杨克强[1]2003年在《葡萄无核基因定位与作图的研究》文中研究说明无核葡萄具有重要的商业价值，葡萄无核育种已成为当今葡萄育种的重要方向。近年的研究表明，葡萄无核性状由主效基因和一些微效基因共同作用而控制。本研究以红地球、红光无核、无核白及红地球×红光无核F_1代163株杂种为试材，对葡萄无核主效基因进行了定位与作图研究，对与无核主效基因紧密连锁的特异标记的DNA序列在GenBank中进行了相似性分析和开放阅读框架(ORF)分析，还进行了Southern杂交分析，主要结果如下。 1．葡萄无核基因连锁的SCAR标记的获得 以UBC-269_(484)和GSLP1_(569)的序列为支点，设计合成了包括UBC-269和GSLPI在内的9条引物，用有核亲本红地球和无核亲本红光无核的DNA为模板，对这9个引物进行筛选，结果序列长度均为18个核苷酸的GSLP1、39970524-5号引物和39970524-6号引物在无核亲本红光无核上扩增出了特异标记。GSLP1扩增出的特异标记为GSLP1_(569)，39970524-5号引物扩增出的特异标记为39970524-5-564，39970524-6号引物扩增出的特异标记分别为39970524-6-1538和39970524-6-1200。用这3个特异引物在红地球、红光无核、无核白和红地球×红光无核杂交组合F_1代163株杂种的DNA样上进行PCR扩增，结果4个特异标记在F_1群体中与无核主效基因共分离。这4个特异标记也出现于本研究所用组合中无核基因原始供给者无核白上。这些标记和葡萄的无核主效基因相连锁。 2．葡萄无核基因的定位与作图 用QTXb17遗传作图软件，对葡萄无核主效基因S定位与作图，特异标记GSLP1_(569)、39970524-5-564、39970524-6-1538和39970524-6-1200与无核主效基因S连锁紧密。当P=0.01时，LOD值在32.7—46.4之间，置信界限在0.2—9.9之间。这4个特异标记和无核主效基因S处于在同一连锁群，位于无核主效基因S的两侧，覆盖基因组12.3cM。特异标记39970524-5-564距S基因0.6cM，特异标记GSLP1_(569)距S基因1.2cM，特异标记39970524-6-1538距S基因4.9cM，特异标记39970524-6-1200距特异标记n.lcM。 3.葡萄无核基因特异标记DNA序列的相似性分析 与葡萄无核基因相连锁的特异标记39970524一5一564和39970524一6一1538的DNA片段回收、克隆、测序，特异标记39970524一5一564长度为564bp，39970524一6一1538长度为1538bp。这两个序列已登录GenBank，序列号分别为AY327513和AY327514。 在GenBanLk中，用BLAST对39970524一5一564和39970524一6一1538特异标一记的DNA序列进行了相似性分析，这2条DNA序列和GenBallk中其他生物的DNA序列同源性较小，为葡萄(巧tis vin沙ra)基因组所特有。39970524一5一564特异标记DNA序列中第38一59碱基间的22个碱基和拟南芥的2条编码MAP3K(受分裂素激活的蛋白激酶激酶激酶激酶)有关的核酸序列有相似性，39970524一5一 564特异标一记DNA序列中第38一59碱基间的22个碱基同时还和拟南芥第3条染色体的1条DNA序列有相似性。39970524一5一564特异标记这22个碱基所提供信息的实际意义有待进一步研究。39970524一6一1538特异标记的DNA序列和拟南芥的DNA序列没有相似性，但和水稻第6条染色体的DNA片段有23个碱基的相似性。 4.葡萄无核基因特异标记DNA序列开放阅读框架分析 在GenBank中，对 39970524一5一564和39970524一6一1538特异标记DNA序列的开放阅读框架分析表明，39970524一5一564在第405一536碱基间存在一个开放阅读框架，共包含1犯个碱基，可编码44个氨基酸。但在BLASTp中没有检测到与其同源的蛋白序列。 39970524一6一1538的序列最大的一个开放阅读框架在第1168一704碱基间，序列长度为465bp，可编码154个氨基酸。将这个开放阅读框架所编码的氨基酸序列，在BLASTP中和拟南芥的功能蛋白序列进行相似性比较，这一氨基酸序列和13个拟南芥的蛋白序列有部分相似性，相似位点在39一42个氨基酸间，E值在0.003一0.032间。这13个蛋白中，2个蛋白和胚胎发育后期丰富蛋白有关;1个蛋白和种子贮藏物及油脂转移蛋白酶抑制因子有关;还有一些分别和富脯氨酸、富亮氨酸及胞壁脂质体蛋白有关。由于39970524一6一1538的这个开放阅读框架所编码的序列和拟南芥蛋白序列的同源性偏小(E值0.003一0.033)，所以这个开放阅读框架的实际功能还需进一步验证。 5.葡萄无核基因特异标记DNA序列酶切位点和Southem blot分析 用Wingene23 1 DNA分析软件对39970524一5一564和39970524一6一1538序列的限制性内切‘酶酶切位点进行了分析，分别有30和130个可识别6个碱基及其以上序列酶切位点的限制性内切酶在39970524一5一564和39970524一6一1 538的DNA序列上存在酶切位点;EcoRI和Hindlll在39970524一5一564特异标记上没有酶切位点，而EeoRI在39970524一6一1538第135个碱基处有一个酶切位点，Hindlll在39970524一6一1538上没有酶切位点。 用39970524一5一564DNA作探针对葡萄基因组DNA作Southem杂交，结果在无核亲本红光无核及无核基因供给者无核白和无核杂种上杂交带出现，而且呈单拷贝，而在有核亲本红地球及有核杂种上杂交带未出现，进一步证明了39970524
杨克强, 王跃进, 张今今, 王西平, 万怡震[2]2005年在《葡萄无核基因定位与作图的研究》文中认为以UBC 269484和GSLP1569的序列为支点,设计合成了包括UBC 269和GSLP1在内的9条引物,以葡萄 有核亲本红地球和无核亲本红光无核的DNA为模板,对这9个引物进行筛选,结果GSLP1、39970524 5号引物和 39970524 6号引物在无核亲本红光无核上扩增出了特异标记GSLP1569、39970524 5 564、39970524 6 1538和 39970524 6 1200。用这3个特异引物在红地球、红光无核、无核白和红地球×红光无核杂交组合F1代163株杂 种的DNA样上进行PCR扩增,结果4个特异标记在F1群体中与无核主效基因共分离。4个特异标记也出现于所 用组合中无核基因原始供给者无核白上。这些标记和葡萄无核主效基因相连锁。用QTXb17遗传作图软件,对葡 萄无核主效基因S定位与作图,当P=0.01时,LOD值在32.7～46.4之间,置信界限在0.2～9.9之间。这4个 特异标记和无核主效基因S处于在同一连锁群,位于无核主效基因S的两侧,覆盖基因组12.3cM。特异标记 39970524 5 564、GSLP1569、39970524 6 1538、39970524 6 1200距S基因的遗传距离分别为0.6cM、1.2cM、 4.9cM和11.1cM。
万怡震[3]2003年在《中国葡萄属野生种抗病性及抗病基因RAPD标记作图研究》文中指出2001年和2002年以中国葡萄属野生种13种共67个株系和欧洲葡萄11个品种为试材，利用田间自然鉴定法，研究和分析了中国葡萄属野生种对白粉病和霜霉病的综合抗性；观察了葡萄白粉病和霜霉病的田间病症发展过程，分析、推测了野生葡萄抗霜霉病的主要机制；分别以88-110组合(83-4-96×粉红玫瑰)、86-2组合(五月紫×广西-2)的亲本和F_1植株为试材，以田间自然鉴定结果为依据，分析了葡萄种间杂种对白粉病和霜霉病的抗性及其遗传趋势；利88-110组合F_1群体为试材，运用BSA法，以“双假测交”为理论依据，利用RAPD多态性谱带和18bp扩增的多态性谱带，对抗葡萄白粉病主效基因、抗霜霉病主效基因、抗炭疽病主效基因、抗白腐病主效基因进行了分子遗传作图与定位研究；以“88-110”组合F_1群体为试材，利用18bp引物和RAPD扩增的多态性带和形态标记，对葡萄种间基因组进行了分子遗传作图研究。主要结果如下。 中国野生葡萄13个种中，抗白粉病和抗霜霉病的种分别为8个和5个，各占61.54％和38.4％；对两种病害均有抗性的种有3个(分别为秋葡萄、复叶葡萄和瘤枝葡萄)；总体来看，中国野生葡萄抗白粉病而感霜霉病；但野生葡萄对两种病害的抗性均比欧洲葡萄强。野生葡萄对两种病害的抗性，种间和株系间均存在抗性差异，株系间对霜霉病抗性的差异比对白粉病的大。 从田间发病来看，野生葡萄开始表现白粉病症状比欧洲葡萄晚10—15天，且前者症状比后者轻。根据田间病害流行初期到流行中后期的观察结果，可将葡萄植株霜霉病病症表现分为4类，大多数野生葡萄病症表现为：开始发病较轻，中后期逐渐严重；植株所有叶片均可感病，但幼叶更易感病；形成坏死斑，坏死斑边缘有病菌分布；病害流行初、中期引起落叶轻、后期重。通过分析田间症病表现和田间自然鉴定结果，可将野生葡萄抗霜霉病的主要机制分为4类，其中大多数野生葡萄的主要抗病机制为：对病原菌的入侵有一定的抗性，但抵抗病原菌在其体内扩展的能力较差或差。 在白粉病抗性遗传方面，“抗病×感病”组合“88-110”F_1代出现1：1比例分离；“感病×感病”组合“86-2”F_1代出现了11.29％的抗性单株。在霜霉病抗性遗传方面，2个杂交组合均为“抗病×感病”类型，后代均符合1：1比例分离。2个杂交组合后代对2种病害抗性，均出现了超亲类型，带有数量性状的特征，因此，葡萄白粉病的抗性遗传和霜霉病的抗性遗传均是由一对主效基因和若干微效基因共同作用的结果，野生葡萄亲本比欧洲葡萄品种有较强的遗传优势。 以88-110组合亲本“83-4-96”和“粉红玫瑰”为模板，444个10bp随机引物中有341个引物能在亲本间扩增出差异条带;然后以341个随机引物和12个18bp引物分别以葡萄白粉病、霜霉病、炭疽病和白腐病的抗性材料混合样和感病材料混合样为模板进行扩增，扩增出符合1:1比例分离的差异条带用于抗病基因定位与作图研究。抗葡萄白粉病基因图谱由39个RAPD标记组成，形成7个连锁群，共覆盖603.3cM，标记间平均距离15.IcM，最小距离2.IcM，最大距离30.6cM，抗白粉病主效基因(Unci)位于第2连锁群上，与之最近的两个标记为W05一1 1 00(4.2eM)和005一1450(7.6eM);抗葡萄霜霉病基因图谱由38个标记组成，形成6个连锁群，共覆盖594.5cM，标记间平均距离15.2cM，最小距离1.ocM，最大距离36.6cM，抗霜霉病主效基因(Plv)位于第2连锁群上，与之最近的标记为GRll一1100(l.oeM)、006一1500(2.leM)和v09一780(6.4cM);抗葡萄炭疽病基因图谱由36个标记组成，形成7个连锁群，共覆盖sl4.3eM，标记间平均距离13.geM，最小距离2.leM，最大距离32.6eM，抗炭疽病主效基因(Gl。)位于第1连锁群上，与之最近的标记为AJ06一l900(5.5cM)、GR7一1 800(9.leM)和Aos一700(zo.ZeM);抗葡萄白腐病基因图谱由13个标记组成，可形成2个连锁群，共覆盖195.IcM，标记间平均距离15.OlcM，最小距离2.ocM，最大距离24.4cM，抗白腐病主效基因(Ced)位于第1连锁群上，与之最近的标记为5 14一1600(4.2eM)和AY18一1800(6.leM)。 经测序，抗白粉病基因标记wOS一1 100全长为1 0 1 gbp，该序列有79个限制性内切酶位点。该标记已成功登录GenBank，登录号为:AY328908。 用3个18bP引物扩增的多态性标记、221个RAPD标记和3个形态标记，对88一110组合进行葡萄种间基因组作图。母本图谱由139个标记组成，分布在13个连锁群中，覆盖1984.3cM;父本图谱由119个标记组成，分布在14个连锁群中，覆盖1482.3cM。抗葡萄白粉病主效基因、抗霜霉病的主效基因、抗炭疽病主效基因和抗白腐病主效基因分别分布于不同的连锁中(分别在FMZ、FM4、FM6和FM7连锁群上)。
朱德林[4]2004年在《中国葡萄属野生种抗黑痘病基因RAPD标记作图》文中研究说明本研究以中国野生葡萄和欧洲葡萄种间杂交组合 88-110（83-4-96×粉红玫瑰）的双亲及 F1代群体为试材，在田间人工接种鉴定的基础上，对双亲及 F1代进行 RAPD 分析，依据 RAPD 分析结果，进行抗黑痘病基因的 RAPD 标记作图。同时对获得的特殊 RAPD 标记 S353-1400 进行测序及酶切分析，取得的主要结果如下： 1. 采用田间人工接种黑痘病病原菌的方法，研究了中国野生葡萄和欧洲葡萄种间杂交组合 88-110（83-4-96×粉红玫瑰）F1 群体对黑痘病的抗性。结果表明，44 株 F1代中，抗黑痘病的为 20 株，感病的为 24 株，经卡平方检测（X2＝0.2045*），符合 1∶1 比例分离。88-110 组合 F1 代，44 株中有 41 株的感病指数在双亲之间分布，占 93.18%。 2. 以 88-110 组合亲本 83-4-96 和粉红玫瑰为模板，444 个 10bp 随机引物有 341 个引物能在双亲间扩增出差异条带；然后用 341 个随机引物对葡萄黑痘病的抗性材料混合池和感病材料混合池为模板进行扩增，扩增出符合 1∶1 或 3∶1比例的 RAPD 标记用于构建遗传连锁图谱研究。利用 Mapmaker/Exp3.0 软件，在 LOD=3.0 设置下，24 个标记可形成一个连锁群，共覆盖 469.3cM，位点间平均距离 19.55cM，最小距离 5.9cM，最大距离为 36.4cM，与抗黑痘病基因最近的标记为 S353-1400（5.9cM）。 3. 将 S353-1400 用回收试剂盒回收，连接 T 载体并克隆，筛选、鉴定重组克隆。对重组质粒抽提、纯化和测序。测序结果为 S353-1400 序列的实际长度是1371bp。 4. 用 Wingene 231 DNA 分析软件对 S353-1400 序列的限制性内切酶位点进行了分析，有 141 个（可识别 6 个及其以上序列碱基位点）限制性内切酶在S353-1400 序列上存在酶切位点，并且在 1147bp 处有一 EcoR I 酶切位点。 5. 在 GenBank 中对 S353-1400 的 DNA 序列进行了相似性分析，表明序列与其它生物体序列同源性较小，为中国野生葡萄基因组所特有。S353-1400 在第<WP=6>1293-1321bp 间的 28 个碱基与拟南芥 2 个编码 bHLH（碱性-螺旋-环-螺旋）转录因子有关的核酸序列具有相似性。
张朝红[5]2007年在《无核葡萄胚珠发育进程中EST的分析及败育相关基因的克隆》文中指出无核葡萄食用方便,品质优良,是鲜食葡萄和制干葡萄的主要类型。生产中栽培的无核品种属于种子败育型,受精胚珠在发育途中败育而不能形成正常的种子,在果实成熟时仅留下大小不同的种子痕迹。无核葡萄胚珠的败育在不同年份、不同地点具有高度的稳定性,不受外界环境条件的影响,主要由无核葡萄的自身遗传基因所决定,因而具有十分重要的研究利用价值。本研究以典型的无核品种‘无核白’败育前后胚珠为材料,构建cDNA文库,采用EST技术,并以文库为基础采用PCR技术克隆败育相关基因及其上游调控序列,以期获得无核葡萄败育相关的EST序列或基因;同时,分析有核葡萄‘京秀’和无核葡萄‘杨格尔’胚珠发育(败育)过程中活性氧的变化及其活性氧清除酶活性的变化,以揭示无核葡萄胚珠败育过程中活性氧代谢的变化趋势,探索无核葡萄胚珠发育过程中活性氧变化与种子败育的关系。研究主要取得如下结果:1、提取不同发育时期胚珠总RNA,构建cDNA文库通过控制授粉,以花后27d、30d、33d、36d、39d、42d、45d、48d的‘无核白’胚珠为材料,采用改良SDS法提取总RNA,构建了胚珠败育前后不同时间点混合的cDNA文库。原始文库滴度为5.87×105 pfu/ml,有效库容量为5.55×105 pfu,重组率达96.60%。插入片段主要分布在0.5-2.0kb之间,平均大小为900bp左右。扩增文库滴度为2.135×109 pfu/ml。2、文库的测序和EST分析通过随机测序,获得了214条质量好的EST序列。利用BlastN和BlastX程序将获得的214条序列与GenBank的nr数据库进行同源性分析,并将两种比较结果进行汇总,有144条序列与己知基因相似性很高,占67.29%;17条序列与功能尚未确定的假定蛋白或未知蛋白同源性很高,占7.94%;53条在nr数据库中未找到同源的序列,占24.77%。53条没有找到任何同源性的序列中,9条为葡萄新的EST序列。获得60个基因全长序列,文库中全长序列基因占有同源性基因161条的37.27%。其中167条EST在GenBank数据库的登陆号分别为EY254594、EY254595、EY254596、EY254922、EY254923、EY254924、EY254925、EY254926、EY254927、EY254928、EY254929、EY254930、EY254931、EY254932、EY254933、EY254934、EY254935、EY254936、EY254937、EY254938、EY254939、EY254940、EY254941、EY254942、EY254943、EY254944、EY254945、EY254946、EY254947、EY254948、EY254949、EY254950、EY254951、EY254952、EY254953、EY254954、EY254955、EY254956、EY254957、EY254958、EY254959、EY254960、EY254961、EY254962、EY254963、EY254964、EY254965、EY254966、EY254967、EY254968、EY254969、EY254970、EY254971、EY254972、EY254973、EY254974、EY254975、EY254976、EY254977、EY254978、EY254979、EY254980、EY254981、EY254982、EY254983、EY254984、EY254985、EY254986、EY254987、EY254988、EY254989、EY254990、EY254991、EY254992、EY254993、EY254994、EY254995、EY254996、EY254997、EY254998、EY254999、EY255000、EY255001、EY255002、EY255003、EY255004、EY255005、EY255006、EY255007、EY255008、EY255009、EY255010、EY255011、EY255012、EY255013、EY255014、EY255015、EY255016、EY255017、EY255018、EY255019、EY255020、EY255021、EY255022、EY255023、EY255024、EY255025、EY255026、EY255027、EY255028、EY255029、EY255030、EY255031、EY255032、EY255033、EY255034、EY255035、EY255036、EY255037、EY255038、EY255039、EY255040、EY255041、EY255042、EY255043、EY255044、EY255045、EY255046、EY255047、EY255048、EY255049、EY255050、EY255051、EY255052、EY255053、EY255054、EY255055、EY255056、EY255057、EY255058、EY255059、EY255060、EY255061、EY255062、EY255063、EY255064、EY255065、EY255066、EY255067、EY255068、EY255069、EY255070、EY255071、EY255072、EY255073、EY255074、EY255075、EY255076、EY255077、EY255078、EY255079、EY255080、EY255081、EY255082、EY255083、EY255084、EY255085。3、活性氧代谢相关基因的克隆以构建的cDNA文库库液为模板,以载体两端通用引物和设计的特异引物通过PCR法扩增、拼接,获得葡萄锰超氧化物歧化酶(VvMnSOD)和葡萄抗坏血酸过氧化物酶(VvAPX)基因。通过文库直接测序获得葡萄金属硫蛋白基因(VvMT)、葡萄硫氧还蛋白基因(VvTRX)、葡萄脱氢抗坏血酸还原酶(VvDHAR)共5个活性氧代谢相关基因全长cDNA序列,进一步利用生物信息学软件对其进行序列特征分析。葡萄金属硫蛋白基因(VvMT)的cDNA序列长540bp,含有一个240bp的完整的开放阅读框架(ORF),编码的蛋白含有14个高比例的半胱氨酸(Cys)残基,占总氨基酸数的17. 72%,具有C-x-C、C-x-y-C和C-C的序列结构,在GenBank的登陆号为EU280163。同时,高度保守的半胱氨酸富含区(cysteine rich region, CR区)分布在蛋白质的两端,具有典型MT基因结构的叁段式特征。克隆的葡萄金属硫蛋白可以归Type 2,是MT家族的第15个成员。该基因的DNA序列长998bp,包含3个外显子和2个内含子,在GenBank的登陆号为EU280165;通过酶切、接头连接、巢式PCR,克隆了783bp的葡萄金属硫蛋白基因的上游调控序列。其核心启动子区域位于658～708bp之间,序列中TATA-box、A-box、CAAT-box、G-Box、ARE、Box-4、CCGTCC-box、GAG-motif、HSE、Skn-1_motif、TC-rich repeats、repeatscircadian等12个可能的启动子上游调控元件,其中Skn-1_motif是胚乳中特异表达的保守序列。葡萄硫氧还蛋白基因(VvTRX)的cDNA长561bp,开放阅读框架(ORF) 381bp,编码126个氨基酸,在氨基酸的13-117之间有Thioredoxin保守结构域,活性功能位点WCXP[C/S]保守性很强,VvTrx属于硫氧还蛋白基因h型的3亚类,在GenBank的登陆号为EU280164。以基因组DNA为模板,扩增VvTrx基因DNA序列长989bp,包含3个外显子和2个内含子,在GenBank的登陆号为EU280166。VvMnSOD基因cDNA全长896bp,完整的开放阅读框架(ORF) 687bp,编码228个氨基酸,序列的189～196之间含有Mn和Fe超氧化物酶的金属结合结构域DvWEHAYY,聚类分析表明为MnSOD,在GenBank的登陆号为EU280161;VvAPX基因cDNA全长1044bp,完整的开放阅读框(ORF)长度为762bp,编码253个氨基酸,序列的19～226具有peroxidase结构域,4～249之间具有ascorbate_peroxidase保守结构域,33～44之间含一个过氧化物酶的活性位点(Peroxidases active site signature)序列为APLMLRLAWHSA;其编码的蛋白属于胞质抗坏血酸过氧化物酶,在GenBank的登陆号为EU280159;脱氢抗坏血酸还原酶(VvDHAR)cDNA长990bp,完整的开放阅读框架(ORF)长639bp,编码212个氨基酸,预测位于细胞质,为1类DHAR,在GenBank的登陆号为EU280162。4、无核葡萄胚珠败育中蛋白质降解有关基因半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆测序的VVTOV384的克隆3’端有poly(A)结构,5’端不完整。以文库菌液为模板,载体5端序列设计引物,采用半巢式PCR法进行5’RACE,克隆获得葡萄VvCysP基因,为木瓜蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶,在GenBank的登陆号为EU280160,cDNA长1409bp,完整的开放阅读框架(ORF)长1134bp,编码377个氨基酸,是一个蛋白前体,成熟蛋白的长度可能为233个氨基酸残基,定位于细胞外。在氨基酸序列的163～174位点QGsCGSCWSfST为真核生物半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸活性位点,310～320位点LDHGVLLVGYG为真核生物半胱氨酸蛋白酶的组氨酸活性位点,334～353位点YWIiKNSWGENWGENGFYkI为真核生物半胱氨酸蛋白酶的天冬酰胺活性位点。半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(VvCPI)的cDNA长872bp,开放阅读框759bp,编码252个氨基酸,5～125为半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因保守结构域CY,氨基酸序列的81～94位点EQVVAGKIYyLTLE为半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(CYSTATIN)活性位点,1～22位为信号肽;为一个蛋白前体,成熟蛋白质属于细胞外蛋白。5、葡萄胚珠发育中活性氧和清除酶活性的变化以盛花后不同时期的无核葡萄品种杨格尔和有核葡萄品种京秀的胚珠为材料,测定胚珠中超氧阴离子( )和过氧化氢(H2O2)含量及活性氧清除酶活性的变化。结果表明:在两品种胚珠发育过程中均呈一直上升的趋势,在胚珠发育的中后期无核品种扬格尔产生速率明显大于有核品种京秀;胚珠中H2O2含量表现先升后降再升的趋势,但再升时无核品种扬格尔显着大于有核品种京秀;胚珠内活性氧清除酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)及无核品种扬格尔的过氧化物酶(POD)表现先升后降的趋势,无核品种扬格尔的酶活性在胚珠败育后明显下降,有核品种京秀仍有较高的水平,且有核品种的POD活性先快速上升后一直保持缓慢上升的趋势。胚珠内活性氧类物质及活性氧清除酶类的变化趋势与无核葡萄杨格尔幼胚败育有一定的相关性。
杨英军, 王跃进, 王西平, 张剑侠, 周鹏[6]2002年在《葡萄无核基因SCAR标记的序列构成与酶切分析》文中认为利用葡萄无核基因的特异探针１８ｂｐ,通过ＰＣＲ扩增获得了与葡萄无核基因相连锁的ＳＣＡＲ标记约５９０ｂｐ,采用自动荧光ＤＮＡ测序仪对该片段的核苷酸组成进行双向测序,来自无核白的无核基因特异标记由５６９对核苷酸组成。该标记可以作为合成探针和设计特异引物进行ＰＣＲ扩增的基础,用于检测葡萄育种材料和无核品种的无核性。
李金月[7]2008年在《无核葡萄抗寒种质资源创新与鉴定研究》文中指出无核葡萄是当前国际葡萄生产和消费的重要发展方向和趋势。但目前栽培的无核葡萄多为欧洲葡萄品种,虽然品质优良,但抗逆性差,特别是抗寒性差。因此,培育品质优良的无核抗寒葡萄新种质资源或新品种已成为目前葡萄育种的重要目标之一。中国是葡萄属植物重要的起源地之一,特别是山葡萄是葡萄属植物中最抗寒的一个种。本研究采用山欧杂种一代具有很强抗寒性的北醇品种,与无核葡萄底来特、爱莫无核杂交,通过胚挽救获得的F1代共38个株系150多株为试材,对其进行植物学特征的遗传规律调查分析和抗寒性鉴定;并利用已有的葡萄无核探针GSLP1对杂交后代进行了无核鉴定,以期为无核抗寒葡萄新品种以及种质资源的选育提供依据。主要取得了以下研究结果:1.通过底来特×北醇、爱莫无核×北醇两个杂交后代枝条及叶片的18个植物学特征的调查与分析,发现有4种植物学特征即枝上粉状物的有无、裂片数目、枝条皮孔及叶片厚度基本不变,可稳定遗传;杂交后代性状分离变化最大的是枝上是否带刺或斑点、叶片叶姿、叶面特征、叶柄洼形状,杂交后代中最少有4种分离类型;其他10种植物学性状变化分离都在2-3种之间。2.通过电导率结合Logistic方程计算出的半致死温度初步判定了2个组合38个株系杂交后代的抗寒性,并结合与抗寒有关的生理生化指标的测定综合鉴定了杂交后代的抗寒性。底来特×北醇杂交后代抗寒性最强的株系是DB14,LT50(半致死温度)为-25.32℃,LT50在-24℃以下的有DB16、DB20、DB82、DB88个株系,LT50介于父本与母本之间的有16个株系;爱莫无核×北醇杂交后代抗寒性最强的是OB67,LT50为-27.10℃,抗寒性超过了父本,抗寒性介于父本与母本之间的有14个株系,LT50高于母本的有4个株系,分别为OB10、OB49、OB66、OB68。通过不同低温处理下的枝条恢复实验以及生理生化抗寒指标鉴定,证明了它们与电导率结合Logistic方程确定的抗寒性结果基本一致。同时,从杂交后代的抗寒性结果中分析发现两个杂交组合中的后代中,抗寒性强弱呈现连续变异,为数量遗传。3.采用课题组在对中国葡萄属野生种及其杂种进行抗寒性综合评价的基础上,所筛选出的与抗寒基因相连锁的RAPD标记S241-691,对杂交后代进行了RAPD分子标记,进一步验证了杂交后代的抗寒性。结果表明,在“底来特×北醇”后代中出现S241-691特异条带的共有6个株系,分别是DB14、DB16、DB20、DB45、DB82、DB88,抗寒株系出现几率为31.58%。在“爱莫无核×北醇”后代中有7个株系出现了S241-691特异性条带,分别为OB16、OB25、OB32、OB46、OB61、OB67、OB73,出现几率为36.84%,鉴定的结果与电导法及枝条恢复生长和生理生化指标基本一致。4.利用葡萄无核基因分子探针GSLP1-569检测结果表明,在组合“底来特×北醇”杂交后代中,出现分子量为569bp特异性条带的有6个株系,分别是DB14、DB16、DB32、DB45、DB66、B82;在组合“爱莫无核×北醇”杂交后代中,出现分子量为569bp特异性条带的有7个株系,分别是OB23、OB25、OB46、OB50、OB66、OB68、OB73。5.通过抗寒和无核鉴定的结果来分析,在组合“底来特×北醇”杂交后代中,同时具有抗寒和无核性状的株系有DB14、DB16、DB45、DB82;在组合“爱莫无核×北醇”杂交后代中,同时具有抗寒和无核性状的株系有OB25、OB46、OB73。
马明[8]2007年在《核桃（Juglans regia L.）早实基因定位的研究》文中研究表明核桃的早实基因是一份珍贵的自然资源,研究核桃早实基因的遗传规律,寻找与其相连锁的DNA分子标记,不仅对于核桃育种和栽培实践,而且对于揭示木本植物童期发育的机理都有重要意义。近年来的研究表明,核桃的早实特性的遗传是数量性状遗传,有分离现象,是由多基因控制的性状。本研究以早实核桃优系绿园和晚实优系绿丰的F1代杂种后代以及部分核桃品种为试材,以RAPD标记OPB-08958定位核桃早实基因,计算该标记与核桃早实基因间的遗传距离,对该标记进行克隆测序及序列分析,并将该特异标记转化为SCAR标记;还初步确立了适于核桃的SRAP标记的反应体系。主要结果如下:①核桃基因组DNA的提取本研究证明改良的CTAB法是适合核桃基因组DNA提取的快速、简便的方法。该方法提取的核桃基因组DNA条带清晰,亮度均一,纯度较高,没有明显拖尾,无RNA,酶切反应均能被完全切开,酶切产物均一,酶切反应彻底,说明用本法提取的基因组DNA从质量和数量上都可以满足进一步研究的需要。②RAPD特异标记在亲本与杂交F1后代中的分离状况分析RAPD特异标记OPB-08900在早实亲本绿园上扩增出一条约900bp的特异性条带,而在晚实亲本绿丰上则无此条带;对于70株早实后代,有69株出现该条带,1株未出现(5号);84株晚实后代中,82株未出现该条带,2株出现(18号、108号)。χ2检测显示,供试杂交群体早实和晚实性状的分离比例符合1:1的分离比例,标记OP-B08900与早实性状共分离。在154株杂交F1后代中,共有3株表现为重组类型,则其重组率为1.95%。利用Haldane函数M=–㏑(1-2r)/2,计算得标记与核桃早实基因间的遗传距离为1.99cM,表明RAPD标记OPB-08900与核桃早实基因相连锁。③RAPD特异标记的回收、克隆、测序及序列分析本研究对RAPD特异标记片断OPB-08900进行了回收,并将回收产物与质粒PMD18-T连接,转化大肠杆菌JM109菌株感受态细胞,涂在预先涂布X-Gal/IPTG的含Amp的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选,克隆了该片断。对该片断进行测序,结果显示序列大小为958bp,提交GenBank,登录号为DQ673614。运用序列分析软件DNAMAN进行序列分析,表明该片断共有36个酶切位点,不具有基因的结构,应属于与核桃早实基因紧密连锁的DNA片断。在NCBI上特异标记DNA序列的同源性进行了比较,结果发现在GenBank中有26条来自于其它生物的DNA序列和DQ673614序列有部分相似性,但相似性位点片段大小大都在27-30bp之间,E值为0.002-7.0﹥﹥1×10-5,同源性较小说明特异标记OPB-08958的DNA序列为核桃基因组所独有。④SCAR标记的转化分析根据测序结果,在原有的OPB08随机引物及其互补序列基础上,设计了SEA、SEB两对SCAR引物,经检验,引物SEA在退火温度56℃条件下,对反应条件、反应体系如Taq酶、Mg2+、模板和引物的浓度等不敏感,重复性好,可以用于分子辅助育种的鉴定与选择。SEA在早实亲本及品种上扩增出和OPB-08958大小相似的条带,在晚实亲本及品种上则无此条带。检测其在杂交F1后代中的分离状况,发现与RAPD标记相一致。对该SCAR标记进行回收、克隆以及测序,与RAPD标记OPB-08958大小一致,表明本研究成功的将与核桃早实基因相连锁的RAPD标记OPB-08958成功转化为SCAR标记。⑤适于核桃的SRAP标记反应体系的确立分析本研究初步确立了适于核桃的SRAP标记反应体系,并利用不同引物组合对核桃早实和晚实亲本进行了SRAP-PCR扩增,挑选出一个多态性比较高的引物组合Em10-Me4对20株杂交后代上进行了检测,引物组合Em10-Me4在这20株杂交后代个体上共产生196条DNA条带,其中多态性条带为107条,多态性比率达54.6%,这说明SRAP标记适用于核桃遗传多样性的分析。
张瑞萍[9]2010年在《梨（Pyrus L.）遗传连锁图谱的构建和果实相关性状的QTLs定位》文中研究说明梨(Pyrus L.)为蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomoideae)植物,是世界主要栽培果树之一。本研究利用西洋梨‘八月红’梨(Bayuehong)和东方梨‘砀山酥梨’(Dangshansuli)的杂交F1代为作图群体,构建了双亲的SSR、SRAP和AFLP分子标记的遗传连锁图谱,同时统计和分析了该F1代群体果实相关的12个农艺性状,并利用区间作图法分析了与这12个性状有关的数量性状基因座位(QTL),其主要结果如下：1、利用SSRHunter软件分析NCBI公布的梨的EST序列,用Primer5.0软件设计梨EST-SSR引物,其中在不同梨品种中验证具有多态性的梨EST-SSR引物有6对。2、利用SRAP、AFLP技术对获得的‘八月红梨’ב砀山酥梨’F1代实生苗进行了鉴定,确定了该群体中的97棵结果单株为作图群体,分析其相似系数,除了其中2株的遗传相似性指数是0.86外,其他单株的相似指数均分布在0.36-0.68之间；UPGMA聚类结果显示图群体的分离程度较为均衡,适合遗传图谱的构建。3、利用‘八月红’ב砀山酥梨’的97株F1代群体,用SSR、SRAP和AFLP叁种分子标记方法,分别构建了一张共包含240个多态性标记位点的‘八月红’梨的遗传连锁图谱和一张包含216多态性标记位点的‘砀山酥梨’遗传连锁图谱。‘八月红’梨的遗传连锁图谱包含5个SSR多态性标记、S基因位点、83个SRAP多态性标记和151个AFLP多态性标记,共17个连锁群,覆盖了1703.8 cM的遗传距离,每个连锁群的长度为45.8-152.4cM,平均长度100.2 cM；每个连锁群上分布的多态性标记位点数为6～47个,平均分布14.1个位点；两个位点之间的遗传距离为0.01-35.0 cM,平均距离为7.1 cM。‘砀山酥梨’遗传连锁图谱包含3个SSR多态性标记、S基因位点、70个SRAP多态性标记和142个AFLP多态性标记的,分布在17个连锁群上,覆盖了1621.3cM的遗传距离,每个连锁群的长度为32.4～204.1cM,平均长度95.4cM；每个连锁群上分布的多态性标记位点数为3～47个,平均分布12.7个位点；两个位点之间的遗传距离为0.03-43.5 cM,平均距离为7.5 cM。两个图谱中的2、3、8、11、13连锁群能够利用共显性位点或杂合位点整合。4、利用Joinmap5.0分析软件,选用区间作图法(Interval Mapping)对果实相关性状进行了QTL定位分析,对12个梨与果实相关的性状进行分析,共检测出78个QTL位点,分属‘八月红’和‘砀山酥梨’的18个连锁群。检测到控制石细胞含量的的QTL共10个；检测到可溶性固形物含量的QTL位点1个；共检测到果实单果重的QTL位点10个；检测到果形指数相关的QTL位点5个；果心大小的QTL位点共检测到12个；可溶性糖含量的QTL位点共检测到2个；检测到可滴定酸的QTL位点7个；与脆度相关的QTL位点共检测到9个；检测到果实硬度的QTL位点共6个；果实纵径相关QTL位点共检测到3个；果实横径相关QTL位点检测到1个；检测到果实成熟期的QTL位点12个。其中45个QTL位点的LOD>3.5,可能为主效基因。5、与12个梨果实性状相关的78个QTLs分别分布在‘八月红’和‘砀山酥梨’的共18个连锁群上,其中有70个(89.7%)成簇分布于该18条连锁群中的16条之上,呈现2个或2个以上QTL共分离或紧密连锁的现象。其中共71个QTL分别较为集中地分布在BYH2/ DS2、BYH3/DS3、BYH7、DS7、BYH8/ DS8、DS9、BYH11/ DS11、DS12、BYH13/ DS13等5组连锁群和3条连锁群上,这些连锁群上分布的QTLs数目依次为4/3、6/4、7、6、7/4、5、5/8、6、6/2。梨遗传连锁图谱的构建和果实相关农艺性状QTLs的定位,为其遗传育种及分子标记辅助选择提供了有益的参考。
张艳艳[10]2008年在《华东葡萄抗白粉病和霜霉病基因RAPD标记的研究》文中进行了进一步梳理本研究以抗病的中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)白河-35-1(Baihe-35-1)与感病的欧洲葡萄(V.vinifera L.)佳利酿(Carignane)杂交F_1、F_2代为主要试材,在田间自然状态下,对这些杂种后代进行抗霜霉病的鉴定,研究了中国野生葡萄抗霜霉病的遗传表现。在此基础上,筛选出了中国野生葡萄抗霜霉病基因的RAPD标记,并对所获得的标记进行序列分析,不仅为标记辅助育种提供了DNA依据,而且为进一步的葡萄抗病基因的定位作图以及依据图谱克隆抗病基因奠定了基础。此外,对已获得的中国野生葡萄抗白粉病基因的RAPD标记进行分析验证。取得的结果如下:1、通过对520条随机引物的筛选,获得了中国野生葡萄白河-35-1抗霜霉病基因的6个RAPD标记,经克隆测序,这些标记的大小分别为369 bp,527 bp,615 bp,677 bp,1224 bp和725 bp,故分别命名为:S294-369,S202-527,S382-615,S221-677,S416-1224和S390-725。2、通过分析这6个RAPD标记在F_2代植株中的表现,证明这些标记都与霜霉病抗性基因相连锁,符合率分别为:72%,68%,75%,71%,69%和71%,这将为葡萄抗霜霉病育种的早期选择提供分子依据。用Joinmap 3.0对这6个RAPD标记进行连锁分析,发现它们相互之间没有连锁关系,分属于不同的连锁群。因此可以推定,这6个RAPD标记分别标记位于不同连锁群的抗霜霉病基因。3、对所获得的抗霜霉病标记进行序列分析。结果显示,所有的序列都与近年登录GenBank的葡萄全基因组鸟枪序列有极高的同源性,介于94%～98%。Blastx结果显示S382-615,S416-1224,S390-725都是编码未命名的葡萄蛋白序列。其中由S382-615翻译而来的氨基酸序列有41(41/86,47%)个氨基酸与香蕉转位酶类似蛋白相同,有34(34/88,38%)个氨基酸与拟南芥组蛋白乙酰转移酶二聚化包含结构域的蛋白相同,而此蛋白参与植物体内的特定调节机制。S390-725与苜蓿丙酸脱卤酶超家族(The haloaciddehalogenase,HAD)subfamily IB hydrolase hypertheticalⅠ有31个(31/46,67%)氨基酸相同,而此酶的功能目前尚未探明,初步推断可能与细菌对抗生素的抗性和植物的抗病、抗逆性有关。这些标记片段登陆GenBank后的序列号分别为F1107280,F1107282,F1107279,F1107281,F1107277和F1107278。
参考文献：
[1]. 葡萄无核基因定位与作图的研究[D]. 杨克强. 西北农林科技大学. 2003
[2]. 葡萄无核基因定位与作图的研究[J]. 杨克强, 王跃进, 张今今, 王西平, 万怡震. 遗传学报. 2005
[3]. 中国葡萄属野生种抗病性及抗病基因RAPD标记作图研究[D]. 万怡震. 西北农林科技大学. 2003
[4]. 中国葡萄属野生种抗黑痘病基因RAPD标记作图[D]. 朱德林. 西北农林科技大学. 2004
[5]. 无核葡萄胚珠发育进程中EST的分析及败育相关基因的克隆[D]. 张朝红. 西北农林科技大学. 2007
[6]. 葡萄无核基因SCAR标记的序列构成与酶切分析[J]. 杨英军, 王跃进, 王西平, 张剑侠, 周鹏. 果树学报. 2002
[7]. 无核葡萄抗寒种质资源创新与鉴定研究[D]. 李金月. 西北农林科技大学. 2008
[8]. 核桃（Juglans regia L.）早实基因定位的研究[D]. 马明. 山东农业大学. 2007
[9]. 梨（Pyrus L.）遗传连锁图谱的构建和果实相关性状的QTLs定位[D]. 张瑞萍. 南京农业大学. 2010
[10]. 华东葡萄抗白粉病和霜霉病基因RAPD标记的研究[D]. 张艳艳. 西北农林科技大学. 2008
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