南华大学附属第二医院 湖南衡阳 421000
摘要：目的 探究雌激素（17β-E2）调控人皮肤成纤维细胞（HSFB）增殖是否受到丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路（MAPKs）的影响。方法 原代培养HSFB，按干预因素的不同将第四代细胞分为6组：空白对照组（A组）、17β-E2组（B组）、17β-E2+ ICI-182780组（C组）、17β-E2+ PD98059组（D组）、17β-E2+ SP600125组（E组）和17β-E2 +SB203580组（F组）。同步化处理各组细胞后，以17β-E2直接刺激或经上述受体拮抗剂及激酶抑制剂预处理后再以17β-E2刺激。收集细胞，提取总RNA和总蛋白，分别利用荧光定量PCR和Western-Blot技术检测各组细胞增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA和蛋白的表达情况。结果 1.B组的PCNA mRNA表达较A组显著增强（P<0.01），但C、D组与B组相比其表达被显著抑制（P﹤0.05）；2.各组PCNA蛋白表达基本与其mRNA表达相一致。结论：雌激素β受体（ERβ）及ERK /MAPK信号通路参与雌激素调控的HSFB增殖过程。
关键词：雌激素；成纤维细胞；雌激素β受体；激酶抑制剂；增殖
HSFB是创面愈合的主要修复细胞，在其各个阶段它都起到重要作用。PCNA这种细胞周期调节蛋白，是反映细胞增殖活性的重要指标，在DNA复制中起重要作用。研究表明，HSFB增殖、迁移等生物学行为与雌激素及其受体（ER）相关，ER受体后信号通路中的激酶主要包括MAPKs、蛋白激酶A、蛋白激酶C、蛋白激酶G等，其中MAPKs这组丝/苏氨酸激酶是介导胞外增殖信号到胞内反应的重要信号转导系统[1]。目前关于皮肤组织中ER表达的报道存在争议[2-4]，而雌激素调控HSFB增殖的受体后信号转导及具体作用机制更是有待阐明。本研究拟应用ERβ受体拮抗剂ICI-182780和MAPKs激酶抑制剂PD98059、SP600125、SB203580来观察ERβ和MAPKs是否参与雌激素调控HSFB增殖过程。
1 材料与方法
1.1 主要材料
17β-E2，ICI-182780，SP600125，SB203580，PD98059，PCNA MAB一抗，GAPDH一抗
1.2 主要方法
1.2.1 分离细胞：标本来自一名行包皮环切术的健康男性，消毒后采用酶消化法进行HSFB分离及原代培养，传代后取第4代用于实验。
1.2.2 细胞分组及药物干预：将细胞按不同干预因素分为6组：空白对照组（A组）、17β-E2组（B组）、17β-E2+ ICI-182780组（C组）、17β-E2+ PD98059组（D组）、17β-E2+ SP600125组（E组）和17β-E2 +SB203580组（F组）。药物干预：A组：无血清DMEM同步化24h；B组：同步化后给予17β-E2作用浓度为10-10mol/L的条件培养基作用48h；C组：同步化后给予ICI-182780作用浓度为25μmol/l的条件培养基作用1h，再换用B组所用的条件培养基作用48h；D、E、F三组处理过程均同C组，PD98059、SP600125和SB203580在条件培养基中作用浓度分别为50μmol/l、10μmol/l及10μmol/l; 48h后收集各组细胞。
1.2.3 总RNA的提取及蛋白样品制备：提取每组冻存裂解细胞总RNA，溶于40μlDEPC中，放入2ml Eppendorf管中，加入500 ul预冷的裂解液，冰上匀浆，4℃12000r/min离心15min，取上清，共2次，Bradford法进行蛋白定量，-20℃保存。
1.2.4实时荧光定量PCR检测PCNA mRNA表达水平：GenBank上查找PCNA和GAPDH（内参）的cDNA序列，Primer5.0设计特异性引物序列，由上海生工合成。构建50ul反应体系。每组设3个平行复孔，在ABI PRISM 7300 Realtime PCR仪上进行扩增反应。反应结束后，根据荧光动力增长曲线自动分析计算出样品Ct值，采用2-△△Ct相对定量法得出各组样品PCNA mRNA的相对表达量。
1.2.5 免疫印迹Western-Blot检测PCNA蛋白表达水平：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳；（2）转膜；（3）抗体封闭；（4）化学发光显影。凝胶成像系统扫描片子并分析结果，结果以PCNA和GAPDH积分光密度值（IOD）比值表示。
1.3统计学分析 数据以均数±标准差（ ±s）表示，采用SPSS13.0对完全随机设计的计量资料进行组间单因素方差分析，方差齐时组间两两比较采用LSD 法，不齐时用Dunnett＇s T3法； P﹤0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCNA mRNA的表达量
2.1.1荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线：
注：N=3，*代表C、D两组之间无统计学差异，P〉0.05；其余各组间两两比较均有统计学差异，，P〈0.01；
由此可见，B、C、D、E、F五组PCNA蛋白表达量均高于对照组（P〈0.01），且B、E、F组均高于C、D二组（P〈0.01）。
3 讨论
目前认为HSFB是皮肤受损后的主要修复细胞．正常时其保持相对静止，皮肤受损后，其增殖活跃。研究证实了[5]创面愈合中雌激素及其受体ER调控HSFB增殖与分化的生理作用，但寻找其下游靶蛋白和靶基因，尤其是弄清信号通路所级联的反应，对深入了解其在创面愈合中扮演的角色及阐明愈合机制有着极为重要的意义。近来发现[6]，MAPKs信号通路在ER介导下参与细胞恶变和肿瘤浸润转移，可见它与ER调控关系紧密，但它是否参与雌激素及其受体ER调控HSFB增殖的信号转导目前尚不清楚。
PCNA是一种仅在增殖细胞中合成和表达的核内蛋白，在细胞周期G1和S期广泛表达。因此本研究采用荧光定量PCR和免疫印迹Western-Blot定量研究HSFB中PCNA mRNA和蛋白的表达在雌激素及其β受体拮抗剂ICI-182780和p38-MAPK、ERK-MAPK、JNK-MAPK特异性激酶抑制剂PD98059、SP600125、SB203580（据文献[7]，本研究尝试性选定了MAPKs的3条经典通路）干预后的变化，旨在探明雌激素调控HSFB增殖的具体分子机制。
本实验定量PCR结果显示，用雌激素处理后，HSFB中PCNA mRNA表达量增多，验证了雌激素能促进HSFB增殖。用ICI-182780预先干预1h以阻断ER作用，再联合雌激素共同培养HSFB，该组PCNA mRNA水平较雌激素组明显降低，但仍高于对照组。由此可知，尽管HSFB由ICI-182780干预了1h，但仍存在ER。ER的存在可能与ICI-182780的选择性作用有关，ICI-182780单独作用时，它可选择性拮抗ERβ。由此推测如果增加ICI-182780浓度或延长其干预时间，ER仍可能存在。本实验免疫印迹结果同上基本一致。故可认为雌激素β受体介导雌激素对HSFB增殖的调控。
迄今共发现人类有7组不同的MAPK信号通路，其中细胞外信号调控激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）MAPK家族、p38 MAPK家族、c-Jun氨基端激酶/应激活化蛋白激酶（C-Jun N-terminal kinase/Stress activated protein kinase，JNK/SAPK）MAPK家族及ERK5 MAPK家族是经典的MAPK信号通路。胞外信号都以MAPK三级激酶级联的形式转导。最早发现的Ras-Raf-MAPK信号转导途径是ERK1/2信号通路，主要参与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的信号转导，负责对细胞增殖、分化及迁移，尤其是肿瘤侵袭力的调节[9]。而JNK/SAPK和p38-MAPK主要调控各种应激反应、化疗药物的信号转导，一般认为是细胞凋亡途径。故本研究选定了MAPKs的上述3条经典通路作为试验性途径。
小分子化合物PD98059通过特异性抑制MEK激酶活性而阻断ERK-MAPK信号途径，且不影响p38-MAPK激酶和JNK-MAPK激酶活性；本研究分别应用PD98059、SP600125、SB203580三种激酶抑制剂预先干预HSFB 1h，再联合雌激素共同培养。定量PCR及免疫印迹结果同时显示，经PD98059干预后，PCNA mRNA及蛋白表达水平较单纯应用雌激素时下降，且表达量与ICI-182780组相当，其余两种激酶抑制剂无此效应，说明PCNA 量的变化与MEK激酶的活性变化有关，证实了ERK-MAPK信号途径参与了雌激素对HSFB增殖的调控过程。我们将在此基础上进一步研究ERK-MAPK激酶通路在雌激素调控HSFB增殖过程的具体作用环节，为阐明创面愈合的分子机制并最终提出临床治疗新思路提供一定依据。
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第一作者：左俊，湖南衡阳，南华大学附属第二医院 手足外科 邮编421000；
通讯作者：杨俊涛，南华大学附属第二医院 手足外科 邮编421000；
基金项目：广东省科技计划项目（雌激素调控创面愈合的机制研究，2013B031600263）
论文作者:左俊,杨俊涛（通讯作者） 谭文甫,朱怡,李浩
论文发表刊物:《健康世界》2016年第18期
论文发表时间:2016/10/24
标签：激酶论文; 雌激素论文; 细胞论文; 受体论文; 信号论文; 蛋白论文; 定量论文; 《健康世界》2016年第18期论文;