湖南省常德市第一人民医院麻醉科 湖南常德 415000
【摘 要】目的：探讨肢体短暂缺血预处理通过体液因子抑制肺泡巨噬细胞（AM）作用有无种属区别。方法：实验设空白组，内毒素对照组，和血清实验组（大鼠血清，人血清）。MTT法检测血清对AM的活力转归的影响，流式细胞仪检测AM凋亡情况。结果：与空白对照组比较，大鼠和人血清组对激活状态的AM均有明显的抑制，血清组间抑制作用无显著差别（P>0.05），流式细胞仪显示，血清各组（大鼠，人）凋亡率分别为37，9%，38.2%，组间无差异（P>0.05），但均明显高于空白组（P<0.05）。结论：肢体短暂缺血预处理通过体液因子抑制肺泡巨噬细胞作用种属间无区别。
【关键词】缺血；预处理；血清；肺泡巨噬细胞；种属
[Abstract] Objective：To study the difference of the inhibitory effect on Alveolar macrophages of transient limb remotely preconditions through serum between rats and human races.Methods：The control group，the endotoxin control group and the serum experimental group（rats and human races）were included in this study.The influence of serum on the group proliferation of Alveolar macrophages in vitro was detected with MTT assay.the apoptosis was detected with flow cytometry（FCM）.Result：the inhibition of the proliferation of Alveolar macrophages line in surm experimental groups was more obviously compared with the control group（P<0.05），but there is no difference between the rats group and the human races group（P>0.05）.FCM showed that the apoptosis rates in groups of the serum（rats，human races）were 68.31%，68.62%，no difference was found between the two groups（P>0.05）.And which were significantly higher than the control group（P<0.05）.Conclusion：No difference of the inhibitory effect on Alveolar macrophages of transient limb remotely preconditions through serum was found between rats and human races..
[Key words] Ischemia；precondition；serum；Alveolar macrophage；specie
许多研究已经表明肢体多次短暂缺血预处理能够产生远隔器官心肺保护作用[1]，认为主要由神经及体液共同调节。本研究从体液途径研究肢体缺血远处对体外肺泡巨噬细胞的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SD大鼠8只，徐州医学院实验动物中心提供，清洁剂，雄性，体重（210±8）g。
1.2 仪器与试剂
Biotek酶联免疫检测仪（PE公司），流式细胞仪（Bechman Coulter公司），小牛血清（南京建成生物研究所），内毒素（武汉博士德生物工程研究所）。
1.3 肢体短暂缺血预处理模型建立及血清的采集 利用止血带对大鼠后肢缺血再挂灌注各5min，共4个循环，建立肢体缺血预处理模型[2]，并于预处理1小时后抽取血液静置10分钟后，3000r/min转离心取上清。
1.4 细胞培养 10%小牛血清加入到AM细胞，37。C、5%CO2培养箱中培养，对数生长期细胞用于实验。
1.5 MTT法检测AM细胞抑制率实验设实验设空白组，内毒素（LPS）对照组，和血清实验组（大鼠血清，人血清），每组设5个复孔，空白对照组调零，各组分别培养48h后，血清组分别加入50%血清、100%血清继续培养8h后，弃上清每孔加入二亚基甲砜150ul，震荡溶解，酶联免疫仪检测吸光度OD值。细胞抑制率（%）=[（对照组OD-实验组OD）/对照组OD]×100%
1.6 FCM法检测AM细胞凋亡 取对数生长期的AM细胞，每组5瓶，各组分别培养48h后，血清组分别加入大鼠血清、人血清继续培养8h后，3000r/min离心10min，弃上清，加入二亚基甲砜150ul，震荡溶解，PBS重复洗涤3次。用-4。C的95%乙醇固定后，流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率。
2 统计学方法
应用13.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差别有统计学意义。
3 结果
3.1 形态学改变
400倍普通光镜下观察，血清组（人类、大鼠）均可见AM细胞体积变小，触角变少，运动迟缓，胞浆浓缩，细胞核浓缩、碎裂。
3.2 MTT法检测血清AM的抑制作用
与空白对照组比较，血清对AM细胞有显著抑制作用（P<0.05），血清组间抑制强度无差异（P>0.05）。
结果见表1
注：G1、S、G2、M为细胞分裂各周期，与血清（人）组比较，★P>0.05；与空白对照组比较，☆P<0.05
讨论：
肢体缺血预处理已被大量研究证实对远隔心肺等重要脏器有保护效应，其作用机制有神经途径和体液机制两种学说。Mikiko S将兔双下肢行5个循环的缺血再灌注处理后，腹膜透析出血中小分子对缺氧-复氧处理的肠道黏膜细胞有显著保护作用，维护细胞膜完整性和改善通透性。该研究还发现人类肢体同样预处理后，透析出的小分子物质对大鼠AM细胞有类似的作用，证实是保护效应是超越种属的。[3]
AM细胞是肺部炎症反应的重要防御细胞。Gordon S 提出AM细胞处于不同的微环境演变成亚型，对炎症有截然相反的效应：典型激活状态巨噬细胞（CAM），促炎效应；选择性激活状态巨噬细胞（AAM），则对炎症反应有抑制作用[4]。AAM肺损伤愈合的三个过程：下调炎症，血管发生和组织碎片和凋亡小体的清除。在肺内AAM可能还通过负性调节信号来避免宿主对环境发生过度炎症反应。在急性炎症反应中不只一个巨噬细胞功能亚单位参与，早期阶段主要是炎症和/或细胞毒活性为主，终末期主要是抗炎/组织再生活性为主。[5]
本研究组已经证实大鼠肢体缺血预处理以后，提取的血清对体外培养的AM细胞有明显的生长抑制效应，促进凋亡发生，使其由促炎的典型激活状态向抑炎的选择性激活状态转变。为进一步探讨不同种属有无保护作用，我们采用人类肢体缺血预处理以后，提取血清，观察该血清对大鼠AM细胞的影响，发现对大鼠AM细胞形态、增殖及凋亡有同大鼠血清相似的作用效果，使CAM向AAM转变，大鼠AM细胞生长停滞与G1期。本研究说明肢体短暂缺血预处理的体液途径的保护作用是超越了种属区别。
本研究为围术期重要器官肺保护提高了一个新的途径和思路，但是对该小分子物质的研究还需要进一步深入。
参考文献：
[1] Pickard J M J，Bøtker H E，Crimi G，et al.Remote ischemic conditioning：from experimental observation to clinical application：report from the 8th Biennial Hatter Cardiovascular Institute Workshop[J].Basic Research in Cardiology，2015，110（1）：453-453.
[2] Küntscher MV，Schirmbeck EU，Menke H，et al.Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model.[J].Plastic & Reconstructive Surgery，2002，109（7）：2398-404.
[3] Mikiko S，Michael T，Diaz R J，et al.Transient limb ischaemia remotely preconditions through a humoral mechanism acting directly on the myocardium：evidence suggesting cross-species protection.[J].Clinical Science，2009，117（5）：191-200.
[4] Eastman R C，Arakaki R F，Shawker T，et al.A prospective examination of octreotide-induced gall-bladder changes in acromegaly.[J].Clinical Endocrinology，1992，36（3）：265-9.
[5] Stout R D，Suttles J.Stout，RD & Suttles，J.Functional plasticity of macrophages：reversible adaptation to changing microenvironments.J.Leukoc.Biol.76，509-513[J].Journal of Leukocyte Biology，2004，76（3）：509-13.
论文作者:张雄飞
论文发表刊物:《航空军医》2016年第6期
论文发表时间:2016/6/14
标签：血清论文; 细胞论文; 肢体论文; 大鼠论文; 作用论文; 抑制论文; 炎症论文; 《航空军医》2016年第6期论文;