株突变体D33插在At2g39720、At2g39730两个基因的间区。3、我们从拟南芥种质资源库(ARBC)鉴定了At5g10450基因的SALK T-DNA插入缺失突变体，salk068774。发现该基因的缺失突变体并没有草酸抗性。4、构建了At5g10440、At5g10460基因的过表达载体，进行了拟南芥浸花转化并在含有basta的土壤中筛选得到一批转化苗。5、构建了草酸氧化酶的表达载体，用农杆菌介导转入拟南芥野生植株中并在含有basra的土壤中筛选得到一批转化苗。6、用菌核病菌接种突变体和野生型植株，发现突变体在一定程度上对菌核病菌的抗性有所增强。研究结果表明，植物对草酸的抗性与菌核病等病原菌的抗性具有较好的相关性。
郝志达[10]2016年在《转OxO拟南芥抗菌核病的机理研究》文中研究指明菌核病是由核盘菌属引起的恶性疾病,对作物生长发育有较大的影响,尤其其发病期一般又在盛花期,会大幅度消减农作物的产量,使农业经济遭受巨大损失。核盘菌分泌草酸作为其主要的致毒因子,在核盘菌与植物互作过程中,草酸扮演着多方面的角色。草酸氧化酶能够提高植物对菌核病和外援草酸的抗性已经获得了很多方面的研究证据的支持。其能够氧化草酸,生成过氧化氢和二氧化碳,降低草酸毒性。虽然目前通过基因工程技术,将草酸氧化酶转入其他作物提高抗菌核病的报道很多,但对于核盘菌与宿主的互作机制依然没有突破。在研究草酸导致宿主细胞程序性死亡的关联的过程中,发现草酸能够诱导植物细胞ROS水平的升高,当ROS水平被抑制时,细胞凋亡现象也随之消失。相反的,草酸缺陷性非致病菌不能够改变宿主细胞氧化还原水平。植物体自身存在有抗氧化酶系统如SOD,CAT,POD等,能够及时清除体内的氧自由基,保护细胞免受氧化损伤。而当前的报道主要集中核盘菌与宿主植物互作过程中的信号通路,对核盘菌与宿主互作过程中对氧化酶系的影响报道较少,因此本实验选择对核盘菌与拟南芥互作过程中对抗氧化酶的影响进行研究。本实验通过农杆菌浸花法将草酸氧化酶转入模式植物拟南芥中,并筛选得到能够稳定遗传的,拥有草酸盐化酶活性的和有良好抗病性的转基因T4代拟南芥。通过使用核盘菌,草酸,草酸钠,盐酸等不同的处理条件,对比野生型拟南芥和转基因拟南芥抗氧化酶系统SOD、POD、CAT的表达和酶活性所造成的影响。并且通过使用去除草酸的菌液感染拟南芥,研究了核盘菌致病对草酸的依赖程度。本实验通过Gus组织染色和DNA验证,获得了纯合转基因拟南芥植株,并鉴定具有良好的抗菌核病性。并获得如下叁个结论：1)本实验通过对不同的处理条件下的野生和转基因拟南芥叶片SOD、CAT、POD的基因表达量的荧光定量分析和对其酶活力的检测分析,表明核盘菌感染拟南芥的时候或使用外源草酸处理拟南芥叶片时,会抑制SOD,CAT酶的表达量和活性,但对POD有促进作用。2)本实验表明草酸氧化酶能够减轻核盘菌或外加草酸对SOD、CAT酶的抑制作用,但并不能够影响HCl对它们的影响,这表明草酸氧化酶是通过降解草酸或草酸盐来发挥作用的。3)本实验通过是使用HCl代替菌液中的草酸,成功使拟南芥致病产生与对照组相同的病斑,表明核盘菌致病能力是与其酸性的密切相关,可以使用HCl来代替草酸是核盘菌的致病能力得以恢复。
参考文献：
[1]. Germin基因的克隆和人溶菌酶基因的合成及其在烟草和油菜中的表达[D]. 王冰山. 中国农业科学院. 2000
[2]. pCAOxO-PMI表达载体的构建及导入甘蓝型油菜的研究[D]. 张海. 四川农业大学. 2009
[3]. 转基因油菜衰老特异性表达病程相关基因CH5B和HvOxOh的研究[D]. 韩长磊. 华中农业大学. 2007
[4]. 草酸氧化酶基因（OxO）遗传转化拟南芥及其抗病机理的初步分析[D]. 胡杰. 郑州大学. 2014
[5]. 大麦草酸氧化酶与WRKY转录因子参与调控核盘菌抗性的分子机理[D]. 刘飞. 华中农业大学. 2015
[6]. 拟南芥与草酸互作的分子机制研究[D]. 陈晓婷. 福建农林大学. 2008
[7]. 农杆菌介导草酸氧化酶（OXO）基因转化向日葵的研究[D]. 沙日娜. 内蒙古农业大学. 2007
[8]. germin基因的克隆及其在烟草中的表达[J]. 王冰山, 窦道龙, 张猛, 王志兴, 贾士荣. 农业生物技术学报. 2003
[9]. 拟南芥抗草酸突变体的筛选和分析[D]. 陈芳芳. 福建农林大学. 2007
[10]. 转OxO拟南芥抗菌核病的机理研究[D]. 郝志达. 郑州大学. 2016
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