“基因工程的基本操作程序”的教学组织，本文主要内容关键词为：基因工程论文,操作论文,组织论文,程序论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
现代生物科技揭示了一些新的原理、原则和规律，逐步建立了一系列新概念。笔者在听课过程中发现，对于“现代生物科技专题”的教学，存在2种教学倾向：一种是照本宣科，缺乏对教材内容再创造、再加工和再组织；另一种则是一味追求事实性知识的深和透，陷入了繁琐的技术细节而忽视基本概念的传递和重要概念的构建。高中阶段的教学不是培养学科专家，而是要全面提高学生的科学素养。如果学生对基本概念（不论是科学的还是技术的）没有深入理解和把握，将会影响他们进一步的学习和发展[1]。因此，教学的着力点应放在对学生发展起根本作用的知识、能力和思想情感上，那些基本的生物科学技术概念是知识、能力和思想情感的凝结，是构建重要概念的基础，理应成为教学的重心。本文以“基因工程的基本操作程序”为教学案例，主要探讨“如何重组教学内容，凸显基本概念传递”的教学策略。
一、教学内容分析
基因工程操作的“四部曲”依次涉及基因克隆、重组DNA、转化、分子杂交等基本概念。每一个基本概念都蕴含着科学家深厚的知识储备、独特的思维视角和一定的价值取向。其中，价值不仅为思维指明了方向，而且还提供了激情和能量，使思维更加敏锐。人们正是按照自己的愿望，定向改造生物性状和获得所需要的生物产品，才催生了体外DNA重组技术和转基因技术；为了实现基因的分离和克隆，设法建立基因文库；为了让目的基因导入受体细胞并在其中稳定存在、复制和表达，需要在体外构建表达载体；为了提高转化率，需要根据不同的受体细胞选择适宜的转化方法；“插入失活法”的发明和运用，是为了筛选和鉴定吸纳重组DNA的受体细胞；以基因探针为工具，进行DNA/DNA或DNA/RNA之间的分子杂交，以及以相应的抗体为“探针”进行抗原—抗体之间的杂交，都是基于基因、mRNA、蛋白质分子特异性的技术创新，这种技术创新源于检测和鉴定目的基因在受体细胞中是否可以稳定维持和表达的需求。在教学设计中，教师应该充分挖掘蕴含于每一个基本概念的知识、方法和价值，使之成为一个有机整体传递给学生，让学生在此基础上主动构建“基于中心法则之上的，定向、安全、理性地改造生物”的重要概念。这样，学生的学习重心就能从记忆事实转移到对可迁移的重要概念和更为根本的知识结构的深层理解，以培养和发展其思维能力。
二、教学目标设定
基于上述对本节基本概念的剖析。制定三维目标如下：
（1）知识目标：说出获取目的基因各种途径的前提、方法和适用范围；阐述构建表达载体的必要性和基本要求；解释“转化”的含义，说出常用的遗传转化的方法；说明分子杂交技术的原理和工具。
（2）能力目标：运用基因工程的基本工具和稀释涂布平板法，设想建立基因组文库的过程；正确选取组织细胞以提取mRNA，设想合成cDNA的过程和条件；根据基因表达的过程，利用恰当的工具酶，构建表达载体；根据受体细胞的不同选择恰当的转化方法，并运用“插入失活法”筛选含有目的基因的受体细胞；运用分子杂交技术对目的基因进行鉴定和检测。
（3）情感目标：体验分子克隆分离和纯化目的基因的基本思想；通过学习PCR技术扩增目的基因和利用分子杂交技术检测目的基因，领悟科学与技术之间的关系。
三、教学设计思路
人教版教材对该部分内容的呈现特点是：图文并茂、简约形象，以图片类比的方式说明基因组文库与cDNA文库的不同。这种内容呈现方式固然通俗易懂，可读性强，但教学如果仅止于此，学生对2种文库的建立目的、建立过程和应用范围还是不清楚，这样的知识仍然是“死的知识”，自然不会转化为能力。因此，需要整理一条清晰的思维主线，贯穿获取目的基因的4条途径，通过设置系列问题，逐步诱导、层层递进，最终让学生明确每条途径的前提条件、基本过程和适用范围。笔者经过深度备课、集思广益，确定以1982年10月最先在美国上市的重组人胰岛素（Humulin）的研制过程作为教学情境，以达到教学预期。“重组人胰岛素”属于基因工程制药的应用范例，它是1978年9月由加州大学的Itakuna等人用人工合成的胰岛素基因与pBR322质粒载体构成重组体，转化大肠杆菌成功生产的。虽然当时是人工合成的胰岛素基因，但只要教师设置好问题层次，可以把获取目的基因的4条途径贯穿起来。pBR322质粒载体上面有一个复制起始位点（ori），保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞内行使复制功能；具有2种抗生素抗性基因：氨苄青霉素抗性基因（
）和四环素抗性基因（
）。其中，有7种限制酶的识别位点位于内部，有3种限制酶在内具有单一的识别位点[2]（图1）。由此可见，选用此实例的好处在于，一方面可以让学生更加直观地认识载体所具备的基本条件，另一方面便于教师设置具体问题，促使学生选择恰当的工具酶构建表达载体，加入启动子和终止子对载体加以修饰。教师还可以借此介绍转化大肠杆菌的常用方法，训练学生运用“插入失活法”鉴定和筛选含有重组DNA的大肠杆菌的分析和应用能力，以及鉴定胰岛素基因是否成功表达的实验设计能力。由此可见，“重组人胰岛素”这一教学情境的创设，不仅为学生学习抽象的基因操作过程提供了直观、生动的形象，而且能够将基因工程操作程序的“四部曲”贯穿始终，组成一个引人入胜，且符合学生认识发展特点的完整探究过程。这样，以重组人胰岛素的研制过程为主线，学习基因工程的基本操作程序，继而再扩展到转基因植物和转基因动物的培育。
四、教学过程组织
（一）获取目的基因——基因克隆
教学伊始，向学生呈现重组人胰岛素图片，并诱发系列思考。
问题1：怎样利用大肠杆菌生产人重组胰岛素？此问题能够调动学生运用基因工程的概念和基本工具等已有的知识，设想其大致过程。如果学生回答有困难，教师可以展示基因工程基本操作程序示意图，帮助他们初识操作程序的“四部曲”，并作简要板书（流程图），勾勒出大体框架，随着教学活动的推进，这幅框架将不断完善。
问题2：目的基因的成功分离是实施基因工程操作的前提。如果对目的基因及其编码的蛋白质的相关信息一概不知，那么怎样从人类基因组中分离出胰岛素基因？此问题指向基因组文库的建立，其中蕴含着基因克隆的思想。所谓基因克隆，是指用限制性内切酶将总DNA切成许多小片段，把这些片段分别插入到质粒中，这些质粒载体可以转入到细菌并随着细菌的繁殖而进行复制的过程[3]。如何帮助学生建立“基因克隆”的概念，领悟其中的思想，是教师设计问题时需要格外关注的。因为传递概念、领悟思想，不能靠教师的机械灌注，必须经过学生的积极思考、主动建构才能奏效，而学生的思维方向需要教师的正确引领：在提取到的总DNA中，目的基因片段含量很低，且掩埋在无数其他基因片段中。依靠基因的分子量及所带电荷等理化性质的差异，能否分离出目的基因？如何实现目的基因的扩增以增加其含量？如果先在体外将各基因片段与克隆载体重组，再导入大肠杆菌中，这样就可以实现各基因片段在受体细胞中扩增。采用什么接种技术可使大肠杆菌分开并形成单一菌落，从而使受体菌所吸纳和扩增的基因分开？学生自然想到稀释涂布平板法。这样所涂布的若干个平板上生长的一个个菌落，均含有一种人类基因，就好比文献资料储存在图书馆一样，称为基因组文库。如此诱导，学生最终会领悟到：基因组文库的建立，是为了实现基因的分离和克隆。
问题3：将从基因组文库中调取的胰岛素基因导入大肠杆菌中能否表达？为什么？向学生提供原核细胞和真核细胞基因表达过程的比较图片，帮助他们寻找分析问题的突破口：原核细胞中没有剪切内含子的酶。
问题4：能否根据mRNA合成没有内含子的胰岛素基因？如果能，需要具备哪些条件？向学生提供真核细胞基因转录过程的相关图片，联系逆转录的过程，促使他们独立思考，分析过程、寻找条件。
问题5：从什么细胞中才能提取到胰岛素的mRNA？通过逆转录所生成的cDNA都是胰岛素基因吗？如果还有其他基因，怎样将胰岛素基因与其他基因分离并克隆？细胞分化的原因在于组织特异性基因的选择性表达，但那些维持细胞基本生命活动的基因同样会在分化细胞中表达。因此，该问题能够有效地调动学生运用细胞分化的原因进行分析，并借鉴建立基因组文库的方法建立cDNA文库。运用旧知识，解决新问题，就是能力的培养过程，同时也揭示了知识之间的内在联系。
问题6：为了完成体外重组DNA，需要获取大量的目的基因。那么，怎样快速扩增胰岛素基因（cDNA）？此问题指向PCR技术，由于学生已学过《选修1》，对PCR的原理和过程并不陌生，需要引导学生深入思考的是：如何合成特异性引物对？如果能够合成特异性的引物对，能否直接对所提取的总DNA进行PCR扩增和分离目的基因？
问题7：能否根据氨基酸序列推测胰岛素基因的碱基序列？学生的疑问在于：一个氨基酸往往有多个密码子，因而不能准确确定基因的碱基序列。这需要教师的及时指导：在简并密码子中，不同生物往往偏向于使用其中的一种，即密码子具有偏倚性。
教学实践表明：上述系列问题环环相扣，驱动学生思维活动逐步深入，最终建立起获取目的基因各种途径之间的关系。
（二）构建表达载体——重组DNA
已制备的目的基因，如果没有合适载体的协助，是很难进入受体细胞的，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，这就是为什么要体外重组DNA分子的原因，因而也应该成为组织教学的起点。
问题1：能否直接将胰岛素基因（cDNA或人工合成的基因）导入大肠杆菌中？若不能，应如何导入，并让其在大肠杆菌中进行复制和表达？
问题2：观察图1，pBR322质粒具备载体的基本条件吗？构建重组质粒需用哪些工具酶？用BamH I对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶后，得到的都是重组质粒吗？
问题3：载体和目的基因自身环化的原因是什么？尝试提出一种避免自身环化的措施。
设置问题1，旨在让学生明确构建表达载体的必要性和基本要求：无论是克隆载体还是表达载体，都应该具备3个基本元件：复制原点、标记基因、多克隆位点；表达载体除了上述3个基本元件外，还需要插入启动子、终止子等表达元件。问题2则能够激发学生的发散思维，使其认识到用同一种限制酶切割目的基因，其优势在于产生相同的黏性末端，便于形成重组DNA分子，而缺陷是易发生自身环化和不同分子间的串联。一旦学生找到了发生自身环化的原因，就可以提出解决问题的策略和方法，如“双酶切”策略，以实现目的基因的定向连接。
（三）将目的基因导入受体细胞——转化
虽然体外构建表达载体，解决了目的基因的导入、复制和表达问题，但是为了提高转化率，需要先用
处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，再将体外重组混合物分子（包含着重组质粒、质粒自身环化物、目的基因自身环化物等）溶于缓冲液中与感受态细胞混合，完成转化过程。转化原本是一种自然现象，如S型细菌的DNA片段（控制荚膜的基因）进入R型细菌内，使之转化为S型。分子生物学家正是借鉴了发生在自然界中的转化方法，完成了目的基因的导入，如感受态细胞的制备；运用农杆菌转化植物细胞等。教学时，可以先联系肺炎双球菌转化实验，让学生明确：转化是指外源基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。然后，借助下页图2，引发学生思考。
问题1：应将体外重组反应混合物转化给哪种类型的大肠杆菌（
）？
问题2：将Amp琼脂平板上的菌落原位影印在Tet平板上生长，对比这2个平板上的菌落生长情况，如何挑出含有重组质粒的菌落？
正确选择实验材料，是达到实验目的的前提和保证，也是科学探究能力的重要体现。问题1旨在让学生能够根据2种抗生素抗性基因，选出适宜的受体细胞，学生只有选择Amps Tets菌株，才算是真正理解标记基因的鉴别和筛选作用，因此这一问题还具有诊断功能。问题2则能够有效地训练学生思维的缜密性和连贯性，从中领悟“插入失活法”的原理和巧妙之处。
（四）目的基因的检测和鉴定——分子杂交
挑选出含有重组质粒的菌落后，接种到液体培养基中扩大培养，如何检测和鉴定胰岛素基因是否成功表达？多数学生设计的方案可行性较强，先提取大肠杆菌的表达产物，然后注射实验小鼠，对照组注射等量的生理盐水，观察小鼠是否出现低血糖症状等。需要向学生说明：这只是在个体生物学水平上进行的鉴定。虽然通过表达载体上的标记基因筛选出转化子，但是目的基因能否在受体细胞中稳定维持和表达其遗传特性，还需要从分子水平上进行检测和鉴定，从而引入“分子杂交”概念。
问题1：如何根据基因的特异性，设法直接检测目的基因是否存在于受体细胞中？从转基因生物中提取的DNA应如何处理才能与基因探针发生分子杂交？
问题2：根据基因与mRNA之间的关系，设想利用基因探针检测目的基因成功转录成mRNA的方法。
问题3：尝试利用抗原—抗体特异性结合的原理，设想以抗体为“探针”检测目的基因成功翻译成蛋白质的大体过程。
上述问题能够调动学生运用基因表达、DNA的变性与复性，以及基因、RNA、蛋白质分子的特异性等基础知识，思考分子杂交理论基础和基本工具，深化对“中心法则”这一重要概念的理解，并从中领悟科学与技术之间的关系。最后，通过简明的板书设计，让学生理清知识的层次。
