孙运军[1]2003年在《苏云金杆菌伴孢晶体中20kb DNA上cry基因的鉴定和克隆》文中提出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)4.0718菌株能够产生双金字塔形和立方体形晶体，它们分别由Cry1和Cry2原毒素组成。本研究在PCR-RFLP方法的基础上，对与Cry1原毒素相结合的20kb DNA上含有的晶体蛋白基因进行了鉴定。在此基础上，采用PCR方法扩增了该DNA片段上cry1Aa和cry1Ac基因的全长编码序列，并且对cry1Aa基因编码序列的PCR产物进行了克隆。 1．Bt 4.0718菌株伴孢晶体的选择性溶解与20kb DNA的提取对Bt 4.0718菌株产生的伴孢晶体在不同的条件下选择性溶解，然后对不同的原毒素组分进行SDS-PAGE和琼脂糖凝胶电泳，发现Cry1和Cry2原毒素均与20kb DNA相结合。与立方体形晶体相比，双金字塔形晶体溶解时所需的条件更温和。因此在溶解时，与Cry1原毒素相结合的20kb DNA没有发生降解。采用pH10.5的苯酚：氯仿在65℃下对与Cry1原毒素相结合的20kb DNA进行抽提，并用透析袋电洗脱法将这一大片段DNA进行有效的回收。 2．20kb DNA上cry基因的鉴定 采用cry1和cry2基因的通用引物对20kb DNA上的核酸序列进行初步分析，结果表明该片段上含有这两类基因，而且cry1基因的拷贝数要低于cry2基因的拷贝数。为了对cry基因的类型作进一步的鉴定，本研究对该DNA片段进行了PCR-RFLP分析。研究发现，该片段能够扩增出1.6kb和1.2kb的预期产物，而且1.6kb PCR产物的扩增量要低于1.2kb PCR产物的扩增量，这与通用引物的扩增结果一致。PCR产物的大小及其酶切结果表明20kb DNA上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因。对cry1Aa和cry1Ac基因1.6kb PCR产物进行测序的结果与PCR-RFLP分析的结果相符。 3．20kb DNA上cry1Aa基因的克隆 在获得c理IAa和c粼IAc基因3‘端1.6kb和5‘端1.4kb PCR产物的基础上，设计了一对引物用于扩增得c粼IAa和c汀1A。基因的全长编码序列。将所得的3.skb PCR产物与pUCm一T载体连接，然后转化到大肠杆菌DH5a菌株，对随机挑取的转化子的重组质粒进行酶切分析及PCR一RFLP鉴定，确定其中含有c粼IA。基因。
丁学知[2]2006年在《苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究》文中研究指明研究和发展现代植物保护生物技术，确保食品安全，保护生态环境和维护人类健康具有重要意义。近年来，利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)取代有残留杀虫化学农药控制植物害虫，实施生态农业计划，已成为国际上发展的新趋势。但在对提高Bt杀虫毒力、挖掘新的cry杀虫功能基因和研究其蛋白质组学上有待深入进行。本文利用微生物技术，分子生物学技术和蛋白质组学方法，选育出Bt4.0718新菌株，系统研究了cry基因，发现了新的杀虫基因，利用烟草几丁质酶基因tchi B与Bt4.0718菌株的cry1Ac基因重组，获得高效杀虫工程菌。首次对Bt的杀虫功能蛋白质组进行了研究。Bt作为微生物杀虫剂在生产上成功推广和应用，很大程度上取决于高毒力菌株的选育。本研究从湖南不同生态区域采集的858份土样中，分离出30份Bt菌株。从中筛选一株具有典型Bt菌落特征和较高杀虫毒力的701~(2c)为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍(NTG+LiCl)的交替复合诱变，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量和芽孢同伴孢晶体的比例与杀虫毒力密切相关。以此特征为依据进行快速初筛和毒力生测复筛，获得一株高毒力突变杀虫新菌株4.0718。该突变株杀虫毒力与出发菌株相比提高了7.5倍，在6h、12h、和24h内供试小菜蛾叁龄幼虫死亡率分别高达20％、97％和100％。此菌株经连续10代培养稳定遗传。这为高毒力杀虫菌株的选育提供了一种简单和快速的方法。在对4.0718进行单因子培养条件试验的基础上，采用正交设计试验和结合杀虫毒力生测，对该菌株进行发酵试验，获得了最佳发酵条件。Bt菌株的杀虫活性与其携带的编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的cry基因密切相关。通过PCR扩增的产物电泳检测，4.0718含有cry1和cry类杀虫基因，显示出4.0718菌株cry基因类型丰富。将4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶基因tchiB(去掉信号肽和去信号肽再加肠激酶位点)重组，经双酶切和亚克隆，将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315中，分别构建重组质粒pHUAccB6和pHUAccB7，转入E.coli，电转入Bt无晶体突变株XBU001中，获得重组菌株HAccB6和HAccB7。通过液体双相孢晶分离提取后，将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析，双价重组基因与对照cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较，获得高效表达的双价融合蛋白。经定量分析：双价融合蛋白分别占总蛋白量的62.5％；Cry1Ac蛋白占蛋白总量的42.0％。经原子力显微镜和电子显微镜观察，表达后的融合蛋白呈菱形和椭圆形晶体，其规格约为1.5×3.0μm。经生测分析，两株工程菌HAccB6和HAccB7的重组基因表达的融合晶体蛋白二者在毒力上比较接近，而与对照工程菌HAc5和野生菌4.0718相比较，速杀时间提前36h。工程菌HAccB6对棉铃虫(Heli coverpa armigera)具有高效杀虫活性，其72h LC_(50)值为9.10μg／mL，为对照菌杀虫毒力的4.529倍。结果显示出tchiB基因与cry1Ac基因重组后的表达产物具有显着的杀虫增效作用。首次对Bt杀虫晶体蛋白质进行了研究。用液体双相法和等电点沉淀法纯化晶体蛋白，结合用2-DE分离的蛋白质进行质谱鉴定，确定了伴孢晶体蛋白总蛋白质的提取方法，获得了更清晰、分辨率更高和聚焦效果更好的2-DE图谱，建立了Bt晶体蛋白的双向电泳方法。对分别属于Bt的3个不同亚种的库斯塔克亚种4.0718、武汉亚种140菌株和以色列亚种H14菌株及相关工程菌株HAccB6和HAccB7的晶体蛋白质进行了系统的研究。工程菌HAccB6和HAccB7菌株分别检测到356±9和400±11个，其中两者129个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为30％。等电点沉淀法双向电泳(2-DE)图谱中检测到90±9和193±11个蛋白质斑点数，其中两者的80个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为40％，说明两者在毒力以及杀虫谱上的相似性和差异性。对2-DE胶上大部份蛋白质点进行了质谱分析，鉴定出各菌株的晶体蛋白成份中的7类功能蛋白质，即杀虫毒蛋白(Cry1Ac、Cry2Aa、CryIG，CryH2，Cry1Ab16，Cry2Ac_2)、晶体形成相关结构蛋白(伴侣蛋白dnak)、蛋白质折迭和组装的重要调节者热休克蛋白H_(SP)60，物质代谢酶类(分支链氨基酸转氨酶、烯醇酶、丙酮酸脱氢酶复合物E3)、蛋白质合成因子(ATP合成酶F1、ATP合成酶β-链、β-内酰胺酶、翻译延长因子Ts、Tu、G)、延长因子EF-Tu和EF-Ts、假想蛋白、转运蛋白(ABC transporter ATP-binding protein)、和蛋白引发因子(Trigger factor)等。从研究的Bt菌株中都鉴定有HSP-60，翻译延长因子Tu这两种蛋白，认为这两种蛋白很可能为晶体形成相关的重要蛋白，且杀虫晶体蛋白在结构与杀虫活性功能上的关系密切。这些表达谱和功能蛋白质组的研究将有助于对杀虫晶体蛋白杀虫机理的理解。特别是在Bt武汉亚种中新发现了Cry2Ac6蛋白。晶体蛋白种类的不同则有助于解释4.0718菌株高效杀虫的生化功能特征。结合利用CPHmodles、Ds ViewerProTrial和Swiss-Pdb Viewer软件，发现新型的Cry2Ac6与Cry2Aa的毒性核心片段空间结构有一定差异。说明与昆虫中肠受体蛋白结合的亲和力不同，引起其在杀虫毒力上的差异。总之，本项研究为苏云金芽孢杆菌高毒力杀虫菌株的选育、发酵条件、cry基因与外源毒素基因重组及亚种间功能蛋白质组学研究提供了一系列的方法和可借鉴的研究思路，鉴定了与杀虫毒力相关的cry基因及其功能蛋白质组，创新性研究了不同原毒素分子结构与杀虫活性之间的内在规律及其与昆虫细胞受体结合机制的信息。
付祖姣[3]2004年在《苏云金杆菌晶体中20-kb DNA与质粒及染色体的序列相关性研究》文中研究指明本研究通过对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)伴孢晶体中20-kb DNA上含有的crylAc基因进行克隆和表达，发现20-kb DNA上存在晶体蛋白基因的全长编码序列。为了进一步分析含有cry基因的20-kbDNA片段的来源，本研究利用PCR和Southern杂交技术对Bt4． 0718菌株的质粒与染色体上cry基因的分布情况进行检测，发现质粒和染色体上的部分DNA序列与伴孢晶体中20-kb DNA的核酸序列具有很大的相关性，它们均含有cry基因，而且所含cry基因的类型也一致，这为证明Bt中的20-kbDNA来源于质粒或染色体提供了直接的序列依据。1． Bt4． 0718菌株伴孢晶体中20kb DNA上crylAc基因的克隆和表达根据GenBank中crylAc基因的核酸序列设计引物，以Bt 4． 0718菌株伴孢晶体中的20-kb DNA为模板，扩增含有上游启动序列和下游终止序列的全长crylAc基因，将其与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组菌株DH5α／pTAc4。对重组质粒pTAc4进行BamHI／SalI双酶切，然后将含有crylAc基因的4． 2kb的酶切片段克隆到Bt-E．coli穿梭载体pHT304中，得到重组质粒pHAc4。再将pHAc4导入Bt无晶体突变株XZM-101，获得XZM-101／pHAc4。利用原子力显微镜对该重组菌株的发酵液进行观察，发现了典型的双金字塔型晶体。SDS-PAGE检测到XZM-101／pHAc4能产生130kD的蛋白质。生测结果表明，该重组菌株对小菜蛾(Plutella xylostella)有毒杀作用。2． Bt4.0718菌株中cry基因的定位提取Bt4． 0718菌株的质粒，同时采用脉冲电泳分离该菌株染色体的酶切片段，并将凝胶中的质粒DNA和染色体酶切片段分别转移至Hybond-N+尼龙膜上。利用地高辛对crylAc基因保守区段的1． 6kb PCR产物进行标记，以此为探针分别与质粒和染色体的酶切片段进行Southem杂交。杂交结果显示在Bt 4.0718的质粒和染色体均存在cry基因。3.Bt 4.0718菌株染色体上cr，基因的鉴定 采用脉冲电泳分离Bt 4.0718菌株的染色体，将染色体DNA带从凝胶上切下，利用透析袋电洗脱法回收染色体DNA，经Sall酶切后作为模板，进行PcR扩增。首先利用cryl、c叫基因的通用引物进行检测，获得预期的277bp和689bp的PcR产物。随后用cryl、cryZ基因的特异引物进行PCR扩增，分别获得1600bp与1200bp左右的PCR产物。对其进行限制片段长度多态性(RFLP)分析表明，Bt 4.0718菌株染色体上含有cryIAa、c尽了A。、cryZAa、cryZAb基因。
魏薇[4]2007年在《苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNA来源的初步研究》文中提出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)重组菌株HD73(pHC39)能同时产生双金字塔形和立方体形伴孢晶体，其晶体蛋白分别仅由cry1Ac和cry2Aa基因编码形成。本研究对双金字塔形和立方体形伴孢晶体进行选择性溶解和层析，使两种晶体蛋白-20 kb DNA复合物成分得到有效纯化，并分别抽提了其中的20-kb DNA片段混合体(20-kb DNA fragments，20-kb DNAs)。在此基础上，利用已报道的仅定位于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bt subsp. kurstaki)HD73染色体和75 kb内源大质粒上的相关基因作为遗传标记，利用PCR检测手段对同一亲本菌株中与双金字塔形和立方体形伴孢晶体复合存在的两种20-kb DNA的来源进行了分析。1．苏云金芽孢杆菌重组菌株HD73(pHC39)的构建以Bt 4.0718菌株双金字塔形伴孢晶体中20-kb DNA为模板，在获得cry2Aa基因编码区约1.9 kb序列的基础上，采用cry2Aa基因的特异性引物对cry2Aa基因的全长序列进行PCR扩增，并将所得到的片段用合适的限制性内切酶酶切后连入与之具有互补粘末端E. coli-B. thuringiensis穿梭载体pHT304中，获得重组质粒pHC39。pHC39经电转化入Bt库斯塔克亚种(Bt subsp. kurstaki)HD73菌株中构建重组菌株HD73(pHC39)。cry2Aa基因在HD73(pHC39)中得到高效表达，产生典型立方体型伴孢晶体，Cry2Aa蛋白表达量占总蛋白量的64.2％。2．重组菌株HD73(pHC39)晶体的选择性溶解及层析纯化对HD73(pHC39)菌株产生的两种形态的伴孢晶体分别在不同的条件下进行选择性溶解，发现Cry1Ac和Cry2Aa晶体蛋白均与20-kb DNA相结合。将溶解的双金字塔形晶体复合物于NaCO_3／HCl(pH9.5)缓冲体系，0-1 mol递增的Cl~-梯度洗脱条件下进行离子交换层析，立方体形晶体复合物于NaCO_3／NaOH(pH11.5)缓冲体系进行分子筛层析，得到相对纯化的晶体蛋白复合物，并从中分别抽提出与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合的20-kb DNA。3．对HD73(pHC39)中与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白相结合的20-kb DNA的来源分析采用定位于Bt库斯塔克亚种(Bt subsp. kurstagi)染色体基因组的16s rRNA的编码基因RRA和定位于HD73菌株内源75 kb大质粒的cry1Ac基因为遗传标记，以两种不同形态伴孢晶体中20-kb DNA为研究对象，以PCR检测技术为研究手段对其来源进行探索。结果在两种20-kb DNA上均检测到RRA基因和cry1Ac基因的存在，确定20-kb DNA来源于亲本菌株内源大质粒和染色体，且两种20-kb DNA在目前的研究范围尚未出现差异。4．20-kb DNA上染色体基因的鉴定采用相关数据库中已公布的苏云金芽孢杆菌5.2 Mb染色体DNA序列信息，每隔大致相同的距离选择一对基因并设计其特异引物，以这些基因为考量手段，探究染色体基因参入20-kb DNA是否存在区段特性，并为其成功克隆后阳性克隆的筛选提供选择标记。
闫贵欣[5]2009年在《对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究》文中认为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、杀虫毒力有限等缺点,因此,必须通过生物技术等手段寻找新的基因资源,并且构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。目前,发掘新的杀虫基因,研究其晶体蛋白结构和作用机制都是国内外研究的热点,本论文围绕对鞘翅目害虫高毒力Bt基因的克隆、工程菌的构建、杀虫晶体蛋白杀虫特异性机理等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:1、对蛴螬高杀虫活性cry8类基因的克隆:从自行筛选的菌株Bt145中克隆了cry8Ga2新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,构建了新的Bt工程菌株HD8G2,生物活性测定结果表明,工程菌株HD8G2与野生菌株均对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟表现出杀虫活性,LC50分别为1.25×108 cfu/g和5.59×108 cfu/g。从自行筛选的菌株BtSU4中克隆了cry8Ha1和cry8Ia1新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,获得了两株新型Bt工程菌株HD8H和HD8I。室内生物活性测定结果表明,HD8H和HD8I都对暗黑鳃金龟幼虫有较高的杀虫活性,LC50分别为2.19×1010cfu/g和8.50×109 cfu/g,对鳞翅目害虫无杀虫活性;从HD8H提取的蛋白经胰凝乳蛋白酶活化后,对叶甲科害虫大猿叶甲表现出较高的杀虫活性,LC50为18.00μg/ml。通过RT-PCR以及Western杂交证实cry8Ha1和cry8Ia1基因在宿主菌株BtSU4中均能正常的表达。两个新基因分别申请了国家发明专利,为其应用奠定了基础。2、对鞘翅目金龟甲科和叶甲科害虫工程菌的构建:将对鞘翅目叶甲科害虫高毒力的cry3Aa7基因,通过电击转化到对蛴螬高毒力的野生菌株BtSU4和HBF-1中,得到工程菌株3A-SU4和3A-HBF。室内生物活性测定结果表明,两株工程菌不仅对蛴螬表现出较高毒力,而且还获得对叶甲科害虫的杀虫活性。工程菌3A-SU4对马铃薯甲虫、大猿叶甲和暗黑鳃金龟幼虫的LC50分别为2.62μg/ml、1.25μg/ml和3.60×108 cfu/g;3A-HBF对马铃薯甲虫、大猿叶甲和铜绿丽金龟幼虫的LC50分别为1.74μg/ml,1.10μg/ml和0.73×108 cfu/g,两株工程菌扩大了对鞘翅目害虫的杀虫谱,具有良好的开发和应用前景。3、Cry8类蛋白杀虫特异性机理的研究:从蛋白的结构、蛋白的活化、蛋白与昆虫体内受体的结合叁个方面进行Cry8类蛋白杀虫特异性机理的初步探索。通过结构域互换的方法,得到Cry8Ca2和Cry8Ea1两种蛋白不同结构域组合的8种杂合蛋白,分析8种杂合蛋白对蛴螬的杀虫活性与其结构的对应关系,其中工程菌株HD (3+15()含由Cry8C的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8E的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)、HD (7+11) (含由Cry8E的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8C的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)、HD (6+10)(含由Cry8E的DomainⅠ和LoopⅠ及Cry8C的DomainⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)在浓度为1010 cfu /g时,对铜绿丽金龟幼虫的较正死亡率分别为44%、36%和32%。但所有的杂合蛋白都对暗黑鳃金龟幼虫失去了杀虫活性。通过Cry8Ha1、Cry8Ia1、Cry8Ga1和Cry8Ga2四种蛋白被暗黑鳃金龟中肠液与胰凝乳蛋白酶消化,胰凝乳蛋白酶活化的Cry8Ha1蛋白对大猿叶甲幼虫有较高的杀虫活性,而活化的Cry8Ga1、Cry8Ga2和Cry8Ia1蛋白对大猿叶甲幼虫无杀虫活性。用生物素标记的Cry8Ha1和Cry8Ia1蛋白均能与暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟幼虫的BBMV结合,但是这两种蛋白仅对前者具有杀虫活性。
张文飞[6]2011年在《苏云金芽孢杆菌分离与新型cry基因资源的挖掘》文中认为苏云金芽孢杆菌(简称：Bt)为土着的革兰氏阳性细菌,广泛分布于自然界,能够在各种不同的生境中分离得到,譬如土壤、树叶、水中、昆虫体内等。Bt菌区别其它芽孢杆菌的最大的特点是在生长后期有晶体蛋白会伴随芽孢的形成而生成,一般称为伴胞晶体。Bt菌株被认为是一种昆虫病原菌,其致病性主要或者完全取决于伴孢晶体蛋白,近年大量文献报道了各种Bt菌株对鳞翅目,鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目昆虫有杀虫活性,同时还发现一些Bt菌株对线虫、螨类和寄生虫有不同程度的活性。现今Bt被广泛应用商业化农业生产、森林害虫防治以及蚊虫控制,已经成为化学合成农药必要的补充或替代产品。尤其是来自Bt菌的杀虫晶体蛋白基因作为转基因作物关键性的基因资源,已经成功转入各种重要的农作物而为之提供抗虫能力最为引人关注。然而,现有的Bt毒蛋白依然对许多重要的农业害虫无能无力,需要进一步筛选分离新型Bt菌株和毒蛋白来有效控制它们。此外,现有Bt毒蛋白多年被反复应用,部分昆虫已经或正在逐渐形成抗性。因此全世界各国还在继续开展一系列高密度Bt菌株筛选和毒蛋白基因鉴定克隆的项目。从2004年起,我们发起了对中国各自然保护区Bt资源收集和新型杀虫基因鉴定克隆的研究项目。迄今为止,我们从黑龙江的凉水国家自然保护区(温带),广西区的大王岭、十万大山和弄岗国家自然保护(亚热带),以及海南尖峰、吊罗山、霸王岭岭和五指山热带国家自然保护区,共收集了2,916份土壤样品。利用醋酸钠-温度筛选方法,总共分离获得5,915株芽孢杆菌和208份Bt菌株,菌株平均分离率为3.52%,至此,一个较具规模的芽孢杆菌和Bt菌株库在海南热带农业资源研究所(HITAR)建成。与此同时我们对Bt菌株分布和生境相互关系进行了分析,为了解Bt菌株分布和进一步分离筛选Bt菌株提供思路。本研究中采取扫描电镜观察(SEM)、SDS-PAGE蛋白电泳分析、脉冲场电泳分析、以及生物活性测定等方法对Bt分离株进行鉴定和分析。为了鉴定Bt分离株所含有的新型杀虫晶体蛋白基因,我们发展了新的Polymerase Chain Reaction-fragment length polymorphism (PCR-RFLP)鉴定体系,从不同Bt菌株中鉴定克隆10个新型的cry基因,包括cry1Ac22、cry1Ac30、 cry1Ac31、cry30Ea1、cry30Ga2、cry40Da1、cry50Ba1和cry54Ba1等基因。研究结果表明我们发展的新型PCR-RFLP鉴定体系不仅可以鉴定已知cry基因,还能鉴定未知的cry基因,我们相信应用这套新型PCR-RFLP杀虫蛋白基因鉴定体系,将来会有更多的杀虫基因被鉴定克隆。接下来传统的DNA文库,PCR方法,包括Inverse PCR和single oligonucleotide nested-PCR(SON-PCR)等方法,被用来克隆鉴定的杀虫基因的全序列。两种表达体系用于克隆的cry基因的表达,分别用大肠杆菌和Bt无晶体突变株作为表达宿主。鳞翅目昆虫小菜蛾、双翅目昆虫致倦库蚊和白纹伊蚊以及鞘翅目昆虫椰心叶甲幼虫作为靶标昆虫用来测试表达蛋白和Bt菌株的杀虫活性。生物测定结果表明表达的Cry1蛋白对小菜蛾幼虫有很高的杀虫活性。蚊虫是一种非常重要的疾病媒介昆虫,在全世界范围内广泛传播各种人和动物致病病毒和寄生虫,诸如疟疾、黄热病、登革热、丝虫病、乙型脑炎和西尼罗河病毒等。由于没有成功开发或者开发成本过于昂贵,目前有效的预防药和疫苗还未普及,因此控制这些蚊媒疾病主要靠控制蚊的数量来降低蚊媒疾病的大规模爆发。但由于化学合成杀蚊剂对环境污染和蚊虫极易对化学杀蚊剂产生抗性,人们逐渐把注意力转向了生物农药,以杀蚊Bt菌为代表的生物农药的表现令人鼓舞。尤其是苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)具有高效的杀蚊活性,而且蚊虫不容易对之产生抗性,最重要是对环境友好,被世界卫生组织(WHO)推荐来控制蚊虫的滋生而降低蚊媒疾病爆发。Bti作为化学杀蚊剂的补充多年来被广泛应用,长期反复使用Bti的毒素蛋白,大大增加了蚊对之产生抗性的风险。本研究中分离鉴定了30多株对蚊有活性的Bt菌株,其中BtS2160-1具有和Bti相当的杀蚊活性。但是BtS2160-1的大质粒的脉冲场电泳分析、伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE电泳分析、以及cry基因类型等与Bti表现出很大的差异。因此我们有理由相信BtS2160-1是一种新的杀蚊Bt菌株,可以与Bti的互为补充应用于蚊虫的控制,减少蚊虫对Bti的毒蛋白产生抗性的风险。我们应用PCR-RFLP鉴定体系成功鉴定Bt S2160-1中含有cry30Eal, cry30Ga2,cry50Ba1和cry54Bal4个新型杀虫基因,但是另外2种主要的晶体蛋白(140kDa和30kDa)对应的杀虫基因没有鉴定出来。进一步利用质谱分析晶体蛋白,结果发现只有cry50Ba和cry54Ba基因被鉴定在BtS2160-1菌株中表达,其它2个cry30基因在原始宿主中不表达或者表达微弱。然而表达的Cry54Ba蛋白只表现出较低的杀蚊活性,在原始宿主中可能和其它的毒素蛋白有协同作用而发挥更大杀虫活性。基因组测序分析表明许多以前没有被鉴定的杀虫基因,但发现它们实际并没有杀虫活性,一般被认为是假基因。Bt S2160-1菌株中cry30Ea和cry30Ga基因初步鉴定在原始宿主不表达,类似于假基因。总的来说,中国具有辽阔的疆域,具有独一无二的生态环境和地理特征,并且拥有丰富生物资源和良好的物种多样性,蕴藏了大量Bt菌株资源亟待我们开发利用。本研究着重Bt菌株资源收集和杀虫基因鉴定克隆,以期获得新杀虫菌株和杀虫基因应用于农业生产、森林保护和疾病媒介昆虫的控制,而这些研究对农业生产、环境保护和疾病防治将是非常必要和有意义的。
刘旭光[7]2004年在《苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究及应用》文中指出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)产生的δ-内毒素(或杀虫晶体蛋白)对多个目的害虫具有杀虫活性，其独特的优点在农林害虫的生物防治中得到了广泛的应用。鉴定编码杀虫晶体蛋白的基因(cry基因)，对于发现、分离、克隆特异活性的新基因以及转基因植物和微生物等研究都具有重要意义。 传统的Bt δ-内毒素基因鉴定方法主要是建立在PCR基础之上的，由于自身具有局限性，此类方法已不能适应高通量、大规模、迅速、平行等基因组研究方面的要求，因而目前迫切需要应用一种新的检测方法以适应基因组研究的要求。 基因芯片技术是近年来发展起来的基因组研究技术。现已表明它是在基因组规模上研究基因表达和调控的一种强有力的研究工具，同时也是原核和真核生物功能基因检测与多态性研究的极好方法。虽然人们对基因芯片技术进行了深入的研究，但是目前尚无应用寡核苷酸探针在不进行定向扩增条件下直接检测总DNA中功能基因的相关报导。 本研究中，建立了应用寡核苷酸芯片检测Bt总DNA中cry基因的方法；在应用此方法与生物信息学的基础上，构建并应用了cry1、cry2、cry9基因检测芯片。其主要研究结果如下： 1 Bt cry基因检测芯片关键技术研究 通过对基因芯片中探针长度、浓度、总DNA的含量与处理、标记方法、灵敏度和杂交条件的研究表明，用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40-50mer、40μmol·L~(-1))杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因，从而建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。 研究表明，不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显着性差异(P＜0.01)，而不同浓度的探针之间没有显着性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3小时；检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg；标记产物杂交用量(0.625 to 20μg)的对数值与信号值的对数值之间存在着明显的线性关系(r~2=0.985 to 0.989)。 2 生物信息学在cry基因芯片检测中的应用 针对在线BLAST的不足，建立了Bt cry基因核苷酸序列本地数据库，并在此基础上进行寡核苷酸探针的本地BLAST以确保其特异性。通过与在线BLAST比较，本地BLAST在准确性、冗余信息的去除以及使用简便性等方面要优于在线BLAST。 根据Bt δ-内毒素基因核苷酸序列的同源性关系，充分应用生物信息学方法设计了用于cry1、cry2、cry9基因检测的寡核苷酸分级探针。 3 cry1、cry2和cry9基因检测芯片的制备与应用 制备了cry1、cry2和cry9基因检测芯片并分析了8个苏云金芽孢杆菌菌株的基因型。结果表明，寡核苷酸芯片检测结果与已知菌株的基因型吻合，与未知基因型的菌株的PCR-RFLP初步鉴定结果也有很高的一致性。
孙运军[8]2007年在《苏云金芽胞杆菌伴胞晶体中20-kb DNAs的序列分析与来源研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)在芽孢形成过程中能产生对目标昆虫具有特异性毒杀作用的伴胞晶体。研究表明伴胞晶体中存在与原毒素相互作用的20-kb DNA片段，该片段对晶体的形成及晶体蛋白在敏感昆虫体内的激活过程可能具有重要的作用。但有关同毒素蛋白结合的20-kb DNA的序列和来源还未见有报道。本论文通过对Bt野生菌株和重组菌株晶体中DNA的序列与来源进行研究，验证了20-kb DNA同原毒素的特异性结合，为探讨晶体中原毒素与20-kb DNA的结合机制以及20-kb DNA的功能提供基础。Bt野生菌株4.0718对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和小菜蛾(Plutella xylostella)具有较高毒力。该菌株含有cry1和cry2两类基因，能够产生菱形和方形晶体。双向电泳和质谱分析检测到该菌株表达的Cry1Ac和Cry2Aa两种晶体蛋白。研究发现Bt 4.0718菌株Cry1原毒素与20-kb DNA发生紧密结合，利用PCR-RFLP技术首次在20-kb DNAs上检测到cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab四种cry基因，其中的cry1Ac和cry2Aa基因能够在Bt无晶体菌株Cry~-B中正常表达，说明20-kb DNAs含有功能性cry基因。将cry2Aa基因转化到HD73菌株获得重组菌株HD73(pHC39)，该菌株能产生由Cry1Ac原毒素形成的菱形晶体和Cry2Aa原毒素形成的方形晶体，研究表明Cry1Ac和Cry2Aa两种原毒素均能与源于染色体和大质粒的20-kb DNAs片段发生紧密结合。RAPD分析表明，基因组DNA中可能只有部分DNA片段参与形成原毒素-20-kb DNA复合物。
孙长坡[9]2007年在《苏云金芽胞杆菌G03的芽胞形成相关基因对cry基因表达的影响》文中认为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。Bt与其它芽胞杆菌相比，一个显着特点就是不仅能够形成芽胞，同时还能产生由杀虫蛋白组成的晶体。在模式芽胞杆菌枯草杆菌中有关芽胞形成的相关基因研究较深入，而Bt晶体形成机制方面的研究主要是集中在杀虫晶体蛋白基因的表达调控，有关晶体形成与芽胞形成相关基因关系的研究报道极少。本研究利用苏云金芽胞杆菌全基因组序列，初步研究了芽胞形成相关基因与杀虫蛋白基因表达、调控的相互关系。利用携带Mini-Tn10转座子的pIC333构建了B．thuringiensis G03的转座子突变体库，获得了50，000株具有壮观霉素抗性的突变体。筛选获得一株不能产生芽胞和晶体的突变株，命名为G03(spoⅢAE)∷Mini-Tn10。分析Mini-Tn10转座子两端的侧翼序列确定了插入位点位于spoⅢAE基因的前端，并造成了9个碱基的重复。Southern blotting分析表明，Mini-Tn10转座子在染色体上只有一个插入位点。SDS-PAGE分析表明晶体蛋白的表达由于spoⅢAE基因的失活而受到严重影响。已知编码晶体蛋白的cry基因是sigmaE、sigmaK因子共同控制转录的，而且sigmaE因子发挥主要作用，据此推测sigmaE因子的活性有可能因spoⅢAE基因的失活而降低。枯草芽胞杆菌作为芽胞杆菌的模式菌，其芽胞形成的级联调控网络中，spoⅢAE基因的转录是由上游的sigmaE因子控制的，SpoⅢAE蛋白则是激活下游的sigmaK因子所必需的，过去未见SpoⅢAE蛋白影响sigmaE因子活性的报道。为进一步分析Bt芽胞与晶体形成相关基因调控的相互作用与特点，我们又开展了下面的研究。构建了spoⅢAE基因的敲除载体pRAE，然后导入G03菌株，通过高温诱导突变获得了spoⅢAE基因的缺失突变株G03(spoⅢAE△)。该突变株不能产生芽胞和晶体，SDS-PAGE分析表明只能产生少量的杀虫蛋白。克隆了G03 cry1Aa基因的启动子，并构建了携带cry1Aa′-′lacZ的表达载体pHTcry1Aa。然后将载体pHTcry1Aa分别导入出发菌株G03和突变株G03(spoⅢAE)∷Mini-Tn10、G03(spoⅢAE△)中，转录分析表明两突变株中的cry1Aa基因活性严重降低。克隆G03菌株中由sigmaE直接调控的spoⅡD基因的启动子，构建了携带spoⅡD′-′lacZ的表达载体pHTspoⅡD。将载体pHTspoⅡD分别导入出发菌株G03和突变株G03(spoⅢAE)∷Mini-Tn10、G03(spoⅢAE△)中，转录分析表明spoⅡD基因的活性显着降低，说明spoⅢAE基因的敲除严重降低了sigmaE因子的活性。以上结果说明spoⅢAE基因的失活导致Bt菌株不产生杀虫晶体，是由于spoⅢAE基因为sigmaE因子维持高活性所必需。在芽胞形成中spoⅢAE基因对sigmaE因子存在一种反向正调节作用，它的缺失导致sigmaE因子活性降低，从而导致cry1Aa基因的活性降低。为证实spoⅢAE基因的下游基因缺失是否影响sigmaE因子活性，我们对直接参与sigmaK因子激活的spoⅣF操纵子进行了以下研究。构建了spoⅣF操纵子的敲除载体pRIVF，敲除spoⅣF操纵子获得了突变株G03(spoⅣF△。该突变株也丧失了产生芽胞和晶体的能力，SDS-PAGE分析表明突变株G03(spoⅣF△)的杀虫蛋白产量也非常低。为了验证spoⅣF操纵子的功能，构建了恢复载体pSIVF进行了功能互补实验。结果表明部分恢复了突变株G03(spoⅣF△)产生芽胞和形成晶体的能力。将载体pHTcry1Aa和pHTSpoⅡD分别导入突变株G03(spoⅣF△)，转录分析表明cry1Aa和spoⅡD基因的活性显着降低，说明spoⅣF操纵子缺失也可导致sigmaE因子的活性降低，进而影响cry1Aa基因的表达。杀虫蛋白表达量的SDS-PAGE分析发现，与spoⅢAE基因相比，spoⅣF操纵子对sigmaE因子的活性影响要小一些。
宋福平[10]2001年在《苏云金芽孢杆菌特殊异性cry基因的研究》文中指出鳞翅目夜蛾科害虫甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）是一类危害极其严重、抗性上升较快的世界性害虫。对其毒力最高的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫晶体蛋白是CrylCa，根据de Maagd等人的研究结果，CrylCa蛋白的结构域（Domain）Ⅲ决定对甜菜夜蛾的特异性，所以从Bt中寻找高毒力的新的杀虫基因，与CrylCa Domain Ⅲ进行替换，构建高效的融合基因，进一步培育转基因作物和构建遗传工程菌，是一条切实可行的害虫防治新途径。 依据上述思路，本文系统研究了Bt中的一类沉默基因—crylI类基因；克隆了对鳞翅目害虫甜菜夜蛾有活性的crylCa和crylCb基因；深入研究了CrylCa蛋白的活性区；用定点诱变和Domain替换等方法分析了Cry1Ca蛋白结构与功能的关系；建立了Bt和E.coli菌株中的cry基因表达系统。这些研究为揭示cry毒蛋白活性、结构与功能关系、各Domain间的相互关系奠定了基础，对于深入研究Bt杀虫基因的功能与表达调控、延缓昆虫抗性、以及转基因抗虫植物的培育和高效工程菌的构建都具有重要意义。1．cry沉默基因的研究 在国际上率先建立了crylI基因的酶切扩增多态性（cleaved amplified polymorphicsequences，CAPS）鉴定体系，对142株Bt菌株进行了鉴定，98株中含有crylI类基因，证明这一基因广泛存在于Bt菌株中，其中68株含有crylIa基因，29株含有crylIb基因，8株含有crylIc基因，没有发现crylId基因，6株含有一种新类型的crylI基因，PCR产物酶切产生了585，571，381，47bp的四个片段，与已知crylI基因产生的片段不一致。首次系统地研究了142株Bt菌株的crylI-cryl类基因的连锁规律，根据cryl基因下游保守区序列和crylI基因上游保守区序列，设计了一对特异性通用引物S5una和S3una，PCR检测，其中71株出现阳性结果，说明了这种连锁普遍分布于Bt菌株。随后克隆了Btc007和J8菌株中的crylI-cryl类基因的连锁序列，完成序列测定，在GenBank中登记，Accessionnumber分别为AF373208、AF373209。序列分析表明，Btc007中是cry1Db和crylI基因连锁，J8中是crylAc和crylIa连锁，在两个基因的间隔区存在多个原核转录终止序列，无启动子，揭示了这两个菌株中crylI基因沉默的原因。 根据上述鉴定结果，从Bt菌株Btc007中克隆了一种新类型的crylI基因。该基因编码分子量为81KDa的蛋白质，由719个氨基酸组成，等电点为pH5.91。进一步确定了5个保守区（conserved block）的位置，Block在186-202、Block 2在253-298、Block 3在491-536、Block 4在557-567、Block 5在634-643氨基酸之间。比较了氨基酸的同源性，发现与己知Cry蛋白的同源性都低于95％。该基因已在GenBank中登记，Accession number为AF211190。Bt毒蛋白基因国际命名委员会已正式命名该基因为crylIel，并确定其为一种新的cry模式基因，这也是我国分离克隆的第一个cry模式基因，在分类上占有重要地位。 摘 公 从Bt菌株Bt。001中克隆了一种新的Crylla基因，被Bt ＄蛋白基因国际命名委员会 命名为 cryllas基因。Accession nubmer为 AF373207，该基因编码的蛋白质由719个氨基 酸组成，等电点为叫．995。 用 pET－Zlb载体分别构建了表达CI’yllel和 Cryllas基因的重组质粒 pETB－IIE和 pB081 IA，导入大肠杆菌 BLZI（DE3）中获得高效表达。这是国内首次用 pET系列的载 体表达 cry基因。表达产物 Cryllel对鳞翅目害虫亚洲玉米螟（Ostrinia firnacalis）和小 菜蛾 （Plutell xylostella）两种试虫具有高毒力：对亚洲玉米螟LC扣为 16．Zlppm，接近对 玉米螟毒力最高的CrylAb基因，对小菜蛾的LC。。为197．88ng／mL；Cryllas对玉米螟和 小菜蛾也表现出高毒力，对玉米螟的 LCS＊于 25PPm，对小菜蛾LCS。为 2227．38figlinL。 但未发现两者对鞘翅目害虫榆兰叶甲（Pyrraha aenescens）有活性。这两种基因的克隆为 玉米螟等鳞翅目害虫的防治提供了新的基因来源。 2．对甜菜夜蛾有活性的Cy基因研究 从 Bt菌株 JS中克隆了一种 Cy1Ca基因，编码 11 89个氨基酸组成的蛋白质，分子量 为 134．7m山等电点为 pH4．745，是弱酸性蛋白质。确定了 CrylCS蛋白 5个保守区的位 置，Block在152－181、BlockZ在225－269、Block3在449－496、Block4在517－527、Block 5在605－6 14氨基酸之间。同源比较发现该蛋白与己知的CrylCa氨基酸序列存在差异， 己为 Bt毒蛋白基因国际命名委员会命名为 CIy1Ca7基因。GenBank的 Accession number 为AYOI 5492。从BtC008中分离了1种cy1Ca基因，序列分析发现与Cry1Ca7完全同源。 从Bt菌株BtC001中分离了一种cy1Cb基因，该cy1Cb基因编码的蛋白质由1176 个氨基酸组成，分子量133ica，等电点为pH4．32。该
参考文献：
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