陈永对[1]2004年在《1、重组蓖麻毒素A链蛋白的表达、纯化及生物学活性的测定 2、芋螺毒素M Ⅶ A基因的融合表达及其镇痛活性的测定》文中提出蓖麻毒素(Ricin Toxin，RT)是从大戟科植物蓖麻(ricinus commnnis)的种子中提取的一种毒性蛋白，具有强烈的细胞毒性。它由A和B两条多肽链组成，其间通过二硫键相连接。A链是活性链，具有N-糖苷酶活性，可催化切断真核生物60S亚基28S rRNA中第4324位腺嘌呤与核糖分子之间的糖苷键，使其脱去一个腺嘌呤，使核糖体60S亚基失活，从而抑制蛋白质的合成。B链具有凝集素活性，其本身几乎没有毒性，主要作用就是识别和结合细胞表面末端含有半乳糖基结构的受体，并协助A链进入细胞内。蓖麻毒素具有强烈的细胞毒性，具有抗肿瘤的应用前景。但由于蓖麻毒素细胞杀伤作用本身不具有选择性，所以它除了具有抗肿瘤的活性外，对正常细胞也有杀伤作用，因而妨碍了其在临床上的应用。近年来，蓖麻毒A链可以与单克隆抗体相交联而制备免疫毒素(Immunotoxin，IT)，免疫毒素既具有强大的肿瘤杀伤作用，同时又有抗体的特异性，可以将毒素分子靶向运送到肿瘤细胞，以减少对正常细胞的损伤。目前，已有多种免疫毒素进入临床试验，尽管尚有些副反应有待解决，但其作为肿瘤治疗的方向，值得进一步的探索。蓖麻毒素A链在大肠杆菌中表达，因无糖基化修饰，克服了进入体内后被迅速降解的缺点，为进一步与单链抗体基因嵌合表达形成单链免疫毒素，对肿瘤细胞进行导向治疗研究奠定基础。 本论文旨在研究蓖麻毒素A链蛋白(RTA)及其修饰体RTA-KDEL(内质网保留信号肽)在大肠杆菌中的表达。并通过两种蛋白对不同细胞的杀伤作用的比较，为进一步制成杀伤作用更强、治疗效果更好的免疫毒素，以对肿瘤细胞进行导向治疗研究奠定基础。RTA和RTA-KDEL表达质粒的构建，由詹金彪于1998年完成。简言之，以质粒pGEM3zf(-)-RTA为模板，PCR扩增出RTA-KDEL的DNA序列，PCR产物直接亚克隆至pT7BlueT载体。克隆产物经序列测定证实后，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对亚克隆产物进行双酶切，所得目的基因浙江大学硕士学位论文陈永对与同样经EcoRI和Hindm双酶切的pKK223.3载体连接，构建重组质粒pKK223.3一Rl’A一KDEL。把重组质粒转化入大肠杆菌JM109中，挑取转化成功的单克隆菌，接种到含Amp的LB培养基中，于37℃振摇过夜。以2%比例接种入新鲜Mg培养基，培养至对数中期，加入IPTG至终浓度为1 mM，在温度为30℃的条件下诱导表达3小时。为了摸索出蛋白表达时的最佳条件，首先分别在不同的温度下(22℃、30℃、37℃)诱导表达相同的时间，以得到最适表达温度。然后在最适表达温度下，诱导表达不同的时间(l小时、3小时、5小时)，以摸索出蛋白表达的最佳时间。表达出的蛋白经超声破碎后，取其上清。上清液过Blue一sepharose 6B柱，进行一步亲和层析，得到纯化的RTA和PJ人~KDEL重组蛋白。以此两种蛋白与不同的细胞株(Hela细胞、人乳腺癌细胞MCF一7、人脐血管内皮细胞ECV-304细胞)进行共培养，采用M仃法测定它们对不同的细胞株的杀伤作用。 通过本实验，可以得到以下结论:(1)、以PCR方法，成功地构建了重组质粒pKK223.3~Rl’A~KDEL。(2)、经正TG诱导后，转化子E.cozi BLZI印KK223.3一Rl’A一KDEL)中出现了一条分子量约为31，000大小的条带，与预期的蛋白质分子量相符。而作为对照的未诱导菌液中则没有此分子量的浓带。(3)、通过对蛋白表达时的最佳条件的摸索可知，在30℃、诱导表达5小时时，细菌产生的可溶性RTA蛋白较多，而RLA~KDEL蛋白则在30℃、诱导表达3小时的条件下，可溶性较好。(4)、通过诱导表达产生的蛋白质，经过Blue一sePharose 6B一步亲和纯化，SDS一PAGE检查看出，只有一条分子量约为31 000大小的条带，表明纯化完全。(5)、以MIT法测定Rl’A和Rl’A~KDEL蛋白对不同细胞的毒性作用，结果表明Rl’A~KDEL比RTA本身对不同细胞株的杀伤作用更强。提示:加内质网保留信号肤KDEL可以改变Rl’A在细胞转运和转位途径，RTA一KDEL与单克隆抗体结合可以形成毒性更强的免疫毒素。
戴秋云[2]2016年在《芋螺毒素的毒理学和药理学研究》文中认为芋螺毒素由芋螺毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌,多数由12~40个氨基酸组成,富含二硫键。其多变的一级序列、特异二硫键配对方式和特殊修饰氨基酸与陆生动物分泌的多肽或蛋白质显着不同,作用靶点涵盖钠、钾和钙离子通道等及多种膜受体。根据芋螺毒素保守的信号肽序列及半胱氨酸框架,芋螺毒素分为A,M,O,P,S,T,I,V,Y,J,D,C和L等20多个超家族,根据药理学作用靶点,其进一步可分为α、μ、ω、κ、δ、ψ、σ、ρ、γ、加压素、惊厥剂和睡眠肽等药理家族。本文着重介绍了芋螺毒素的分类与多样性,简要总结了作用于烟碱型乙酰胆碱受体、钙、钠离子通道和N-甲基-D-天冬氨酸受体的几类芋螺毒素的毒理学和药理学研究进展。这些毒素有的毒性很高,有的已发展为药物或正在开发中,一些毒素已成为神经药理学的强大研究工具。期望该综述对从事毒素或相关神经生物学的研究者有所裨益。
马燕玲[3]2013年在《抗ω-芋螺毒素MⅦA单克隆抗体的制备与鉴定》文中指出芋螺毒素（Conotoxin，CTX）是芋螺（Conesnails）分泌的用于捕食和防御的一种具有生物活性的小分子多肽类神经毒素，一般含有10~30个氨基酸，大多富含二硫键，靶定神经系统的离子通道和受体，人和动物被叮咬后一般会出现麻痹、抽搐、惊厥甚至死亡。ω-芋螺毒素MⅦA(ω-CTXMⅦA)含有25个氨基酸残基，是特异的和可逆的N-型电压敏感性钙离子通道的阻断剂，可当做镇痛剂治疗剧烈的和慢性的疼痛。目前还没有基于单克隆抗体的ω-CTXMⅦA的免疫检测方法。本研究制备了抗ω-CTXMⅦA的单克隆抗体，为建立ω-CTXMⅦA的免疫检测方法奠定了基础，在神经系统的钙离子通道研究中也具有潜在的应用价值。在本研究中，GST-CTX融合蛋白作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠，Trx-CTX融合蛋白作为检测抗原包被酶标板，检测和筛选抗ω-CTXMⅦA的抗体。当抗血清效价较高时取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞。两次细胞融合实验的融合率分别为99.27%和100%，阳性率分别为2.52%和5.03%。用有限稀释法对筛选到的阳性孔进行克隆化，得到了6株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为9E4、7G10-D9、7G10-C7、4A12、5H10和5G2。对筛选到的6株阳性杂交瘤细胞株进行效价和稳定性检测，最后得到了一株稳定分泌ω-CTXMⅦA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即4A12。该杂交瘤细胞有102±2条染色体，分泌IgM类单克隆抗体。制备的腹水效价可达到1:128000，抗体亲和力为1.26×108L/mol，可特异性地与ω-CTXMⅦA发生结合反应。
高炳淼[4]2012年在《芋螺毒素基因重组表达研究》文中认为芋螺毒素(Conotoxins,CTX)具有序列超变、二硫键丰富、结构新颖、靶点广泛、生物毒性强等特点。它们既可以作为生物体内具有重要生理功能靶点的探针和“解码器”,又可作为海洋新药及新药的先导化合物来研究与开发。目前随着海南产芋螺资源日益濒危,尽快抢占药用海洋生物芋螺的基因资源制高点,具有非常重要的战略意义。深入研究芋螺毒素的生物合成法在海洋生物医药领域既有重要的理论价值,又具有广阔的应用前景和巨大的潜在经济效益。人工化学合成芋螺毒素成本高、毒性大、氧化折迭后的异构体产物异常复杂,难以纯化且产率很低。通过基因工程方法获得廉价重组芋螺毒素,可望解决芋螺毒素天然资源匮乏、分离纯化困难、化学合成昂贵等难题。为此我们根据芋螺毒素基因设计了多条合成引物,分别克隆到四种不同表达系统的表达载体中,探索芋螺毒素基因在四种表达系统中的表达效果,为芋螺毒素的结构和功能研究奠定基础。本研究主要包括以下几个部分：1.芋螺毒素基因GeXIVAWT在大肠杆菌中的表达根据芋螺毒素基因GeXIVAWT按照大肠杆菌密码子偏好设计了GeXIVAWT-P1/2和GeXIVAWT-P3/4两对引物,退火后形成基因GeXIVAWT-12和GeXIVAWT-34,其中基因GeXIVAWT-12引入终止密码子表达后具有完整的C末端；基因GeXIVAWT-34未引入终止密码子表达后带有His-tag便于重组蛋白的纯化。它们分别与双酶切的表达载体pET22b(+)连接,成功构建了两个表达载体pGeXIVAWT-12和pGeXIVAWT-34.将这两个表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG进行诱导表达,结果重组芋螺毒素GeXIVAWT-12/34均以包涵体的形式获得了高效表达,经超滤管纯化的rGeXIVAWT-12和亲和柱纯化的rGeXIVAWT-34进一步RP-HPLC分析并质谱鉴定发现大肠杆菌信号肽未能有效切除,其中rGeXIVAWT-34经条件优化后的最大表达量为61.6mg/L。通过稀释法进行体外复性后获得具有生物活性的重组芋螺毒素,活性实验表明重组芋螺毒素能够抑制昆虫细胞Sf9的生长,并具有剂量效应。2.芋螺毒素基因MrVIB在大肠杆菌中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计了未进行密码子优化的引物MrVIB-P1/2,退火后形成基因MrVIB-12,其未增加终止密码子表达后具有His-tag便于重组蛋白的纯化。它与酶切的表达载体pET22b(+)连接,成功构建了表达载体pMrVIB-12。将这个表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导和表达条件优化,结果重组芋螺毒素MrVIB获得了分泌表达,经亲和层析纯化和进一步RP-HPLC分析后质谱鉴定结果表明信号肽被大肠杆菌内源性的信号肽酶成功地切除,且在细胞周质中形成正确的叁个二硫键。动物实验模型表明重组芋螺毒素MrVIB比非选择性镇痛药具有很强的缓解小鼠疼痛的药理学作用。3.芋螺毒素基因MrVIB在毕赤酵母中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计了4对引物分别为MrVIB-P5/6.MrVIB-P7/8、 MrVIB-P9/10和MrVIB-P11/12,其中MrVIB-P9/10和MrVIB-P11/12两对引物按照毕赤酵母偏爱密码子进行优化。四对引物分别退火后形成基因为MrVIB-56、 MrVIB-78、MrVIB-910和MrVIB-1112,其中基因MrVIB-56和MrVIB-910未引入终止密码子表达后带有His-tag便于后期目的蛋白的纯化；基因MrVIB-78和MrVIB-1112引入终止密码子表达后具有完整的C末端。它们分别与双酶切的毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,成功地构建了四个酵母表达载体分别为αA-MrVIB-56、αA-MrVIB-78、αA-MrVIB-910和αA-MrVIB-1112。将构建好的表达载体线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后获得了高拷贝酵母重组子,并利用甲醇进行了诱导表达研究。初步探索了诱导表达的条件,结果表明选择培养基MGY/MM比BMGY/BMMY诱导表达效果好。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明带组氨酸标签的重组芋螺毒素MrVIB-56和MrVIB-910获得了表达,且优化密码子的重组芋螺毒素MrVIB-910的表达量略有提高。由此可知,芋螺毒素基因MrVIB已在毕赤酵母中获得成功表达,但表达量很低,有待于进一步的优化表达条件并进行分离纯化后质谱鉴定和生物活性研究。4.芋螺毒素基因MrVIB在昆虫细胞中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB序列,设计了两条引物MrVIB-P13/14,退火后形成基因MrVIB-1314,并引入终止密码子,表达的重组芋螺毒素可获得完整的C末端。将引物退火后获得基因,连接到载体pFastBacTMTB上,成功构建了重组载体pFastBac-MrVIB-1314.然后将这个表达载体转化DH1OBac感受态大肠杆菌,通过辅助质粒Hlper帮助将基因MrVIB整合到穿梭载体Bacmid中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-MrVIB-1314。通过脂质体介导方法将重组杆状病毒载体Bacmid-MrVIB-1314转染昆虫细胞Sf9,使杆状病毒载体在昆虫细胞内复制并表达重组芋螺毒素。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明杆状病毒Bacmid-MrVIB-1314在感染的昆虫细胞中获得了表达,具体的验证还需要进一步进行分离纯化后质谱鉴定及生物活性研究。5.芋螺毒素基因MrVIB在哺乳动物细胞中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计引物两对引物MrVIB-P17/18和MrVIB-P19/20,退火后分别形成基因MrVIB-1718和MrVIB-1920。它们分别与双酶切的表达载体pcDNATM4/Max-HisA和pcDNATM3.1/V5-HisA连接,成功地构建了两个重组表达载体pcDNA4-MrVIB-1718和pcDNA3.1-MrVIB-1920。利用脂质体介导法将这两个重组表达载体转染CHO细胞,经过抗生素G418筛选得到具有遗传稳定性的细胞CHO-1718和CHO-1920,能够稳定表达重组芋螺毒素。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明重组芋螺毒素MrVIB-1718和MrVIB-1920在CHO细胞中以分泌的方式进行表达,有利于表达后的翻译修饰,可形成天然芋螺毒素的结构与生物活性。具体的验证还需要进一步进行分离纯化后质谱鉴定及生物活性研究。综上所述,芋螺毒素基因分别在目前常用的大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞等四种表达系统中获得表达,为探索和建立高活性、低成本、安全性高的大规模生产重组芋螺毒素的外源表达系统奠定了基础。
周恒[5]2004年在《两种肽类神经毒素的分离提取与功能的初步研究》文中研究表明芋螺毒素和蛇神经毒素是两类重要的肽类神经毒素,是当前毒素研究领域的两大热点。这两种肽类毒素具有分子量小,活性强,特异性高等特点,是神经生物学和离子通道蛋白研究的理想探针,同时具备很强的镇痛活性,在戒毒、低毒无成瘾性镇痛药物和抗肿瘤活性药物开发等方面拥有广阔的应用前景。SO3是通过对中国南海线纹芋螺毒素的基因克隆并经人工多肽化学合成得到的一种具有镇痛活性的新型O型超家族ω-芋螺毒素,但是镇痛机制尚不清楚,膜片钳试验测定其作用靶位的结果也有争议。本论文希望从SO3对细胞增殖分化的影响以及神经保护作用的研究出发,利用已知的分化与神经保护的机制来推测SO3可能的镇痛机理和作用靶位,试验结果表明:⑴SO3不影响PC-12细胞的增殖,但是能够显着抑制NGF诱导的PC-12细胞的分化;⑵利用离体海马缺氧模型模拟脑缺血损伤,采用TTC组织染色法证实SO3具有神经保护作用。由于ω-芋螺毒素能特异阻断N-型电压敏感型钙离子通道,而且细胞分化、神经保护作用都与胞内外间的钙流有密切关系,推测SO3可能的作用靶位为钙离子通道。采用Threading和docking方法,用计算机模拟SO3与钙通道的结合,从理论上论证了SO3与N-型钙离子通道结合形成具有稳定结构的复合物的可能性。论文的另一部分工作通过对眼镜蛇毒进行分离纯化,获得了一个“极性很强”的组分,通过蛋白测序和分子量测定,组分确定为一个弱神经毒素,该毒素二级结构稳定,神经毒性很低。在细胞试验中,首次发现分离到的弱毒神经毒素与蛇毒其它细胞毒素组分存在协同作用,并首次提出该协同作用的作用模型。该协同作用的发现进一步丰富了关于蛇毒毒理学的知识,对毒理学的研究以及蛇毒抗肿瘤药物的开发具有重要参考意义。
夏铮[6]2005年在《1.利用噬菌体展示技术筛选Gal-α1，3-Gal结构的模拟肽 2.芋螺毒素M ⅦA的融合表达、纯化及其鉴定》文中进行了进一步梳理随着器官移植范围的扩大,器官紧缺问题日益紧迫。为了解决这一问题,异种器官的移植成为器官移植研究新的热点。在各种异种供体中,猪凭着自身器官形体、基因组成等特点成为许多研究者的首选。但是由于猪器官表面异种抗原Gal-α1,3-Gal能和人血清中的天然抗体发生结合,引发超急性排斥反应,随后激活补体的瀑布效应,导致内皮细胞死亡,使得异种器官难以在人体内存活。体内和体外的实验表明阻断人血清的天然抗体与猪器官表面抗原Gal-α1,3-Gal结合就可以防止超急性排斥反应,因此阻断人天然抗体与猪器官表面抗原Gal-α1,3-Gal结合便成为猪器官异种移植的关键。 西非单叶豆凝集素(BS-I-B4)能结合α-1,3半乳糖(Gal-α1,3-Gal),因而可以用此凝集素模拟人天然抗体来进行α-1,3半乳糖(Gal-α1,3-Gal)模拟物的筛选。通过对西非单叶豆凝集素(BS-I-B4)在XCX15噬菌体随机文库中进行生物淘金筛选后,我们得到了序列为NCVSPYWCEPLAPSARA的小肽。经验证该小肽有竞争蜜二糖(具有Gal-α1,3-Gal结构?还是Gal-α1,6-Gal?)与凝集素BS-I-B4、A型人血清结合的能力,并可以用来抑制猪红细胞与凝集素BS-I-B4、抗B型血单克隆抗体及人的A型血血清(含人抗αGal的天然抗体)的凝集;证明该小肽可以模拟Gal-α1,3-Gal的结构,可以阻止人血清和猪器官发生的超急性排斥反应。
应士波, 严小军[7]2006年在《芋螺毒素的药用价值研发进展》文中研究指明芋螺毒素是一种海洋软体动物芋螺分泌的一类用于自卫和捕食的小肽神经性毒素。芋螺毒素具有很高的药用开发价值和潜力。近年来,具有高度特异性生物活性的芋螺毒素一直广泛应用于研制特异性诊断试剂以及开发疗效特异的新药之中,并作为分子模型用于相关新药的设计。本文对近年来芋螺毒素药用开发研究的最新进展做一综述。
张燕[8]2016年在《N-型钙离子通道抑制剂ω-芋螺毒素的表达、纯化及活性研究》文中研究说明ω-芋螺毒素(Conopeptide,Conotoxin,CTX)是第一类被确定的特异性阻断电压门控钙离子通道(VGCC)的天然毒素。MⅦA作为一种ω-芋螺毒素,它能够特异性地阻断N-型电压门控的钙离子通道(NGCCs)。NGCCs在控制脊髓神经的疼痛传递中起着极其重要的作用,而MⅦA通过阻断该类离子通道Cav2.2达到镇痛效果,从而具有重要的临床意义。但是目前MⅦA在治疗镇痛时有较大的副作用,包括:眩晕、眼球震颤、嗜睡、步态异常和运动失调等,严重影响了它的广泛应用。最近研究发现,MⅦA突变体ω-2具有与MⅦA同样的镇痛效果但副作用极小,因此大量合成ω-2毒素蛋白能极大推动ω-2应用到更多研究和医药领域。目前为止,绝大多数多肽毒素包括ω-2毒素,主要通过化学方法如固相多肽合成法获得,但是该化学合成法过程复杂、耗时较长且费用昂贵。为此,为了高效经济地获得大量ω-2毒素,本文拟在大肠杆菌表达系统中发展了一种新的ω-2毒素蛋白表达法,并通过此方法获得了具有较高纯度的ω-2毒素蛋白。ω-2毒素蛋白仅含25个氨基酸残基,分子量较小,且ω-2富含二硫键,在大肠杆菌细胞质相对偏还原的环境[1]中纯化表达非常困难。为了得到可溶性的ω-2融合蛋白,我们建立了MBP-ω-2和DsbC在OrigamiB(DE3)细胞质中的共表达体系。在该表达体系中引入DsbC,其目的是促进ω-2中二硫键的正确折迭,从而得到具有生物活性的ω-2毒素蛋白。通过该体系,我们成功获得了可溶性的、空间结构折迭良好且纯度较高的ω-2毒素蛋白。最后通过电生理实验,检测到ω-2对外源表达的Cav2.2有一定的阻断效果,从而确定其生理作用。综上所述,本人硕士期间成功建立了在大肠杆菌表达体系中获得ω-芋螺毒素MⅦA突变体ω-2毒素蛋白的有效方法,该方法为高效经济地大量合成ω-2提供了保障,具有一定的经济和临床应用前景。同时,该项工作为其他类似多肽毒素的生物批量合成提供了借鉴,有效推动了生物多肽毒素在药物应用领域的研究。
王建华, 黄培堂, 黄翠芬[9]1997年在《芋螺毒素分子生物学研究进展》文中提出从海洋软体动物芋螺中分离纯化的芋螺毒素是一类具有特异生物活性的小肽神经毒素。目前芋螺毒素一方面作为神经生物学的重要分子探针正广泛应用于相关靶受体的基础研究中,另一方面则用于研制特异诊断试剂及疗效特异的新药,并作为分子模型用于新药设计。研究涉及蛋白质化学、化学、药理学、电生理及分子生物学等诸多领域。本文综述了近年芋螺毒素分子生物学研究的进展。
唐天乐[10]2010年在《芋螺毒素Ma6A与MaI126的生物法合成研究》文中指出芋螺(Conus)属腹足纲软体动物,全球约500多种。芋螺毒素(Conotoxin, Conopeptide, CTX)是从芋螺中得到的一类具有生物活性的多肽毒素。最近研究表明,每种芋螺可能含有1000-1900种芋螺毒素,即全世界大约有>500000种芋螺毒素,大大超过了以前认为有约5万种芋螺毒素的认识。芋螺毒素通常是由8-40个氨基酸残基组成,富含二硫键,化学结构新颖,生物活性强,作用靶位的选择性高,目前发现的芋螺毒素超家族主要有A-, T-, O-, M-, P-, I-和S-超家族等。它们已在神经科学研究领域和新药研制方面受到了前所未有的广泛关注,因此对芋螺毒素进行深入研究很有意义。由于天然芋螺毒素含量甚微,有关芋螺毒素的研发大多转向人工化学合成,但其毒性大、产率小、纯度低、成本很高,尤其是对于分子量较大的多肽,合成更为困难,合成的线性肽还要经过氧化折迭等繁琐的步骤才能获得具有二硫键配对正确的生物活性肽。因此,大量芋螺毒素药物宝库的开发仅靠化学合成还不能满足作为药物研究和商业化生产的要求。已知芋螺毒素在体内是由其前体基因经表达和翻译后修饰而获得的直接产物,因而通过基因体外重组表达,进行生物法合成是大量获得目的毒素肽的有效新途径。本研究探索用生物法合成2个芋螺毒素Ma6A和MaI126,以期低成本大量获得这2个毒素肽。芋螺毒素Ma6A和MaI126的基因均来自于大理石芋螺(Conus marmoreus),其中Ma6A是O-超家族基因,MaIl26是一种新型T超家族芋螺毒素基因。Ma6A成熟肽含有31个氨基酸,叁对二硫键,具有阻断钠离子通道的生物活性；MaIl26含有13个氨基酸,两对二硫键。我们选用毕赤酵母真核生物表达系统来重组生产芋螺毒素Ma6A和MaI126,期望通过毕赤酵母细胞内的翻译后修饰系统对外源芋螺毒素Ma6A和MaI126基因进行分泌表达,所得的重组芋螺毒素在酵母细胞分泌表达过程中完成氧化折迭,直接将具有天然芋螺毒素构象的重组多肽分泌到培养基中,通过进一步分离纯化,即可大量获得目的芋螺毒素肽。本研究通过设计Ma6A成熟肽的基因序列,利用酵母信号肽,与毕赤酵母表达载体pPICZαA相连,构建了分别含有纯化蛋白标签和不含纯化蛋白标签的表达载体pPICZαA-Ma6Af与pPICZαA-Ma6An。实验室已构建好的、含有MaI126基因的酵母表达载体pPICZA-MaI126,利用了芋螺毒素MaI126基因本身的信号肽。将上述构建好的各种表达载体进行线性化,并优化电转化条件,将3种表达载体分别转入毕赤酵母宿主菌中,经Zeocin抗生素筛选和PCR产物回收连接T-载体后,进行测序鉴定,选取含有完整目的基因、且拷贝数高的重组子,利用甲醇进行了诱导表达。在诱导过程中,探索和优化了诱导表达条件、以及载体与宿主菌之间的相互匹配。结果表明,最佳诱导时间为72h,最佳诱导培养基选择MM；通过比较3种不同酵母宿主菌(GS115、KM71、X-33)的诱导表达效果可知,芋螺毒素在宿主菌X-33中诱导表达效果较好,表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,在6kD左右和3.5kD左右出现了明显的Ma6A目的蛋白带,而1.4kD的MaIl26目的蛋白也通过反相疏水层析(RP-HPLC)初步得到分离；Ma6A基因与MaI126已成功在毕赤酵母中获得表达,重组多肽有待下一步分离纯化。本研究为利用生物法合成芋螺毒素提供了技术流程,可为后续的新药研发和临床上大量使用提供物质基础。
参考文献：
[1]. 1、重组蓖麻毒素A链蛋白的表达、纯化及生物学活性的测定 2、芋螺毒素M Ⅶ A基因的融合表达及其镇痛活性的测定[D]. 陈永对. 浙江大学. 2004
[2]. 芋螺毒素的毒理学和药理学研究[J]. 戴秋云. 中国药理学与毒理学杂志. 2016
[3]. 抗ω-芋螺毒素MⅦA单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 马燕玲. 福建农林大学. 2013
[4]. 芋螺毒素基因重组表达研究[D]. 高炳淼. 海南大学. 2012
[5]. 两种肽类神经毒素的分离提取与功能的初步研究[D]. 周恒. 清华大学. 2004
[6]. 1.利用噬菌体展示技术筛选Gal-α1，3-Gal结构的模拟肽 2.芋螺毒素M ⅦA的融合表达、纯化及其鉴定[D]. 夏铮. 浙江大学. 2005
[7]. 芋螺毒素的药用价值研发进展[J]. 应士波, 严小军. 天然产物研究与开发. 2006
[8]. N-型钙离子通道抑制剂ω-芋螺毒素的表达、纯化及活性研究[D]. 张燕. 华中科技大学. 2016
[9]. 芋螺毒素分子生物学研究进展[J]. 王建华, 黄培堂, 黄翠芬. 中国海洋药物. 1997
[10]. 芋螺毒素Ma6A与MaI126的生物法合成研究[D]. 唐天乐. 海南大学. 2010
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