胡洁, 姜藻[1]2005年在《Endostatin基因转染人脐带血CD34~+造血干细胞的实验研究》文中研究指明目的检测人endostatin(血管内皮抑制素)基因转染人脐带血CD34+造血干细胞后的表达和分泌情况。方法电穿孔法将Plncxendo转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆后用NIH3T3细胞测定病毒的滴度,RTPCR法测定耐药的包装细胞中是否存在endostatin基因。取新鲜人脐带血40～80ml,用Ficoll分离出单个核细胞,再用免疫磁珠(MiniMACS)进一步分离出CD34+造血干细胞,流式细胞仪(FCM)检测CD34+造血干细胞的浓度和纯度。将病毒上清与人脐带血CD34+造血干细胞共同培养72h,应用RTPCR及Westernblot检测人endostatin的表达和分泌。结果Plncxendo质粒克隆扩增后,经酶切鉴定有endostatin基因存在。RTPCR证实,转染人endostatin基因的PA317endo、NIH3T3endo细胞中存在人endostatin特异性片段,病毒滴度为1.3×105cfu·ml-1。FCM检测,CD34+干细胞在脐血中的初始含量<5%,经MiniMACS分离纯化后纯度超过90%。从1×108的界面细胞平均可以分离获得(5～20)×105CD34+个干细胞。RTPCR证实,脐带血CD34+endo造血干细胞基因组中含有人550bpendostatin特异性片段,Westernblot分析显示人endostatin在转染细胞中获得稳定表达和分泌。结论逆转录病毒可以介导endostatin基因转导人脐带血CD34+造血干细胞并表达endostatin蛋白。
胡洁[2]2004年在《Endostatin基因导入人脐带血CD34+造血干细胞的实验研究》文中研究说明目的 将人Endostatin(血管内皮抑制素)基因导入人脐带血CD34+造血干细胞后分析其表达和分泌情况。方法 利用逆转录病毒plncx做载体,将plncx-endostatin重组质粒转化DH5α大肠杆菌,用氨苄青霉素(AMP)进行筛选,小剂量培养扩增,用碱裂解法回收后,用HindIII和ClaI双酶切鉴定。用电击穿孔法(electroporation)将重组质粒plncx-Endostatin转导包装细胞PA317,用G418进行筛选获得转导成功的PA317细胞并进行培养,提取病毒上清并用NIH3T3检测浓度。取新鲜人脐带血40～80ml用Ficoll分离出单个核细胞,再用免疫磁珠(MiniMACS)进一步分离出CD34+造血干细胞。将病毒上清与人脐带血CD34+造血干细胞共培养72小时。应用PCR及Western bolt检测人Endostatin在脐带血造血干细胞中的表达和分泌。结果 plncx-endo质粒在DH5а大肠杆菌中克隆扩增后,经酶切鉴定有endostatin基因存在。流式细胞仪(FCM)检测,CD34+干细胞在脐血中的初始含量<5%,经Mini-MACS分离纯化,纯度超过90%。从1×108的界面细胞,平均可以分离获得(5～20)×105CD34+干细胞。电穿孔介导重组基因转导人脐带血CD34+造血干细胞后,经PCR证实,转导Endostatin基因的人脐带血CD34+造血干细胞基因组中存在有550bp Endostatin人特异性片段, Westernbolt分析示人Endostatin在转导细胞中获得稳定表达和分泌。 结论 1.电穿孔可有效地介导重组基因的转染,转染效率高,安全无副作用,操作简单。2.PA317细胞能有效地为逆转录病毒提供包装蛋白,使之成为完整的病毒颗粒,并能用G418对转导的包装细胞进行筛选。3.重组逆转录病毒滴度达106以上,能有效感染靶细胞。4.经病毒上清感染后,CD34+/endo细胞能高表达endostatin基因,合成endostatin蛋白。输入CD34+/endo细胞可能是一个有效的治疗实体瘤的新方法,为肿瘤病人个体化生物治疗开创一条新思路。
冯继锋, 朱梁军, 胡洁[3]2005年在《血管内皮抑素基因转染人脐带血CD34~+造血干细胞的实验研究》文中认为目的:探讨人血管内皮抑素(内抑素)基因转染人脐带血CD34+造血干细胞的方法及检测。 方法:用逆转 录病毒载体pLNCX,将人内抑素基因导入人脐带血CD34+造血干细胞。应用PCR及Westernbolt方法检测人内抑 素基因的转染和表达。 结果:PCR证实,转染内抑素基因的人脐带血CD34+造血干细胞基因组中有550bp人内 抑素特异性片段,Westernbolt分析示人内抑素基因在转染细胞中获得稳定表达和分泌。 结论:人内抑素基因可 转染到人脐带血造血干细胞中并稳定表达。
参考文献：
[1]. Endostatin基因转染人脐带血CD34~+造血干细胞的实验研究[J]. 胡洁, 姜藻. 现代医学. 2005
[2]. Endostatin基因导入人脐带血CD34+造血干细胞的实验研究[D]. 胡洁. 东南大学. 2004
[3]. 血管内皮抑素基因转染人脐带血CD34~+造血干细胞的实验研究[J]. 冯继锋, 朱梁军, 胡洁. 医学研究生学报. 2005