胡强[1]2001年在《骨髓基质细胞体外培养成骨能力的研究及用组织工程方法构建复合人工骨的初步研究》文中研究指明骨组织工程的核心问题是种子细胞和支架材料两方面。本实验采用兔骨髓基质细胞经地塞米松、TGF-β，rhBMP-2等生物活性因子诱导后，体外培养观察其成骨特性，并将骨髓基质细胞体外诱导后形成骨髓基质成骨细胞与生物可降解材料相复合，复合材料移植于无免疫动物体内培养，观察其在体内成骨能力。同时对采用组织工程方法体外构筑组织工程化骨进行了初步的探索与研究。 第一部分：兔骨髓基质细胞的分离、体外培养及使用地塞米松诱导后，行细胞计数、MTT检测、ALP检测，并进行统计学分析。在不同浓度地塞米松作用下，细胞数量、MTT法检测OD值和ALP检测OD值呈现一定的变化趋势。其中，在地塞米松浓度为10~(-8)时，细胞数量最多，MTT检测OD值也最大；ALP检测OD值随着地塞米松浓度的增加而增大。表明地塞米松对兔骨髓基质细胞在体外培养过程中能较好的诱导其向成骨细胞方向分化。 第二部分：观察rhBMP-2和TGF-β对兔骨髓基质细胞（MSC）在体外培养条件下对其分化和增殖的影响。取兔骨髓基质细胞体外培养，稳定传代后，采取分别单独加入rhBMP-2，TGF-β等诱导因子方法观察MSC的成长分化，采用MTT方法以及碱性磷酸酶染色的方法观察上述因子对细胞生长分化和增殖的影响。实验可以看出rhBMP-2及TGF-β对体外培养兔骨髓基质细胞的增殖和分化的作用是各不同的，rhBMP-2 第四军医大学硕士学位论文 — — 对兔骨髓基质细胞的作用主要表现为促进其分化，TGF 6的作用主要为 促进其增殖。 第叁部分：在体外培养条件下，用地塞米松诱导骨髓基质细胞形成 骨髓基质成骨细胞（MSOL作为种子细胞与支架材料聚 p羟基丁酯（PHB） 相复合，构成贴叩HB复合人工骨，移植于无兔疫动物皮下，并进行组 织切片检查、图像分析等方法，观察其成骨情况。MSO叩HB复合人工骨 在无免疫动物皮下异位成骨作用明显，兼有膜内成骨和软骨内成骨作用 的特点，以膜内成骨为主，成骨量随时间的增加而增加，且优于MSC／PHB 组。 通过上述试验可以看出，骨髓基质细胞在体外可以经过诱导形成骨 髓基质成骨细胞作为种子细胞应用于骨组织工程，其与合适的支架材料 复合后移植成骨明显，具有良好的骨组织工程应用前景。
张晓东[2]2002年在《用组织工程方法辅助钛支架修复骨缺损的实验研究》文中研究指明组织工程学是近十年发展起来的新兴学科，它是应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发具有生命的生物替代物，用来修复和重建人体组织和功能的一门新兴科学。其基本方法是，体外分离、培养种子细胞，使其适度增殖、分化，然后将其接种到具有一定形态和空间结构的叁维支架材料上，形成具有特殊形态和功能的组织和器官，以达到修复创伤和重建功能的目的。 骨缺损修复一直是临床治疗的难点问题之一，骨组织工程学的研究发展为临床骨缺损修复和功能重建提供了新的思路。本研究以免骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)作为种子细胞，研究其体外培养条件下的生物学特性，探讨了重组人骨形成蛋白—2(recombinanthuman bone morphogenetiC protein-2,rhBMP-2)、地塞米松(Dex)单独和联合作用对BMSC的增殖和分化的生物学作用；同时以珊瑚为支架材料，形成BMSC／珊瑚复合人工骨，钛网加强修复兔自体下颌骨缺损，BMSC／珊瑚复合人工骨钛板固定修复自体股骨缺损，观察骨修复情况，初步探讨了钛支架在组织工程方法修复骨缺损中的作用。 实验方法：取新西兰兔骨髓，分离BMSC，体外培养，经诱导分化为骨髓基质成骨细胞(MSO)，采用细胞形态学观察、生长曲线测定、扫描电镜(SEM)、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙染色等方法观察BMSC的生物学特性；采用ALP测定、MTT法检测、考马斯亮蓝法探讨rhBMP-2和Dex对BMSC的生物学作用；采用大体观察、SEM、组织学染色、骨磨片 窜四旱匠大学项士学位论文 等方法评价新骨形成情况。 结果：BMSC可以在体外适宜条件下培养，经诱导可向成骨细胞转化； rhBMP－2和Dex在一定条件下，可促进BMSC的增殖和向成骨细胞转化； 钛金属加强的BMSC／珊瑚复合骨在修复自体下颔骨缺损及股骨缺损的过 程中成骨作用明显，随时间延长，成骨量增加且更加成熟。 结论：BMSC取材方便、损伤小、倍增迅速、可定向分化，可以作为 骨组织工程的种子细胞：fhBMPZ和 DCX对BMSC具有促增殖和定向诱 导分化作用：钛金属加强的8＊sC／珊瑚在修复骨缺损的过程中成骨活跃， 显示出良好的应用前景。
宋克东[3]2006年在《生物反应器内成骨细胞的扩增和组织工程骨的构建》文中研究说明骨组织工程(Bone tissue engineering)概念的提出为解决由于创伤、肿瘤等各种因素引起的骨缺损等疾病提供了一种崭新的方法和思路，已成为治疗骨科疾病的新突破点。生物反应器系统既可以揭示在叁维培养环境中细胞功能的基本机制，又有提高工程化组织质量的功能。旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor，RWVB)具有剪切力低、培养的细胞之间有叁维联系的机会、极高的溶氧效率、营养物质浓度梯度低等特点，是一种非常理想的骨组织工程用叁维培养系统。 本研究使用Sprague-Dawley(SD)大鼠和新西兰兔的成骨细胞(Osteoblasts，OBs)作为骨组织工程的种子细胞，对其原代、传代培养的方法和其特异性和形态学等生物学性能进行了检测，确定所培养的细胞是成骨细胞，并通过纯化确保没有其他细胞的污染，可为后续的实验提供数量充足的骨组织工程种子细胞，也为实验的准确性和可重复性提供了保证。 在相同条件下分别在培养瓶、转瓶(Spinner flask)和RWVB中使用微载体悬浮培养法进行了SD大鼠成骨细胞扩增培养的研究。培养7天后，经倒置相差显微镜、扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)、苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin，HE)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、MTT、von-Kossa染色和茜素红染色等生物学性能检测，结果显示RWVB中扩增的细胞能最好地保持成骨细胞的各种生物学特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。且当微载体的浓度为10mg／ml、成骨细胞的接种密度为5×10~4 cells／ml时，细胞在RWVB中可以获得最佳的扩增效果，每代可以扩增十倍以上，明显高于其它培养方式。 使用FLUENT软件模拟计算了旋转壁式生物反应器内的二维流场，计算了在反应器内进行细胞扩增和工程化组织构建时培养室内的动压、总压、剪切力和流体速度的分布，具体分析了当反应器的转速和旋转方向、中空纤维膜的径向位置和直径等发生改变时膜壁面各点的受力情况和流场分布。此外，还详细分析了当反应器的转速和旋转方向以及细胞-支架材料构建物的径向位置发生改变时构建物壁面各点的受力和流场分布情况。模拟结果显示在旋转壁式生物反应器内不同位置的中空纤维膜壁面和细胞-支架材料构建物壁面各点的动压、流体速度和剪切力随着反应器的旋转而发生周期性的变化，培养物可以获得周期性的应力刺激；反应器内流体的剪切力较低。 在上述理论分析的基础上，设计了旋转壁式中空纤维膜生物反应器(Rotating wall hollow-fiber embrane bioreactor，RWHMB)，利用中空纤维膜作为成骨细胞的载体，以1×10~5 cells／ml接种密度在该反应器内对其进行大规模扩增，并在静态环境中以相同条件对照培养。每隔12 hr对细胞进行取样，培养5天后对细胞进行收获。对所扩增的细胞分别进行扫描电镜(SEM)观察、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节染色等生物学
史培良[4]2001年在《用组织工程的方法构建组织工程骨的实验研究》文中提出组织工程学是应用生命科学和工程学的原理，研究和开发具有生命的生物替代物，用来修复、改善和重建人体组织和功能损伤的一门新兴科学。其技术核心包括种子细胞、支架材料和组织构建叁大内容。 本研究以骨髓基质细胞（MSC）作为种子细胞，研究其生长规律和生物学特性；并对MSC在灌注培养条件下生物学特性进行探讨。同时以聚羟基丁酸酯（PHB）为支架材料与骨髓基质来源的成骨细胞复合，在免疫缺陷动物体内异位成骨、在有免疫动物体内修复颅骨缺损等实验，探讨MSC和PHB作为骨组织工程种子细胞和支架材料的可行性。 实验方法：取新西兰兔骨髓，分离MSC，体外培养，经诱导分化为骨髓基质成骨细胞（MSO）。采用形态学观察、生长曲线测定、细胞分裂指数、 细胞贴壁率、钙染色、扫描电镜（SMX透射电镜观察但MSX碱性磷酸酶 kLP侧定、骨钙素＊C测定，观察SEM生长规律和生物学特性；采用X 线摄片、大体观察、组织学染色等方法评价新骨形成情况。 实验结果：MSC可以在体外适宜条件下培养，经诱导分化为MSO；在 灌注培养条件下，细胞可以保持生物学性状稳定，并继续分化增殖； MSC/PHB复合物在免疫缺陷动物（裸鼠）体内异位成骨作用明显，以软骨 内成骨为主，对照组未见骨形成；MSC／PHB复合物修复兔颅骨缺损效果良 好，单纯植入PHB及空白对照组未见骨修复。 结论：MSC经体外诱导可以分化为成骨细胞，而且增殖迅速，作为骨 组织工程的种子细胞有广阔的应用前景；灌注培养系统可以用来扩增细胞， 并保持其生物学性状稳定；PHB泡沫材料有良好的生物相容性可以作为骨 组织工程支架；MSC／PHB复合物可以用来构建骨组织和修复骨缺损
顾祖超[5]2002年在《自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究》文中提出由于创伤、炎症及肿瘤等因素造成的四肢长骨节段性骨缺损在临床上非常常见，通常导致患者功能障碍、生活质量下降。大段骨缺损的修复与功能重建是骨科一大难题，也是近年的研究热点之一。目前临床所用修复大段骨缺损的主要方法包括自体带血管骨移植、同种异体骨移植和骨外固定技术等。这些方法及材料各有优缺点，总体来说，效果还不太理想。旨在体外复制组织或器官的组织工程学技术为四肢长骨节段性骨缺损的再生与修复治疗提供了新的思路和方法。 目前骨组织工程研究在种子细胞、支架材料、组织工程化骨体外构建与修复腔隙性骨缺损和临界性骨缺损(critical defect)等方面取得了显着进展。然而组织工程化骨的制备及移植修复骨缺损技术尚处于动物实验阶段，这一技术从动物实验过渡到临床应用并进行大段骨缺损修复，还有以下几个方面的重要问题需要解决：1、种子细胞的来源；2、结构与性能优化的叁维支架材料制备；3、促组织工程化骨血管化；4、组织工程骨修复大节段骨缺损的可行性。为此，我们针对以上问题，以兔尺骨干大节段骨缺损为动物模型，研究了骨组织工程种子细胞的生物学特性、支架材料性能、组织工程骨的血管化过程及修复大节段骨缺损的有效性。 首先，通过骨髓穿刺获取MSCs，并进行成骨诱导，以获取种子细胞。结果显示：1、以3×10~5个细胞/cm~2的密度接种MSCs，12-14天长满单层，传代细胞的倍增时间为33.6小时，成骨诱导细胞倍增时间为34.6小时；2、成骨诱导后10-12天细胞形成钙化结节，表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素；3、超微结构显示MSCs为幼稚细胞，成骨诱导后则表现为成熟细胞，分泌活动旺盛；4、MSCs可向成骨细胞和脂肪细胞分化。第叁军医大学博士研究生论文自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究 其次，采用熔铸颗粒沥取法制备CPP钾LLA和cPP妙LLA/Conagen两种支架材料，并进行了性能评定。结果显示:1、两种支架材料均成纤维网状结构，具有高孔隙率;2、两种支架材料的细胞相容性良好;3、CPP钾LL叼Collagen的细胞粘附能力优于CPP牌LLA;4、成骨细胞一CPP钾LLA/Coflagen复合体在体内皮下具有异位成骨能力，而成骨细胞一CPP胭LLA复合体及单纯支架材料无异位成骨能力。 最后，应用兔尺骨大节段缺损动物模型，研究了组织工程骨自体移植的体内血管化过程、组织学表现及修复骨组织的生物力学情况。结果显示:l、修复后4周缺损区为新生骨样组织充填，12周时己接近正常骨组织;2、修复组织4周时血循环相当丰富，12周血管形态接近正常皮质骨形态;3、随修复时间延长，修复组织的力学性能逐渐增强。 综上所述，我们可以得出结论:1、MSCs的增殖能力强，在诱导条件下可向成骨细胞分化，表达碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素，适合作为骨组织工程的种子细胞;2、CPP钾LL叼Collagen具有良好的生物相容性和生物降解性，具有良好的促细胞粘附能力;3、成骨细胞一CPP班LLA/Coflagen复合体自体移植修复大节段骨缺损的成骨能力肯定;4、血管化过程与复合体的孔隙度和孔径大小有关;5、修复组织具有较好的力学性能。
李春明[6]2005年在《bFGF基因修饰组织工程骨移植修复颌骨缺损及相关机制的实验研究》文中认为骨缺损畸形是颌面外科、骨科、整形外科临床常见病。颌骨缺损的修复问题一直是口腔颌面外科较难解决的问题,现常规的修复方法很多,但各有其优缺点。用组织工程方法构建种子细胞、支架材料和生长因子复合的生物活性人工骨被认为是未来进行骨缺损修复和骨再造最有效的方法之一。现在骨组织工程的种子细胞来源有:骨、骨膜、骨髓、骨外组织。这些来源的种子细胞各有优缺点。骨髓来源的骨髓基质干细胞(BMSC)作为种子细胞研究甚多,均证明该细胞具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化能力强、易于接种成活,在一定条件下可向成骨细胞转化;骨髓基质干细胞易于转染目的基因,可以作为基因治疗的靶细胞用于骨缺损的修复。所以本实验选择骨髓基质干细胞作为bFGF基因转染的种子细胞。骨组织工程支架材料研究内容主要有陶瓷类、高分子聚合物和生物衍生材料。许多实验研究表明:Bio-oss支架材料是一种天然的、无抗原的、将牛骨中的所有有机成分去除后提取的纯无机多孔骨移植材料,它的天然结构决定了其理化性质与人体骨十分相似,其生物相容性好。Bio-oss支
张永刚[7]2006年在《脱细胞牛松质骨材料的制备及其体外相容性的初步研究》文中研究表明理想的骨组织工程支架材料应具有良好的生物相容性、生物降解性、多孔性和一定的机械性能,以利于细胞的粘附、生长、增殖和分化。近年来脱细胞基质材料的制备成为生物衍生材料的研究热点。脱细胞骨细胞外基质是提供细胞粘附、增生和分化的基础,也是将生长因子固定于细胞组分上并维持叁维空间结构,允许新的组织生成的支撑物,是良好的骨组织工程支架材料。虽然,一些人对脱细胞的骨细胞外骨架进行了描述,但迄今为止还没有见到较理想的脱细胞骨细胞外基质的制备及骨细胞外基质骨陷窝计量检测的详细报道。实验进行脱细胞骨细胞外基质-脱细胞牛松质骨制备Acellular Bovince Cancellous Bone ;ABCB),去除细胞成分,并进行形态学观察,为骨组织工程的新型天然支架材料提供依据。骨髓基质细胞在体外具有容易培养扩增的特点,在特定的诱导条件下可向多方向分化。因此它具有很广泛的应用价值,但在骨组织工程方面的应用并不多。实验以兔骨髓基质细胞为种子细胞,在体外分离,培养并与脱细胞牛松质骨进行联合培养并观察,为组织工程的新型支架材料提供组织学实验依据。1.脱细胞牛松质骨材料的制备(Acellular Bovince Cancellous Bone ;ABCB)新鲜牛肱骨(石河子市屠宰场),上端松质骨,加工为15mm×10mm×3mm的骨块,根据析因设计原理用不同浓度TritonX-10O液分别与高渗和低渗液联合后对牛肱骨上端松质骨块进行适当的脱细胞处理,制成脱细胞牛松质骨(Acellular Bovince Cancellous Bone ;ABCB),再进行HE染,Massion染色及扫描电镜观察。2.骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells ,BMSCs)的分离,培养及成骨诱导新西兰大白兔,1月龄,无菌条件下,取双侧股骨及胫骨骨髓,缓缓加人到含有5ml的淋巴分离液的10ml离心管中2000转/分水平离心30分钟,用含20%新生牛血清的低糖DMEM培养基进行吹打,置于37℃,5%C02,饱和湿度条件下培养,3日后更换培养液,待原代骨髓干细胞增殖贴壁成单层后,传代培养。BMSCs在特定的条件下可定向分化为不同的间充质组织细胞。取第3代部分BMSCs ,加入矿化诱导液(含20%胎牛血清、10-8mol/L地塞米松,50μg/ml,维生素C,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的L-DMEM培养液)的DMEM培养基后培养并观察细胞形态,14天后行Von Kossa染色。3.骨髓基质细胞与脱细胞牛松质骨材料联合培养无菌条件下,收集第3代骨髓基质细胞并低糖DMEM培养基中制成3x104/ml浓度的细胞悬液,置于消毒备用的5mm×5mm×3mm的ABCB中,利用抽吸作用使细胞充分渗人ABCB孔隙中,在37℃,5%CO2饱和湿度条件下联合培养,8小时后再次加人培养液,其后隔日换液.相差显微镜下观察细胞在ABCB上生长情况,每隔4天测定培养液中蛋白质含量的测定并空白对照组与联合培养组生长曲线,联合培养12天,将
王永刚[8]2006年在《感觉神经及运动神经束构建神经化组织工程骨修复兔股骨缺损的实验研究》文中指出组织工程学是应用工程学原理和技术方法对创伤或病损的组织、器官进行修复与重建，是一种全新的治疗思路，超越了以往组织与器官修复重建的思维模式和技术手段，为组织与器官的修复重建带来了一场理论和技术方法上的革命，具有广阔的临床应用前景。创伤、感染、肿瘤等原因引起的骨缺损及骨不连是骨科临床经常遇到的问题，如何进一步提高骨缺损的治疗效果仍是引人关注的问题，临床上常用自体骨或同种异体骨移植，由于存在骨来源有限或免疫排斥反应等，使其应用受到限制，临床效果不尽如意。利用组织工程学技术解决这一问题是近十多年骨科领域研究的热点。 如何提高大块组织工程骨的成骨速度与成骨质量是当前的研究热点。再血管化是最初和最基本的环节，有决定性的影响。如果不能建立有效血循环，组织工程材料的制作只能被限制在薄、小的程度。关于组织工程骨的再血管化技术方法仍处在探索之中。已经证实，促进血管再生、加快血管化过程可以提高组织工程骨的成骨速度与成骨质量。 神经系统对于骨组织的生长发育创伤修复具有调节和营养作用。现在认为，这种作用是肽能神经通过包括神经肽在内的多种多肽类生物活性物质的多种生物效能来实现的。神经肽的作用方式很复杂，作用机理尚不完全清楚，可能是影响骨内的血管发生，控制血管舒缩，调节骨内血流量，进而影响骨代谢，对
陈立强[9]2006年在《富血小板血浆和带血管肌筋膜在组织工程骨血管化中的作用》文中研究表明【目的】 1、分离培养犬骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),体外扩增并向成骨细胞诱导分化,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性。 2、制备犬同种异体脱钙骨基质(demineralized bone matrix, DBM),研究DBM作为骨组织工程支架材料的可能性。 3、研究应用富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)、带血管肌筋膜对组织工程骨血管化的影响。 【方法】 1、从犬骨髓分离MSCs,体外培养扩增,并用含地塞米松(10mol/L),β—甘油磷酸钠(10mmol/L)和维生素C(50mg/L)的成骨诱导培养基成骨诱导培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法测定细胞生长曲线。成骨诱导细胞行改良钙钴法碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色,并应用Von Kossa法、茜素红法进行钙结节染色。 2、杂种犬的股骨行脱脂、脱钙、脱非胶原蛋白、冷冻干燥、灭菌制成DBM,与MSCs复合,分别在不同时间应用倒置显微镜、扫描电镜观察脱钙骨基质的结构及细胞在材料表面的生长情况。 3、将DBM/MSCs复合体植入12只犬背部,根据是否加入PRP和被带血管肌筋膜包裹分为4组。分别在术后4周、8周12周各处死4只犬,行大体标本、X线、组织学检查。 【结果】 1、用密度梯度法分离的MSCs,细胞纯度高,增殖能力活跃,诱导成骨分化的MSCs由梭形、叁角形变为变为方形、多角形,其ALP及钙结节染色均为阳性。犬MSCs和成骨诱导细胞的生长曲线呈典型的S形。 2、同种异体脱钙骨基质具有叁维立体网孔结构,平均孔隙自径约为254.39±88.71μm,孔隙率约70%。与MSCs复合培养后,细胞黏附其上,上架率高,生长状态良好,增殖迅速,分泌大量细胞外基质。
王建忠[10]2004年在《HuVEGF_（121）基因修饰复合材料修复兔桡骨火器性骨缺损的实验研究》文中认为骨缺损是战争中常见的损伤,可由子弹、爆炸物碎片、冲击波或爆炸直接损伤等因素所引起。由于创伤严重、易于感染等特点,如果未能得到及时修复或修复不佳,将导致骨不连、骨延迟愈合等,给病患者带来疼痛和功能丧失。针对骨缺损的治疗,目前的主要手段是采取自体骨移植,但由于供体的缺乏及重新造成的损伤而限制了其广泛运用。虽然异体或异种骨移植避免了自体骨移植的不足,但会带来肝炎等疾病的传播。同时,战争时常在短时间出现大批伤员,异体骨的来源也是一个棘手的问题。近年来,组织工程化人工骨成为很有希望的骨组织替代品。其核心成分主要包括支架材料、种子细胞和诱导信号。尽管相关的研究显示许多令人鼓舞的进展和希望,但由于火器性损伤的特殊性,损伤局部有血循环差、易感染等特点,目前的人工骨尚不能达到与自体骨移植相似的效果。为此本课题引入基因转染技术,用人血管内皮细胞生长因子121(human Vascular Endothelial Growth Factor 121, huVEGF121)基因对培养的骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cell,BMSCs)进行基因修饰,增加其合成及分泌成血管因子的水平,然后用huVEGF121基因修饰的BMSCs与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物制作的多孔支架材料结合,构建huVEGF121基因修饰复合材料,用于修复家兔桡骨火器性骨缺损,探讨火器性骨缺损治疗的替代方法及策略。本课题的研究主要包括以下叁个部分,所取得的主要结果及结论如下:第一部分 家兔桡骨火器伤性骨缺损动物模型的建立及其局部血流灌注变化1、本研究首先用53式滑膛枪发射0.25g钢珠,探讨在射击距离5米情况下,制作家兔桡骨火器性骨缺损的适当条件,为下一步探讨其损伤特点和修复策略提供基础。结果表明,当投射物初速为550～600 m/s时,双骨折发生率低,骨折粉碎范围在1.0 cm左右,经清创后骨缺损约为1.2cm,动物能长期存活,符合下一步研究的需要。2、在此基础上,我们用印度墨汁灌注的方法观察了火器性骨缺损局部骨和肌肉不同时相点的血流灌注情况,结果表明,火器性骨缺损局部的骨折端和肌肉的血流灌注都明显减少。结果提示,在研究火器性骨缺损的修复时,改善血流灌注具有重要意义。<WP=12>第二部分 携带huVEGF121基因的重组腺病毒载体构建1、用酶切法和测序法鉴定了pUC18-huVEGF121,保证了外源基因序列的正确性。2、分别构建了穿梭质粒pDC315-huVEGF121和带有报告基因的穿梭质粒pDC315-VEGF121-eGFP,分别用两种穿梭质粒与腺病毒基因组质粒共转染293细胞,获得两种重组腺病毒Ad-huVEGF121和Ad-huVEGF121-eGFP。3、采用PCR鉴定了两种重组腺病毒带有外源基因,空斑试验测定病毒液的滴度分别为1.0×1010~3.0×1011pfu/ml和3.0×1010~4.2×1011pfu/ml。4、用免疫组化法证明Ad-huVEGF121转染的3T3细胞能合成huVEGF121蛋白。荧光显微镜观察表明Ad-huVEGF121-eGFP转染的3T3细胞能合成huVEGF121-eGFP融合 蛋白。以上结果表明,我们构建的重组腺病毒载体含有目的基因,序列完整,阅读框架正确,效价高,能在真核细胞中表达,适用于基因治疗。第叁部分 huVEGF121基因修饰复合材料的构建1、用密度梯度离心法分离并培养BMSCs,用条件培养基分别诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,表明该细胞是具有多向分化潜能的干细胞2、用Ad-huVEGF121-eGFP、Ad-huVEGF121和Ad-lacZ分别转染BMSCs,研究了病毒转染对细胞增殖、诱导分化、贴壁等生物特性的影响,结果表明,3种病毒转染对BMSCs的增殖、诱导分化、贴壁等生物学特性没有影响。3、用融媒溶解、颗粒滤取法制作了孔径在250-450um的PLGA多孔支架材料,测定孔隙率为86%左右。体外生物相容性研究表明,BMSCs能和该材料粘附,电镜下观察见细胞伸展良好。体内研究表明,该支架材料肌肉包埋条件下,早期诱发轻度非特异性炎症反应,2周时明显消退,说明该材料生物相容性良好。4、用Ad-huVEGF121-eGFP转染BMSCs,再将此细胞与多孔支架材料复合后植入体内,结果表明,外源基因在体内3周时明显减弱。5、用Ad-huVEGF121-eGFP转染骨BMSCs,体外培养4周后仍可见细胞内明显的绿色荧光。6、流式细胞仪测定表明,用Ad-huVEGF121-eGFP转染BMSCs的转染效率高,达到97.5%。<WP=13>以上结果表明,BMSCs具有成骨分化等多向分化潜能,适于基因转染,与支架材料生物相容性好。我们构建的腺病毒载体对细胞的生物学特性没有明显的影响。外源基因转染BMSCs后,能在体内外表达一定的时间,适用于体内的修复研究。第四部分 huVEGF121基因修饰复合材料修复家兔桡骨火器性骨缺损的实验应用体外获取的huVEGF121基因修饰的BMSCs,结合PLGA多孔支架构建huVEGF121基因修饰的人工复合材料,通过该材料修复兔桡骨火器性骨缺损,并与修复手术制作的桡骨骨缺损进行比较,结果发现:1. 修复局部血流量和血流灌注:无论是手术骨缺损组还是火器性骨缺损组,huVEGF121基因转染都能提高局部的血流量和血流灌注,但两者具有不同的特点:在手术骨缺损组(S组,下同),转染huVEGF121基因组(SD亚组,下同)只在修复后72h和2周两个时相点局部血流量和血流灌注明显高于单纯支架材料组(SA亚组,下同)、支架材料加单纯细胞组(SB亚组,下同)以及支架材料加Ad-lacZ转染细胞组(SC亚组,下同)
参考文献：
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[2]. 用组织工程方法辅助钛支架修复骨缺损的实验研究[D]. 张晓东. 第四军医大学. 2002
[3]. 生物反应器内成骨细胞的扩增和组织工程骨的构建[D]. 宋克东. 大连理工大学. 2006
[4]. 用组织工程的方法构建组织工程骨的实验研究[D]. 史培良. 第四军医大学. 2001
[5]. 自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究[D]. 顾祖超. 第叁军医大学. 2002
[6]. bFGF基因修饰组织工程骨移植修复颌骨缺损及相关机制的实验研究[D]. 李春明. 第四军医大学. 2005
[7]. 脱细胞牛松质骨材料的制备及其体外相容性的初步研究[D]. 张永刚. 石河子大学. 2006
[8]. 感觉神经及运动神经束构建神经化组织工程骨修复兔股骨缺损的实验研究[D]. 王永刚. 第一军医大学. 2006
[9]. 富血小板血浆和带血管肌筋膜在组织工程骨血管化中的作用[D]. 陈立强. 青岛大学. 2006
[10]. HuVEGF_（121）基因修饰复合材料修复兔桡骨火器性骨缺损的实验研究[D]. 王建忠. 第叁军医大学. 2004
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