马巧蓉
广西壮族自治区民族医院检验科 广西南宁 530001
【摘 要】自身抗体是诊断自身免疫病的重要依据，每种自身免疫疾病都伴有特征性的自身抗体。患者血液中存在高效自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫疾病的重要依据。本文介绍自身抗体对自身免疫性疾病诊断的应用及自身抗体检测技术的发展趋势，评估自身抗体检测方法应用现状，分析了临床自身抗体检测技术的优缺点，让临床实验室更加合理有效选择自身抗体检测技术。
【关键词】自身免疫疾病；自身抗体；实验室技术和方法
针对于自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AID）而言，其是属于一种器质性、功能性障碍疾病，引发其发病的主要因素就是在具有免疫效应的细胞或者相应的抗体的作用下，机体的正常结构成分被破坏。在现代的医学中，对于自身免疫性疾病并没有给予确切的发病机制，在实际临床中，自身免疫性疾病属于不典型症状与体征，对于其的诊断也较为复杂。针对于AID和自身免疫应答来讲，自身抗体（autoantibody，AAB）是其最为重要的一个特征，在相关的AID 的诊断的指南中，已有多种自身抗体被列入其中，在对 AID 的鉴别诊断与诊断、对病情的评估、判断疾病的活动度、病情评估、用药指导等多方面，自身抗体都起到了极大的应用价值。因此，在对自身免疫性疾病实际的临床诊断中，免疫学实验诊断相比较临床表现而言，占据着重要的诊断意义。在实际临床中，通过对自身抗体的滴度以及类型进行有效的检测，其检测的结果具有科学的依据性，有利于对自身免疫性疾病的诊断、分型、治疗以及预后评估。以下，就对在部分 AID 诊断中，对自身抗体的应用展开详细的论述，对其实验诊断技术的问题进行综述。
1.临床常见自身免疫性疾病自身抗体谱
“自身抗体普”是每一种免疫疾病都伴有特征，在对自身免疫性疾病的早期诊疗中，自身抗体是其最为重要的依据，而自身抗体谱则是必不可少的生物学指标，其中，在患有自身免疫性疾病患者的血液中，存在着高效自身抗体，这是该病中主要的特点之一，也是确诊该疾病最为重要的依据。自身抗体凭借着所具有的高度特异性，在诊断与确诊相应疾病中成为了诊断金标准。
1.1系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）
在自身免疫疾病中，系统性红斑狼疮属于一种弥漫性结缔组织疾病，其主要的突出变现是由自身免疫为介导，以免疫性炎症为主。在实际的临床中，该病主要的特征是复杂多变，反复迁延，并且，多种自身抗体可以在患者的血清中检验出，着这也是该病最主要的实验室特征。
1.1.1抗 dsDNA 抗体和抗 Sm 抗体。在1997年，美国风湿病学会（ACR）将抗dsDNA 抗体作为了其推荐的 SLE 分类标准中诊断 SLE的标记抗体[2]。有相关的医学研究证明，在在肾小球基底膜中沉积抗 dsDNA 与 DNA 结合成为免疫复合物，亦或者是在肾小球抗原遭受到抗体直接性作用，可以造成SLE 患者的肾损伤，所以，针对于抗 dsDNA 而言，其即有利于对SLE进行诊断，有可以对 SLE 的活动性进行有效的判断，同时，还可以作为疗效的评价[3]。针对有抗 Sm名称的由来，是取决于首例患者（Smith）名字的前两位字母，其属于SLE的标记性抗体，SLE的活动可能与抗Sm抗体的滴度有着直接的关联性，SLE的复发的主要表现之一就是抗Sm抗体滴度的升高。在经治疗后SLE的回顾性诊断中以及早期、不典型的SLE诊断中，抗Sm抗体起到了很大的帮助性。
1.1.2在医学研究中，我们将由B 细胞产生的抗核小体分子的自身抗体称之为抗核小体抗体（AnuA）。诸多医学研究者们对抗 AnuA 抗体开展研究中发现，在 SLE 诊断中，抗 AnuA 抗体的敏感性达到了56%，特异性高达77%，属于较高水平。在实际 SLE 临床诊断中，。抗AnuA 抗体诊断的准确度高达90%。在 SLE 患者血清中，抗 dsDNA抗体与抗AnuA 抗体检出几率都比较高，这主要是由于抗核抗体谱中核小体家系中，抗 AnuA 抗体与抗 dsDNA 抗体均都包含其中，在对SLE 患者进行血清检测中，两种抗体不一定同时检测出，则主要是由于两种抗体可能会出现在疾病的不同阶段之中。
1.1.3由于自身免疫抗体有很多种，其中还包括抗 RNP 抗体、抗 SSA 以及抗 SSB 抗体等，抗 Sm 抗体与抗 RNP抗体的抗原位点具有相同点，抗 Sm 抗体阳性伴随抗RNP 抗体阳性。相关研究表明，抗 AnuA 抗体、抗 Sm 抗体、抗 dsDNA 抗体这三种抗体在 SLE 患者血清中同时检出的几率非常的小，因此，因此，对SLE 患者采用并实施多种自身抗体联合检测，可以有效的对单个指标阴性时的不足进行弥补，有效的提高 SLE 免疫学诊断的阳性率[6]。
1.2自身免疫性肝病（Autoimmune liver disease，AIH）
在自身免疫疾病中，由自身免疫反应所引起的，没有明确原因的肝脏疾病，被称之为自身免疫性肝病。该病主要包括了原发性胆汁性肝硬化、原发硬化性胆管炎与其重叠综合征以及自身免疫性肝炎。在对这几类肝脏疾病的临床诊疗中，起到关键性作用的就是自身抗体[7]。在自身免疫性肝炎中，抗核抗体是最为常见的一种自身抗体，抗核抗体一般情况下，主要集中出现在Ⅰ型AIH 中，通常情况下，其常会与抗平滑肌抗体同时出现。ANA一般常出现在多种结缔组织疾病中，此外，还经常出现在其他自身免疫性疾病当中，其对AIH 不具有诊断的特异性。如果在患者的血清中同时检测出了ANA和 ASMA，则预示着患有Ⅰ型AIH的可能性很大。在Ⅱ型AIH中，其特异性标志为抗肝溶质抗原Ⅰ型抗体以及抗肝肾微粒体抗体。在Ⅲ型自身免疫性肝炎中，肝胰抗原抗体以及抗可溶性肝抗原是其最特异性的指标。核周型抗中性粒细胞胞质抗体属于原发性硬化性胆管炎的常见标志[8]。原发性胆汁性肝硬化的特异性标志是高滴度的抗线粒体抗体 M2。
1.3ANCA相关性血管炎（ANCA-associated systemicvasculitis，AASV）
在自身免疫疾病中，抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）属于一种以单核以及中性粒细胞浆成分作为靶抗原的自身抗体，在临床中，ANCA 的靶抗原有十余种，其中，髓过氧化物酶（MPO）与蛋白酶 3（PR3）是与其关联性最大的两种，他们与 ANCA 相关血管炎这些疾病的肾脏表现有着直接性的关联。ANCA 与多种疾病有着密切的关联性，这些疾病主要与免疫有着一定的关联性，但是，与感染的关联性不大。在临床疾病中，多见于系统性血管炎性疾病中[9]。在系统性血管炎的诊断中，ANCA 的检测可最为其的诊断指标，并且，还可以对病情活动进行评定。在其他系统疾病中也较为常见，如：（急进性肾炎、系统性硬化症、紫癜性肾炎、SLE 等中都有表达）[10]。
1.4 类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）
在自身免疫系统疾病中，类风湿关节炎的自身抗体有很多，其中包括（抗-CCP 抗体、类风湿因子（RF）、抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体（anti-MCV、抗核周因子（APF）等）[11]。在类风湿性关节炎（RA）的诊断中，抗-CCP 抗体的检测具有较高的特异性，并且，可以被应用与对RA 的早期诊断。具相关研究表明，抗-CCP 抗体对RA诊断有50-78%的敏感性、有96%的特异性，并且，对于早期RA患者的诊断可达80%的阳性检出率。此外，通过对抗-CCP 抗体阳性于阴性RA患者相比较，通常情况下，前者比后者出现关节骨质损害更为严重[12]。相关研究表明，通常情况下，抗-CCP 抗体常与RF（类风湿因子）呈正相关，在临床中，一般建议两者联合进行检测，以此可以更准确的明确病情。在RA中，抗-MCV属于另一个高特异性、高敏感性指标，，抗-MCV抗体与抗-CCP 抗体相比较，比 CCP高约8%。在RA 患者的血清和关节液中，抗-MCV属于一种相对比较稳定的血清学标志物，可长期存在于血清和关节液中，抗-MCV抗体可作为RA的早期诊断[13]。
1.5１型糖尿病（Type 1 diabetes，T1DM）
在自身免疫性疾病系统中，１型糖尿病（T1DM）也属于自身免疫性疾病，其主要是由于胰岛功能被β细胞破坏说导致。在临床中，胰岛β细胞的自身抗体在T1DM患者无症状期间或者是发病后的一定时间中被检测出谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）、胰岛素自身抗体（IAA）、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA2A）[14]。在医学临床调查中，对近5年内发展成为糖尿病的患者进行首次筛查中，就有94%的患者血液中检测出至少一种自身抗体。如果糖尿病患者血清中ICA呈现阳性，有次可以表明，机体中存在着有针对胰岛细胞的自身免疫反应，出现血清中ICA呈现阳性这种情况，会引发患者胰腺β细胞的自身免疫损害，最终发展成为糖尿病，并且，大多数都是属于胰岛素依赖型糖尿病（IDDM），在糖尿病检测中，可以将其作为高危指标。对糖尿病疗效的有效监测，可以通过测定血清中抗胰岛素抗体的含量来评估。在１型糖尿病中，抗-GAD是属于该病的一个自然病程，其中，最为重要的诊断指标就是 β 细胞功能损伤，在很大的程度上可以帮助被确定的糖尿病进行分型、指导治疗。在糖尿病患者血清检测中，另一个该病的重要的胰岛细胞自身抗原是IA2抗体，其通过与胰岛相互结合，从而产生相关的抗体，与GAD抗体相比较，IA2抗体对于由β 细胞损坏而导致的早期发病的诊断更具有特异性，这主要是由于其是属于胰岛免疫早期成分，可以对β 细胞损坏进行有效反应[15]。
1.6自身免疫性甲状腺病（Autoimmune thyroid diseases，AITD）
在自身免疫疾病中，自身免疫性甲状腺病（AITD）属于一种慢性甲状腺炎病症，其主要是由于自身免疫说引起的。患有该病的大多数患者以中年女性居多，在多数患者的血液中，都可以检测出较高滴度的甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体以及甲状腺球蛋白（TG）抗体，早期发病中，患者可会出现桥本甲亢症状，通常到了患病晚期，多数患者会发生甲减症。在临床中，AITD属于一种典型的影响甲状腺器官的特异性自身免疫性疾病。通常情况下，对桥本氏甲状腺炎进行诊断时，都是依据抗TG抗体来进行诊断，在其他相似疾病中也较为常见，如（50% Graves 病患者、20%甲状腺癌患者、20%非毒性甲状腺肿患者等）。在对甲状腺高危人群进行确诊中，抗甲状腺抗体阳性就是该发病机制的主要风险因子，同时，其还可以有效的帮助产后产妇进行评价患产后甲状腺炎的风险。在临床中，甲状腺功能低下、甲状腺功能衰竭的主要预测指标是抗TPO抗体[16]。相关研究表明，一些妇女机体内甲状腺素（TSH）水平属于正常水平，但是，其的甲状腺素（TSH）水平呈现阳性，这种状况下，有2.1%会发展为临床甲状腺功能低下，此外，在孕妇患产后甲状腺炎的诊断与评估中，抗TPO抗体阳性是诊断该病的重要预示指标与危险因素[17]。
2.自身抗体的实验室检测技术
2.1自身抗体检测方法
在临床研究中，自身抗体由于成分较为复杂，因此，检测其的方法多样化，伴随着医学技术的不断发展与创新，越来越多的自身抗体检测方法逐渐应用于临床中。本文就针对以下几种进行简单的论述：
2.1.1间接免疫荧光法（IFA）
由于IFA法具有较高的特异性与敏感性，并且操作简单，价格低廉在自身免疫病的诊断中被广泛的应用。IFA法的基本原理主要是，将常用的组织培养细胞（Hep－2细胞）或者是冷冻的啮齿类动物肝脏切片作为反应基质，将患者的血清滴加到基质片上，如果自身抗体存在于血清中，就可以与细胞中的核抗原进行相互的结合，从而产生抗原抗体复合物。在基质片上再加入异硫氨酸突光素标记的抗人IgG（或抗人IgA或IgM），最终形成了一种抗人Ig复合物即（核抗原－患者血清中的抗核抗体－荧光素标记），从而对不同的荧光模型在荧光显微镜下进行有效的观察。不同的自身免疫病通过不同的荧光模型进行一一的反映，对诊断疾病有重要价值。
2.1.2免疫印迹法（IBT）
对抗体特异性进行临床研究过程中，免疫印迹法为其提供了极为有效的方法。通过运用电泳的方法，将蛋白质分离成纯化的抗原，然后将其移至一种膜上，通过将自身免疫性血清当作探针，然后将与分离出的纯化抗原进行融合，促使他们结合反应，通过运用酶联免疫球蛋白抗体和底物显色反应，将结合的抗体检测出来[25]。
2.1.3酶免疫条带法（Line Blot Immunoassay）
酶免疫条带法属于在免疫印迹的基础进行进一步改良的方法，在自身抗体可提取核抗原的测定中，被广泛的应用其中。酶免疫条带法与免疫印迹法相比较，就不会产生非特异性反应，这是由于在固定的位置上，将经亲和层析纯化的抗原进行包被，每一种抗体与之相对应的只有一条条带，由此就避免了非特异性反应条带的产生，此种方法对抗原的分析越来越精细化，已成为了具有代表性的方法。
2.1.4酶联免疫吸附法（ELISA）
在自身抗体的检测与特异性确定中，ELISA法属于一种敏感性高且快速的检测方法。在酶标反应板上，通过用酶标反应板进行包被，然后在通过将待测血清加入酶标反应板中，进行孵育，此时，与抗原结合的抗体，可以通过运用使用酶标的抗人免疫球蛋白抗体对其进行检测，最后，在运用合适的酶底物进行显色。
2.1.5电化学发光法（CLIA）
简单来讲，CLIA法的工作原理主要是，通过充分的利用化学反应释放的自由能，来将中间体进行有效的激发，从而促使其由激发态转换回基态，将等能级光子进行充分的释放，将释放的光子运用化学发光免疫分析仪对其进行测定，通过测定得出的被测物含量，可以作为精确定量测定。
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2.1.6多通道免疫技术（MIA）
简单来讲，多通道免疫技术（MIA）的核心是依据荧光编码微珠来进行测定自身抗体的。从细胞核提取的抗原与这种微珠颗粒进行了有效的连接，不同的微珠均结合相应抗原，与之反应的不同自身抗体，可以通过运用荧光标记进行有效的区分，患者血清中抗体的量与荧光的强度有着直接的关联性。
2.1.7流式细胞法（Flowcytometry）
在当前对自身抗原的检测方法中，流式细胞法在医学临床中受到欢迎。Flowcytometry法主要的依据原理是，通过运用包被有自身抗原的荧光珠，系统内部抗原连结的荧光素信号强度与抗原的量相关。在临床研究中，还将这种基于荧光珠的流式细胞术称之为放射ANA（Reflex ANA）。
2.1.8微阵列技术
在自身抗体的实验室检测中，微阵列技术可以对大量蛋白、核酸、大分子复合物等同时进行分析，凭借这种优势，在临床研究中，成为了有力监测工具，改方法中的样本范围较广泛，如：血清、脑脊液、滑膜液等体液中。在同一基片表面，将抗原按固定位置点包被，然后将其与血清中的抗体进行结合，发生特异性结合后，让后采取相应的方法进行检测，如：化学发光法、荧光或放射标记法、电化学方法等。通过充分的利用标准曲线，来对自身抗体的定量进行测定。
2.2自身抗体的检测方法的选择
在我国，当前 IIF、ELISA、IBT等检测方法被较为普遍的运用着，在自身抗体的实验室检测中，IIF方法是属于最为经典的筛查试验方法，此种方法通过运用不同的抗体稀释倍数，来对半定量进行检测，此外，，IIF方法是新抗原/抗体的发现的最为基本的方法。对于IIF方法而言，为了可以获取更加准确的结果判读，其对于实验者的技术要求较高，这主要是由于该实验方法很难实现实验的标准化与自动化。针对于特异性抗体的鉴定，通常情况下，主要是采用IBT 及 ELISA 方法来进行。通常情况下，有多种抗原包被在IBT 所使用的硝酸纤维膜上，可以依照临床诊断与检测的需求，可以开发出所需的组合，但是，IBT 与ELISA方法相比较，在敏感性上比较差，并且，IBT方法只能进行半定量检测。ELISA 方法在国外应用较为普遍，其不但可以被应用于特异性自身抗体的鉴定中，在自身抗体筛查中，也可以应用这种方法。对于可疑的阳性标本，采用此种方法监测后，最好进一步采用其他方法进行确证，这主要是因为相关研究指出，该法假阳性率较高。但是改方法凭借着价格低廉、高敏感性、可定量检测而易于标准化，在自身抗体的实验室检测中，应用前景较好。对于ID、CIE方法而言，在我国这两种方法的运用较少，但是，在国外，应用较广。虽然RIA方法具有较高的灵敏度，也可以进行可定量检测，但是，由于其会产生放射性污染，几乎已经被临床实验室所淘汰。在自身抗体定量检测中，CLIA方法凭借着高灵敏度、检测迅速，可以进行自动化操作，成为了较为理想的方法，但是，在临床检测中，当前只有少数抗体有商品化试剂。MIA方法，其可以同时对多种抗体进行定量检测，同时，其还具备高效性、准确性等优势，但是，该研究方法在价格上较为昂贵，一般在国外，常被实验室应用于临床检测。针对于微阵列基因技术以及流式细胞术来讲，他们均都具有较高的敏感性和特异性，但是，流式细胞术每次分析只能提供一个结果。当前，对微阵列技术的演技的研究关注度较高，其可以同时对多种参数进行分析，样本类型也较为广泛，但是，其也具有一些不足之处，其存在着重复性不好、稳定性不高、研究费用昂贵等问题，此种方法当前仅仅用于科研领域[26]。
在对自身抗体的检测方法进行选择的时候，必须要充分的对多方面的因素进行综合性考虑，例如：实验的目的、实验室的条件、对实验成本、时间、技术、方法的要求等。以上几种方法，都具有各自的特点与优势，在对自身抗体的测定方法进行选择时，临床实验室必须要结合自身实际的情况，合理的选择适合自己的临床需求的最好方法。
2.3自身抗体实验室检测的质量控制问题
在国外的临床检测中，对自身抗体实验室检测已经广泛的开展，并且，已经高达百余种常规检测项目。相比较而言，在我国，对常规监测项目的研究却很少，检测质量参差不齐，普及性较差。当前，在我国的自身抗体检测中，由于受到试剂质量、器材设备、人员经验、监测技术、程序等诸多因素的影响，从而出现了较高的假阳性率和假阴性率，造成检测结果一致性差，质量没有保障。临床诊疗活动与检测质量有着较强的关联性，加强对检测质量的有效控制，可以有效的提高检测质量，保障检测结果的准确性。针对以上问题，可以通过三个方面来开展有效的质量控制。①对实验室管理水平以及自身质量的有效控制与提升。例如：对实验室研究人员的定期培训、学习、进修，对实验室操作流程标准化的制定，对实验方法的科学、合理选择，对实验室仪器设别的定期维护与更新等。②相关部门可以通过制定标准化操作指南，来进一步的规范和统一自身抗体检测的检测程序、操作步骤、稀释方法等。③实验室与各试剂提供商需要较强有效的沟通，不断的提高试剂质量，对自动化检测体系的研发，要加大研发力度，从而更好的保障其的标准化和质量管理。
2.4自身抗体的结果解读
临床诊疗活动的开展与自身抗体结果的正确解读存在着直接的关联性，在实际的临床中，对自身抗体结果的正确解读需要注意一下几点要求：①AID 患者血清自身抗体具有一定的多样性与复杂性，解读者必须要清楚的认识到这一点，在某种AID 中，或许涉及的自身抗体多达数种，而针对于某种自身抗体来讲，可能会存在于多种AID 患者血清中。所以，解读人员在对检测的结果进行解读时，在对自身抗体对 AID 的诊断特异性进行充分考虑的同时，还需要对疾病广泛性加以关注。②对各种自身抗体检测方法的局限性要进行充分的了解与掌握，通过运用不同的方法所检测出来的结果，它们之间或许存在着一定的矛盾性，对假阳性和假阴性结果的有效识别，必须要密切的结合实际的临床进行解读，在必要时，可以采取不同原理的多种方法来对结果的解读进行相互佐证。③对自身抗体在人群中的分布特点进行充分的了解与认识，在正常人群中，自身抗体也是存在的，而且，自身抗体阳性率和滴度水平在同性别和年龄段中存在着一定的差异性，所以，在对检测报告进行解读时，对受检者的性别、年龄、滴度水平以及自身抗体的参考范围都必须要进行充分的考虑，才能确保解读结果的准确性。④对自身抗体可早于临床症状出现的特性进行着重的关注。某些自身抗体没有临床相关性，但是，却具备了较高的预测价值和特异性，在这种状况下，检出时，一定要对其做出必要的解释。
3.总结
综上所述，伴随着 AID 发病率的逐年上升，AID 和自身抗体被越来越多的人所认识，在生理条件下，自身抗体在免疫调节功能中发挥着重要的作用，其在AID 中，可以对人体机制中的各组织、细胞、器官等造成损伤。在AID 诊疗过程中，自身抗体的重要作用越发凸显，在对 AID 的早期诊断中，临床意义以价值重大。目前我国国内对自身抗体实验室检测的开展还存在着诸多的问题，结果质量与技术还需进一步的进行提升，各方面还需进行改善，对自身抗体实验室检测方法进行更深化的探索与研究，是今后要解决的重要问题。
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论文作者:马巧蓉
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年1月第1期
论文发表时间:2018/5/17
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