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摘要：目的：通过比较探讨微波固定在消化道内分泌细胞免疫组化染色中的方法。方法：应用不同强度的微波辐射与常规福尔马林方法固定组织，并石蜡切片免疫组化染色观察。结果：常规福尔马林固定经抗原修复后，经染色内分泌细胞呈棕黄色，不经抗原修复内分泌细胞能着色，用微波辐射低档达45℃、55℃、70℃固定的组织都能被着色。结论：微波固定组织切片染色效果明显优于常规福尔马林固定组织，使固定时间缩短，提示微波固定的材料能很好的保存抗原。
关键词：微波; 石蜡切片; 消化道; 内分泌细胞
[中图分类号]R4[文献标识码]A文章编号：
微波辐射能使液体中极性分子高频振动，增加液体分子间的摩擦和碰撞，从而使液体内部迅速产热和某些化学反应加快。许多作者利用此原理进行了微波辐射固定组织、微波辐射与固定液结合固定组织和微波促进组织染色的实验等[1-9]，均取得良好的效果。但微波辐射固定某些特定组织在免疫组化染色中的具体方法报道还很少，为了拓展微波在组织切片中的应用，作者探讨了微波辐射固定胃肠内分泌细胞在免疫组化中的具体方法。比较甲醛固定与微波固定在消化道内分泌细胞的不同。说明用微波固定胃肠内分泌细胞比常规固定时间缩短，这使免疫组织化学对生物医学基础研究、预防、临床医学的研究、军事医学的应用研究都有重要的价值。
1.材料与方法
1.1材料与主要仪器 取蟾蜍的胃、肠为实验材料，海尔牌H-R7751MS型家用微波炉（750W，分6档）为辐射仪器,0.01mol/LPBS液(pH7.4),0.01mol/LpH6.0柠檬酸缓冲液(CB),羊血清(北京博奥森生物技术有限公司),一抗(胃泌素.福州迈新生物技术开发有限公司;5-HT.博士德生物工程有限公司),二抗Maixin试剂(北京博奥森生物技术有限公司),DAB显色试剂盒(试剂A浓缩缓冲液,试剂B浓缩DAB溶液,试剂C浓缩过氧化氢溶液)。
1.2固定方法 将材料分成14个组，8个对照组，6个实验组，8个对照组是内分泌细胞常规福尔马林固定方法，各个实验组分别用不同强度的微波辐射，以便突出实验组微波辐射的效果。各组材料固定方法见附件表1。为了防止材料在微波辐射时因温度升高过快组织内产生气体而损伤组织，一般控制微波辐射在2分钟间升高至设计温度。为了使实验组较准确的达到设计温度，先用生理盐水在微波炉内进行各档微波辐射测试，找出符合实验设计的微波辐射档次和恰当的辐射时间。微波辐射的档次是根据微波辐射时间和最高温度设计并预先测试后而选定的。微波辐射方法：根据微波穿透深度特性，将实验1、2、3、4、5、6组材料放于小白广口瓶（容量60ml）内加20ml生理盐水，而后放在内盛400ml水的玻璃器皿上方并一同放入微波炉内，低档辐射达预定温度。
2.结果
2.1对照组 组织结构与透明：胃肠壁组织结构完整，透明良好，各类细胞均有一定程度的收缩。结缔组织内常有较大的空隙，腺管腔常扩大，肠黏膜上皮间有一定裂隙。组织着色：对照组的内分泌细胞经免疫组化染色呈棕黄色，结缔组织与其他的结构不着色。对照1、3、5、7组比对照2、4、6、8组效果更明显。
2.2实验组 实验3、4组组织结构与透明：胃壁组织无损伤，基本透明，细胞无收缩，胞质均匀，胞间隙与各腺管腔正常，胞间隙清晰，内分泌细胞正常，透明清晰。组织着色：内分泌细胞着色比对照组着色深，其他细胞不着色。从整体效果看，组织完整性好，细胞形态好，内分泌细胞着色深，效果优于对照组。实验5、6组组织透明性好，胃壁黏膜表层有损伤，细胞显著膨胀，免疫组化染色内分泌细胞着色。结缔组织与其他组织不着色。实验1、2组胃壁黏膜多与其他层次脱离，内分泌细胞也可染色，透明较差。
3.讨论
通过以上实验5、6组提示胃黏膜浅层损伤，结缔组织损伤和内分泌细胞膨胀可能是微波辐射过量所致。实验1、2组提示胃黏膜与其他组织脱离，组织透明不良，可能是组织固定不够所致。实验3、4组组织结构完整性与染色均良好，提示单独微波辐射能良好的固定内分泌细胞，微波达55℃是理想的微波辐射量。组织完整性好，透明好，细胞无损伤，无收缩，胞质均匀，经免疫组化染色鲜明。常规福尔马林固定使细胞有一定的收缩，能使内分泌细胞着色，而微波辐射固定既能保持细胞正常的形态和结构，经免疫组化染色又能使内分泌细胞着色。说明微波辐射既能良好的固定内分泌细胞，又能很好的保护组织细胞的形态和结构。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过特异的抗原、抗体反应标记上可见的显色剂，来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。甲醛在固定组织中所起的作用机理目前尚不很清楚，其可能机制是在用甲醛固定组织时，甲醛使蛋白质发生凝固，在发生凝固的过程中可引起蛋白质自身和不同的蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联。交联过程中可导致蛋白质的三级或四级结构的折叠方向发生改变，出现空间阻碍，同时抗原与其他分子之间也会发生交联，形成网络结构而掩盖抗原决定簇。蛋白质发生交联的程度受甲醛溶液的pH值、温度、固定时间的影响。
由于当前对甲醛固定组织所发生的反应，尤其对蛋白质的立体构象会发生的影响尚不十分清楚，导致对抗原修复的机制也不很清楚。可能的机制主要是1.）由于甲醛固定可使蛋白与甲醛、蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间通过甲基化桥形成交联，抗原决定簇被遮蔽，可通过高温、盐缓冲液使交联的蛋白水解，断开交联[10]。2.）认为组织用甲醛固定时，会形成蛋白-甲醛-钙复合体，并遮蔽了抗原决定簇，可通过高温使钙离子释放，并与修复液中的螯合物-柠檬酸结合，使抗原决定簇暴露[10]。3.）还有观点认为，经甲醛固定后，可形成甲醛化蛋白的三维空间，加热后可恢复蛋白质自然的三维空间，使抗原得以修复[10]。甲醛固定使抗原决定簇遮蔽,微波固定,不存在抗原决定簇遮蔽.
由各组结果可见，材料经微波辐射后经免疫组化染色整体效果优于对照组，这些方法不仅大大缩短了制片时间，而且在临床疾病研究有了重大的突破。更重要的是还在理论上提示经抗原修复与不经修复的都着色，见图1、2。微波处理也着色。本实验结果正说明了这种结果，因此具有很大的推广价值。
参考文献：
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[5]李映菊，谢艳红，马林.微波照射在心肌石蜡切片特染中的应用.临床与实验病理学杂志，1998，14（3）305.
作者简介： 李明华：（1986.10-），女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：循环生理学.
史鹏飞：（1984.02-），男，河南周口人，硕士研究生，研究方向：骨不连的治疗.
收稿日期：2015-09-10
论文作者:李明华 史鹏飞
论文发表刊物:《健康文摘》2015年12期
论文发表时间:2016/4/27
标签：微波论文; 细胞论文; 内分泌论文; 抗原论文; 组织论文; 甲醛论文; 免疫论文; 《健康文摘》2015年12期论文;