胡健[1]2012年在《大菱鲆类胰岛素样生长因子和结合蛋白基因克隆及表达的研究》文中研究说明大菱鲆(Scophthalmus maximus)为我国北方沿海主要养殖品种，具有重要的经济价值。本文以人工养殖大菱鲆为研究对象，采用分子生物学相关技术方法，对IGF信号系统相关基因IGF-2，IGFBP-1，IGFBP-2在大菱鲆胚胎及仔稚鱼时期的功能进行了分析，结果如下：1.大菱鲆类胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)基因克隆与表达本实验克隆得到大菱鲆类胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）基因cDNA全长为1179bp，其中35bp-775bp为编码区，共编码247个氨基酸，氨基酸序列包括3个区域，分别为保守的N端和C端以及高度分散的L区域，并且在N端和C端存在18个半胱氨酸残基。组织表达分析表明，IGFBP-1基因在肝脏、脾、心脏、胃、肾脏、肠中均有表达，其中以肝脏和脾中的表达量最为丰富。通过RP-PCR方法检测IGFBP-1基因在大菱鲆胚胎及仔稚鱼时期的表达情况，从未受精卵开始表达，在原肠期达到最低，在之后的发育期里显着升高，并在稚鱼期达到最高值。结果表明，IGFBP-1基因在大菱鲆的早期发育过程中起着重要的生理作用。2.大菱鲆类胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)基因的克隆和表达采用RACE克隆方法得到大菱鲆类胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)基因cDNA全长1057bp，其中43bp-852bp为编码区，共编码270个氨基酸，同IGFBP-1基因类似，氨基酸序列包含3个区域，分别为保守的N端和C端以及高度分散的L区域，在N端和C端存在18个半胱氨酸残基。组织表达分析表明，IGFBP-2基因在大菱鲆成鱼各组织中分布广泛，在脑、心、肝、肾、肠中表达量较丰富，皮、脾次之，鳃和卵巢较少，胃中有微弱表达，肌肉中检测不到表达。使用RT-PCR的方法检测IGFBP-2基因在大菱鲆胚胎及仔稚鱼发育期的表达，可以发现，在未受精卵和原肠期中没有表达，从胚体期开始检测到表达，并在后面的几个时期逐渐上升，13日龄仔鱼达到最高，稚鱼略有下降，但差异不显着，表现出与IGFBP-1基因不同的生理作用。3.大菱鲆类胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因的克隆及两种类胰岛素样生长因子（IGF-1，IGF-2）基因的表达采用同样的方法克隆得到大菱鲆类胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因cDNA全长共880bp，其中166bp-823bp为编码区，共编码219个氨基酸。整个氨基酸序列包括信号肽区，高度保守的B,C,A,D区域，以及E区域，其中在B区域和A区域中包含6个半胱氨酸残基。采用RP-PCR方法检测IGF-1和IGF-2基因组织表达，发现这两种基因均有较广泛的表达模式，其中IGF-1基因除了在肠中没有检测到表达，其他组织均检测到表达，肝脏中的表达量最丰富；IGF-2基因在所有组织中均检测到表达，肌肉中的表达量较低。在胚胎仔稚鱼发育期内，IGF-1基因除了在未受精卵内表现出一个较高的水平，从原肠期开始，表达水平逐渐上升；IGF-2基因在原肠期表现出一个较高的表达量，其他各期均有表达，差异不显着。
谢曌[2]2007年在《新型猪胰岛素样生长因子-1的基因克隆及表达分析》文中认为为构建高效促动物生长基因，探索研制新型促动物生长制剂。本实验室应用重迭区基因拼接法(Gene Splice by Overlap Extension，GSOE)对胰岛素样生长因子-1基因加以改造。在其N端引入BamHI的酶切位点，C端引入BglII和EcoRI酶切位点以及终止密码子，并在酶切位点之前添加保护性碱基。去除了N端四个末端氨基酸(Gly-Pro-Glu-Thr)以及中间C区Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala部分序列，保留其活性部位。克隆PCR产物于pMD18-T载体上测序，测序结果显示，PCR产物大小为205bp，编码59个氨基酸，与目的片段大小一致。将测序正确的PCR产物构建了pGEX-4T-1-IGF-1D原核表达载体。经BamHI和EcoRI酶切及质粒PCR鉴定，证实本实验构建的新型胰岛素样生长因子基因-1已克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上，为进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。将已构建的pGEX-4T-1-IGF-1D蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用2×YTA培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，作SDS-PAGE分析表达情况。结果显示，表达蛋白分子量约为33kDa，与预期目标带大小一致。将诱导条件经过温度梯度、时间梯度以及IPTG浓度梯度的分析选择进行优化。通过优化原核诱导表达条件，发现pGEX-4T-1-IGF-1D蛋白在37℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下诱导4小时，蛋白表达效果较佳。将菌体反复冻融后超声破碎，将破碎后的上清及沉淀分别作SDS-PAGE分析，发现融合蛋白的表达产物以包涵体形式存在。将融合蛋白用GlutathioneSepharose 4B纯化后，初步分离得到目的蛋白。用MTT法通过猪淋巴母细胞刺激增殖能力来检测IGF-1D活性，显示IGF-1D具有良好的促进动物细胞生长的生物学活性，为深入开展新型IGF-1的动物体内活性研究奠定了基础。
田玉梅, 蒋霞云, 邹曙明[3]2011年在《团头鲂胰岛素样生长因子结合蛋白1的基因克隆和表达》文中指出胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1(insulin-like growth factors binding protein 1)是胰岛素样生长因子结合蛋白家族的重要成员,低氧环境中对IGF信号系统进行调控的关键因子。IGFBP-1通过与胰岛素样生长因子(IGF)结合,调控IGF信号转导通路,参与氧稳态失衡调节,调节生长、发育及机体低氧耐受等。在斑马鱼等模式生物中研究的比较多,但在养殖鱼类中的研究基本处于空白阶段。团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国特有的经济鱼类,在养殖生产中易缺氧泛塘。其生长发育与耐氧机制的研究倍受关注,因此研究IGFBP-1基因,揭示其对团头鲂生长发育与耐耐氧的作用就显得尤为迫切。本研究从团头鲂胚胎中提取总RNA,结合RT-PCR和RACE技术获得了IGFBP-1的全长cDNA序列,其全长为1155bp,开放阅读框为789bp,编码263个氨基酸,与斑马鱼相应基因的相似度为91%。通过半定量RT-PCR方法,研究了IGFBP-1基因在团头鲂胚胎发育过程中的表达情况,结果表明IGFBP-1在团头鲂胚胎发育早期低表达,后期表达量增多。
魏平[4]2001年在《胰岛素样生长因子结合蛋白-1基因克隆、表达以及功能研究》文中进行了进一步梳理胰岛素样生长因子结合蛋白-1基因克隆、表达及功能研究 胰岛素样生长因子结合蛋白－1（Insulin－like growth factor binding Protein IGFBP-1）是重要的内分泌激素之一。它的生物学作用及作用机 制仍未完全阐明。我们根据 分子生物学、生物信息学理论，采用基因重组、 酵母双杂交、细胞培养、CAM及鸡胚神经背根节培养等技术对IGFBP－1进行 了系列研究。全文共分叁个部分 一、为了获取IGFBP－1基因和蛋白，本研究采用PCR方法，从人胎肝cDNA 文库中成功钓取了IGFBP-1基因。并采用基因重组技术，构建了 IGFBP-1融合表达载体，首次利用IGFBP-1与GST基因融合表达方式， 实现了重组IGFBP-1在原核细胞中的高效表达，采用亲和层析法和凝 血酶切割分离获得纯度达85％以上的重组IGFBP-1蛋白。 二、为发现IGFBP-1可能的生物学作用及作用机制，首次采用酵母双杂交 技术对IGFBP-1进行了研究。结果发现野生型IGFBP-1具有转录激活 活性。根据生物信息学的理论和技术，分析了IGFBP-1结构和功能关 系，确定和构建了两个突变体M1、M2，结果突变体M2成功地将IGFBP-1 转录激活活性缺失。最后，利用酵母双杂交技术从人胎肝cDNA文库中 筛选出7个与IGFBP-1突变体M2相互作用蛋白。核酸序列分析及同源 检索显示 分别为肝癌细胞相关抗原-112（HCCl-112）、半脱氨酸蛋白 水解酶抑制剂、金属硫蛋白(Mt）、纤维蛋白原β链(Fg)、自主复制 序列(ARS）、血红蛋白(Hb）、结合珠蛋白(HP）。它们大部分是新发 现的可能和IGFBP-1发生相互作用的蛋白质。分析这些蛋白提示它们 可能是IGFBP-1代谢或生物学作用的部分环节或途径，也可能预示着 IGFBP－1新的生物学作用线索。如IGrBP－1与HCC－112结合可能参与 抑制癌细胞增殖，半脱氨酸蛋白水解酶抑制剂可能与IGFBP-1降解及 代谢有关，ARS在癌症、DNA复制、细胞增殖方面与IGFBP-1作用相反， Fg和IGFBP-1在血管平滑肌细胞增殖、移行方面作用刚好相反。而与 3军医进修学院博士学仁论又 中d简要 Hb、HP、Mt的结合尚无法理解。 叁、为研究IGFBPd对血管、神经生长的影响及对KF刁调节作用，采用 MTT法第一次报道了IGFBP刁对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞株 BCV304细胞增殖的影响及对兀F刁的调节作用。结果发现IGFBP习 显着抑制其生长，IGF习具有明显的促内皮细胞株ECV304增殖作用， IGFBP－l能够抑制兀F－1促生长作用。本研究还发现在体外IGF－1可 以增强IGFBP刁抑制细胞增殖作用，这与传统的IGF习中心学说不一 致，值得关注。在鸡胚神经背根节培养实验中未观察到所设IGF习、 IGFBP1等组别对神经背根节生长有影响。最后采用“M技术在体研 究了IGFl、IGFBP叫对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响。结果发现 IGF－1具有显着的促血管生长的作用，而IGFBP－1能够部分抑制这个 作用，但IGFBP－1本身对血管生长影响不明显。 结论 本文采用了一些先进技术和新方法应用于IGFBP习研究。实现了 IGFB卜1基因克隆和原核细胞高效表达，并新发现了一些与IGFBP刁 相互作用蛋白，它们可能是IGFBP1作用机制或自身代谢过程的部分 环节，为进一步研究提供了有意义的线索。研究了IGFBP叫对内皮细 胞生长、血管、神经方面的新功能。结果表明IGFBP＊是一个具有重 要生物学意义的蛋白质。
钱焜[5]2013年在《花鲈类胰岛素生长因子及结合蛋白基因的克隆与表达调控》文中提出花鲈（Lateolabrax japonicus）是我国广泛养殖的经济鱼类，本文以山东省青岛市沿海网箱养殖花鲈为对象，利用分子生物学方法研究了花鲈类胰岛素生长因子（Insulin-like growth factors）家族几个关键基因的全长cDNA克隆与表达调控。这些基础性资料丰富了花鲈IGF家族研究的空白，为揭示该家族基因表达调控及其具体生理功能奠定了分子生物学基础。1花鲈IGF-1，IGF-2基因克隆与表达分析本实验利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆得到了花鲈IGF-1和IGF-2基因cDNA全长序列，IGF-1全长876bp编码185个氨基酸，IGF-2全长798bp编码215个氨基酸。利用各种生物分析软件和生物网站对其氨基酸结构进行了分析比对，发现二者进化地位保守，前体蛋白都包含信号肽区域，B，C，A，D，E结构域，并且二者均具有与受体和结合蛋白结合的功能结构。利用荧光实时定量PCR技术对花鲈脑，垂体，心脏，鳃，胃，盲肠，肠，头肾，肾脏，肝脏，性腺（雄），脾脏，肌肉这13个组织的IGF-1和IGF-2mRNA的表达水平进行了分析。结果显示，花鲈IGF-1mRNA在肝脏转录水平最高，肠、盲肠、肌肉、脾脏表达较多，而其他组织表达量较少。花鲈IGF-2mRNA在检测的13个组织中均有表达，其中心脏表达最丰富，在脑、鳃、胃、盲肠、肠、肾脏、性腺、脾脏、肌肉中有较多的表达，垂体、头肾、肝脏表达较少。2花鲈IGFBP-1，IGFBP-2基因克隆与表达分析本实验利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆得到了花鲈IGFBP-1和IGFBP-2基因cDNA全长序列，IGFBP-1全长1779bp，编码248个氨基酸，IGFBP-2全长815bp，编码267个氨基酸。花鲈的IGFBP-1和IGFBP-2氨基酸序列同其他硬骨鱼类一样都包括C-端结构域，N-端结构域，以及多变的中央L-结构域。并且二者均存在18个保守的半胱氨酸残基以维持氨基酸二级结构的稳定，同时也都拥有N-端结构域的CGCCXXC-box和C-端结构域的CWCV-box，他们都是与IGF配体结合的重要结构。此外，IGFBP-2的C-端结构域还存在一个RGD结构，它能够与整合素相互作用，介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的粘附作用。利用荧光实时定量PCR技术对花鲈脑，垂体，心脏，鳃，胃，盲肠，肠，头肾，肾脏，肝脏，性腺（雄），脾脏，肌肉这13个组织的IGFBP-1和IGFBP-2mRNA的表达水平进行了分析。荧光实时定量PCR结果显示，花鲈IGFBP-1mRNA表达量较为广泛，在肝脏中的转录水平最高，在肌肉、脾脏有较多的表达。而花鲈IGFBP-2mRNA仅在肝脏中的表达水平最高，在肌肉中有较少的表达，其他组织表达量极低。3注射外源激素对于花鲈血清IGF-1含量及肝脏IGF-1和IGFBP-1mRNA表达的影响本实验对花鲈成鱼腹腔注射人体绒毛膜促性腺激素（Human chorionicgonadotropin， HCG）和促黄体激素释放激素（Luteinizing hormone releasinghormone-A，LHRH-A），利用放射性免疫激素测定的方法检测了花鲈血清中IGF-1在注射后48h（6h，12h，24h，48h）内的变化情况，同时还利用荧光实时定量PCR技术检测了花鲈肝脏中IGF-1和IGFBP-1mRNA的相对表达量的变化情况。结果表明，注射LHRH-A的花鲈血清中IGF-1的含量在12h内并无太大变化，24h后出现了明显的降低，且保持在较低水平。而花鲈肝脏中IGF-1mRNA的相对表达量较生理盐水组明显升高，12h后降低到与生理盐水组相当的水平，之后的实验过程一直保持稳定。肝脏中IGFBP-1mRNA的相对表达量则持续降低，但是较生理盐水组而言差异不是很显着。注射HCG的花鲈血清中IGF-1的含量在注射后12h即出现了明显的降低，24h后血清中IGF-1含量持续降低，之后一直保持在较低的水平。肝脏中IGF-1mRNA的相对表达量在注射后的24h内都保持稳定，较生理盐水组无明显差异，而在处理后的48h出现了显着地上升。肝脏中IGFBP-1mRNA的相对表达量在注射后12h显着升高，在注射后24h出现了下降，但是其相对表达量较生理盐水组要高，之后一直保持在高于生理盐水组的水平。研究结果表明，LHRH-A和HCG均可以触发花鲈生长过程，但是具体机制并不明了，可以推测LHRH-A是通过促进垂体GH的释放来间接调控IGF家族相关基因的作用，而HCG的作用机制可能与LHRH-A不同。
张佳兰[6]2007年在《奶牛泌乳性能候选基因的遗传特性研究》文中研究指明本研究分别以中国荷斯坦、澳大利亚荷斯坦、加拿大荷斯坦及陇州奶牛的395份血样为材料提取基因组DNA，运用生物信息学方法和同源序列克隆技术结合电子PCR(ePCR)，对牛的磷酸甘油酰基转移酶ζ(AGPAT6)基因的基因组DNA序列进行了克隆与序列分析。运用PCR-SSCP、PCR-RFLP以及PCR-RFLP、SSCP结合的方法对奶牛泌乳性能两个候选基因的部分基因组DNA片段进行了单核苷酸多态(SNP)检测，运用一般线性模型研究了AGPAT6基因和PRLR基因与上述4个奶牛群体泌乳性能性状的相关性，在5个方面取得了研究进展。1．牛AGPAT6基因的克隆利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了牛AGPAT6基因5′cDNA，用PCR技术克隆到牛AGPAT6基因的8个内含子序列，获得了包含外显子和内含子的AGPAT6基因的基因组DNA片段，并为GenBank数据库收录，收录号为EF432784。2．牛AGPAT6基因SNPs及其与奶牛泌乳性能性状的关系检测牛AGPAT6基因部分序列，发现了11个SNPs，并分析了这些SNPs与泌乳性能性状的关系，结果如下：(1)在第2内含子发现了1个PCR-SSCP SNP位点(281T-281C)，此PCR-SSCP(281T-281C)位点不同基因型的个体的305天产奶成年当量(305dME)、乳脂率和乳蛋白率存在显着差异(P＜0.05)：杂合型个体的305dME显着高于纯合基因型个体(P＜0.05)，BB基因型个体的乳脂率和乳蛋白率显着高于AA基因型个体(P＜0.05)。(2)在第3内含子发现了5个SNPs位点(410G-410T、489G-489T、600G-600T、649G-649A、729-729A)，其中的1个PCR-RFLP SNP(410G-410T)位点不同基因型的个体，乳脂率和乳中体细胞评分(SCS)存在显着差异(P＜0.05)；BB基因型个体的乳脂率显着高于AA基因型(P＜0.05)，BB基因型个体的SCS显着低于AA基因型(P＜0.05)。第3内含子的另一个PCR-RFLP SNP(489G-489T)位点不同基因型的个体，305dME和乳脂率存在显着差异(P＜0.05)；CC基因型的305dME显着高于DD基因型(P＜0.05)，DD基因型个体的乳脂率显着高于CC基因型(P＜0.05)。(3)在第4内含子发现了2个PCR-SSCP SNP位点(153A-153G、606A-606G)，位点组合不同基因型的个体SCS存在显着差异(P＜0.05)；在第10、11内含子发现了3个PCR-SSCP SNP(341A-341G、430C-430T、451C-451G)，位点组合不同基因型的个体305dME、乳脂率和SCS存在显着差异(P＜0.05)：在第6、7、8、9内含子均来发现PCR-RFLP多态。3．牛PRLR基因SNPs及其与奶牛泌乳性能性状的关系检测牛PRLR基因部分序列发现了11个SNPs，分析这些SNPs与泌乳性能性状的关系，结果如下：(1)在第3外显子发现了3个PCR-SSCP SNPs位点(1104A缺失、1267A-1267G、1268C-1268T)，3个SNPs位点不同基因型的个体305dME存在极显着差异(P＜0.01)；AD基因型的305dME最高。(2)在第5外显子发现了1个PCR-SSCP SNP位点(3365T-3365C)，此SNP位点不同基因型的个体泌乳性能性状差异不显着(P＞0.05)。(3)在第7外显子发现了4个PCR-SSCP SNPs位点(5533C-5533T、5650A-5650G、5651G-5651A、5652A-5652T)，4个SNPs位点不同基因型的个体305dME、乳脂率、乳蛋白率和SCS存在显着差异(P＜0.05)：AA基因型个体的305dME最低，但乳脂率和乳蛋白率最高，AC基因型个体的SCS显着高于其他基因型个体。(4)在第8内含子发现了1个PCR-RFLP SNP位点(7740A-7740G)，该位点不同基因型的个体305dME存在显着差异(P＜0.05)、乳蛋白率存在极显着的差异(P＜0.01)：AA基因型个体的305dME较高、BB基因型个体的蛋白率极显着高于其他基因型个体。(5)在第10外显子发现的SNPs存在群体间差异。在澳大利亚荷斯坦牛群体发现1个PCR-SSCP SNP位点(9742A-9742G)，在加拿大荷斯坦个群体发现2个PCR-SSCP SNPs位点(9681C-9681T、9902G-9902C)，在陇州奶牛群体中发现3个PCR-SSCP SNP位点(9681C-9681T、9757G一9757T、9939G插入)，在中国荷斯坦群体发现3个PCR-SSCP SNP位点(9681C-9681T、9742A-9742G、9902G-9902C)，5个SNPs位点不同基因型的个体305dME存在极显着差异(P＜0.01)，乳脂率、乳中干物质含量和SCS存在显着差异(P＜0.05)：DD基因型个体的305dME极显着的高于其他基因型，EE基因型个体的乳脂率显着高于CC、DD基因型个体，CC基因型个体的SCS显着高于BB基因型个体。4．基因型的组合效应对奶牛泌乳性能的影响组合AGPAT6基因第2内含子和第3内含子的SNPs位点不同基因型分析其与奶牛泌乳性能的关系，结果表明：AGPAT6基因第2内含子和第3内含子的SNPs位点间存在互作效应，其组合效应值均高于第2内含子和第3内含子SNPs的单标记效应值：组合1(A1A1A2A2C2C2基因型)个体的305dME和乳脂率高于其他组合。因此，可初步确定SNPs组合位点(281T、410G、489G)为影响牛乳品质的最佳SNPs组合基因型。组合PRLR基因第3外显子、第7外显子、第8内含子和第10外显子的SNPs位点不同基因型分析其与奶牛泌乳性能的关系，结果表明：PRLR基因第3、7、10外显子和第8内含子的SNPs位点存在互作效应，其305dME组合效应值均高于第3、7、10外显子和第8内含子SNPs的单标记效应值：组合4(A1A1B3B3A5B5E4E4)个体的305dME高于其他组合，可初步确定组合4(A1A1B3B3A5B5E4E4)为影响牛产奶量的最佳组合基因型。5．AGPAT6、PRLR基因多态与中国荷斯坦奶牛群体泌乳性能的关系在中国荷斯坦牛品种内，分析了AGPAT6和PRLR基因上17个SNPs位点不同基因型与奶牛泌乳性能不同性状的关系，结果显示：PRLR基因第3外显子3个SNPs位点不同基因型个体的初次配种日龄存在显着差异(P＜0.05)、初次产犊日龄存在极显着差异(P＜0.01)，BB基因型个体的初次配种日龄显着地高于其他基因型个体，初次产犊日龄存在极显着地高于其他基因型个体。第5外显子的SNP位点不同基因型个体的乳脂率和乳蛋白率存在显着差异(P＜0.05)，AA基因型个体的乳脂率和乳蛋白率显着地高于BB基因型个体。第7外显子4个SNPs化点不同基因型的个体305dME和初次产犊日龄存在显着差异(P＜0.05)；BB基因型个体的305dME最高，AA基因型个体的初次产犊日龄最高。第10外显子的5个SNPs位点不同基因型个体的乳脂率存在显着差异(P＜0.05)；DD基因型个体的乳脂率和乳干物质含量显着低于FF基因型个体(P＜0.05)。
李景[7]2007年在《香猪生长相关基因的结构与表达》文中研究表明哺乳动物的生长主要受生长激素、胰岛素样生长因子Ⅰ的调控，将生长激素基因和胰岛素样生长因子基因作为影响香猪生长速度的候选基因，克隆并分析基因的组织特异性表达规律并研究基因变异与香猪生长速度性状表型之间的关系。应用聚合酶链式反应技术从香猪的基因组文库中分离出1.903Kb生长激素基因，由五个外显子和四个内含子组成。香猪生长激素基因的碱基序列与已知四个国外猪种和9个中国地方猪种之间的相似性为97-99％，其间的差异集中在内含子2和4，通过限制性内切酶(DdeⅠ，NatⅠand BsmNⅠ)分析，鉴定出香猪生长激素基因的五个多态性位点，分别位于5’-侧翼区274(T／C)位点，外显子2的622(G／A)和631(G／A)位点，内含子2中的841(T／C)以及外显子4中的1358(A／G)位点。同时，1358(A／G)位的碱基改变导致香猪生长激素成熟肽第108位异亮氨酸替换，叁维结构分析表明，异亮氨酸的存在可能影响香猪生长激素与受体的亲合力。为了检测香猪生长激素与受体亲和力关系的变化，将生长激素成熟肽置于原核表达系统中表达。以香猪脑垂体总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到香猪生长激素cDNA，长700bp，回收后与载体DMD18-T相连，转化大肠杆菌TG1，筛选阳性克隆子，以重组质粒为模板，通过含有SapⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异引物将生长激素基因亚克隆到表达载体pTYB11上，野生型香猪生长激素的原核表达质粒pTYB11-wGH；采用定点突变PCR技校构建了含有Ile_(108)突变的重组质粒pTYB11-mGH。二种重组质粒分别转化受体菌ER2566，在IPTG诱导下，二种蛋白在原核细胞中获得了表达，SDS-PAGE检测表达的融合蛋白的分子量为78KD，与预期相符；定量分析结果显示，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的10％。该结果为进一步研究GH的结构、生物学活性及其与受体的相互作用等奠定了基础。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)分为IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ二种类型，在生长激素下游介导动物的生长。以香猪肝组织为实验材料，采用RT-PCR方法，克隆了完整的IGF-Ⅰ基因，测序结果分析表明该片段与已知猪种的IGFⅠ基因相似性为99％。以RT-PCR检测了IGF-Ⅰ基因在香猪组织中的表达，结果显示，IGF-Ⅰ主要在肝脏中表达，在脾、肺、软骨、脊髓、脂肪、子宫和肌肉组织中表达，肝脏中的表达量显着高于其它组织。
佚名[8]2003年在《中华内分泌代谢杂志2003年第19卷主题词索引》文中研究表明说明 :(1)本索引主题词按数字、英文字母、汉语拼音字母顺序排列 ;(2 )文题、作者后括号内数字为期号 ,最后为起始页码。数字和字母1 1 β 羟类固醇脱氢酶 1 1 β 羟类固醇脱氢酶与2型糖尿病 (陈娜 ,姚兵 ) (3) :2 4 51型糖尿
赵大鹏[9]2007年在《人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）中试工艺的研究》文中提出本研究用改进的RT-PCR法合成人肝脏cDNA,构建出cDNA文库,并从中分离出人胰岛素样生长因子1(human insulin like growth factor 1,hIGF-1)基因。将hIGF-1基因酶切后插入到pGEX-1λT载体中,连接转化大肠杆菌NM522,筛选克隆,酶切鉴定后测序,并进行了表达。将IPTG诱导表达的菌体离心收集,取少量菌体进行SDS-PAGE分析,在分子量34KD处可见明显高表达带(对照菌没有表达),Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。在完成以上研究的基础上,鉴于原核分泌型表达技术的优势,我们根据原核细胞分泌表达机制及需要,重新设计引物,利用PCR法分别分离出碱磷酸酶启动子(phoA),STII信号肽及hIGF-1编码基因,将它们连接到pUC载体,测序后,通过点突变技术对全基因序列进行了校正。分别构建出两套分泌型表达载体,并将其命名为pCSA和pCST,随后将上述基因装入到pCSA和pCST中,转化大肠杆菌W3110,得到工程菌pCSA/IGF-1/W3110,pCST/IGF-1/W3110,并进行了表达。经SDS-PAGE检测,在分子量7.6KD处有明显高表达带,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。根据中国生物制品检定规程的有关要求,我们进行了基因工程大肠杆菌工程菌的筛选和鉴定,得到工程菌株pCSA/IGF-1/W3110 ,pCST/IGF-1/W3110,经传代培养,提质粒酶切鉴定及蛋白表达测定表明,经100次传代后质粒不丢失,酶切鉴定表明为阳性克隆,蛋白表达稳定。根据中试工艺的要求,我们初步建立了分泌型hIGF-1的生产工艺,即为;种子液制备→发酵培养→离心收集菌体深度冷冻→rhIGF-1低渗震荡溶出→层析前处理→疏水层析→分子筛→离子交换→半成品。参照有关文献,以NIH3T3作为靶细胞,用XTT掺入法,初步建立了hIGF-1生物活性检定方法。
刘洪霞[10]2006年在《胰岛素样生长因子1重组类似物的研究》文中指出天然的胰岛素生长因子1(IGF1)是由是由70个氨基酸组成的单链碱性多肽,本实验在IGF1前端加了13个氨基酸,并且把IGF1的第叁位Glu(E)用Arg(R)代替,称作LR3-IGF1;这种重组类似物在体外与天然的IGF1相比能更好的与受体结合来调节细胞的生长发育,可用于体外细胞表达外源蛋白的大规模培养及临床辅助用药。本实验先把LR3-IGF1基因克隆至大肠杆菌表达载体pET32a中,经筛选、序列测定和酶切鉴定证实表达载体pET32-LR3-IGF1构建成功。重组的胰岛素样生长因子在Rosetta(DE3)plysS中获得了高效表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的30%,40L发酵罐中的蛋白质水平可达1.73g/kg。菌体经超声破碎制备包涵体,经变性、复性,SP-F.F、Phenyl-F.F层析和Sephacryl S-100凝胶过滤叁步纯化,得到分子量为9.1kD单一条带的目的蛋白,经高效液相HPLC分析纯度达到98%,目的蛋白的收率为30%,生物活性鉴定重组的胰岛素样生长因子具有刺激Bale/3T3细胞增长的特异性,其ED50在1.0ng/ml左右;本实验还根据中国药典对纯化品的杂质含量进行了测定,产品质量达到药用级别,还进行了稳定性保护剂的研究,其冻干制剂可在2-8℃保存1年。
参考文献：
[1]. 大菱鲆类胰岛素样生长因子和结合蛋白基因克隆及表达的研究[D]. 胡健. 中国海洋大学. 2012
[2]. 新型猪胰岛素样生长因子-1的基因克隆及表达分析[D]. 谢曌. 四川大学. 2007
[3]. 团头鲂胰岛素样生长因子结合蛋白1的基因克隆和表达[C]. 田玉梅, 蒋霞云, 邹曙明. 渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集. 2011
[4]. 胰岛素样生长因子结合蛋白-1基因克隆、表达以及功能研究[D]. 魏平. 军医进修学院. 2001
[5]. 花鲈类胰岛素生长因子及结合蛋白基因的克隆与表达调控[D]. 钱焜. 中国海洋大学. 2013
[6]. 奶牛泌乳性能候选基因的遗传特性研究[D]. 张佳兰. 西北农林科技大学. 2007
[7]. 香猪生长相关基因的结构与表达[D]. 李景. 贵州大学. 2007
[8]. 中华内分泌代谢杂志2003年第19卷主题词索引[J]. 佚名. 中华内分泌代谢杂志. 2003
[9]. 人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）中试工艺的研究[D]. 赵大鹏. 吉林大学. 2007
[10]. 胰岛素样生长因子1重组类似物的研究[D]. 刘洪霞. 吉林大学. 2006
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