张红新
天津市武清区人民医院中医科 天津 301700
摘要：目的：采用血清药理学研究方式，探究BGC-823细胞的凋亡与半夏泻心方配伍及诱导的关系。方法：研究选取我院2017年4月至2018年1月利用MTT法、S-P免疫组化法检测药方与细胞繁殖、凋亡等情况关联。结果：实验药方配伍中苦降、辛开及辛苦组等对于细胞繁殖的抑制能力明显强于其余配伍组别（P＜0.05）；并可对下调bc1-2基因表达产生积极影响。结论：半夏泻心方苦降、辛开、辛苦等配伍组别可对人体BGC-823细胞的繁殖产生有效抑制作用，且可进一步下调其bc1-2基因表达。可作为中医疗法中，防治胃癌的主要配伍组别、治疗法则借鉴之一。
关键词：半夏泻心方配伍；BGC-823；繁殖与凋亡；血清药理学研究
引言
中医疗法一直为国内临床保守治疗首推疗法之一，其效果好，副作用小，病患接受程度较高。半夏泻心方是近年来国内医学界用于防治胃癌的中药药方之一。且经大量应用数据证明，该药方不但配伍较多元、严谨，同时其含药血清可以对抑制胃癌BGC-823细胞的繁殖以及下调bc1-2表达等产生积极影响。我院为确切证实这一观点，采用MTT法及S-P免疫组化法等检测药方与胃癌细胞繁殖、凋亡等关系，拟定并组织具体研究活动，并取得良好的成效，现报告如下。
1.资料与方法
1.12017年4月至2018年1月，我院组织本次研究活动，具体资料如下：实验来源：人体胃癌细胞株BGC-823细胞；半夏泻心方药材；消化液（0.25%胰蛋白酶）；RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）；临用时用RPMI-1640培养液，稀释到实验要求浓度；5-FU（5-氟脲嘧啶）；动物：20只家兔，体重范围在2.0-2.5kg间；纳入标准：符合实验标准药剂、健康家兔；排除标准：病变家兔。
1.2方法
1.2.1配伍①如表1所示，根据原始药方比例，制备成7组配伍。②将表1中各配伍药物饮片浸水30分钟后煎煮。隔30分钟除渣，总煎两次。
1.2.2含药血清家兔禁食半日，2只为单位并对应各组别灌药；另取两只行生理盐水灌胃，一次26ML/kg。其中首次与第二次隔20小时，第二次与最后一次隔4小时。第三次灌药后隔2小时，无菌采血（心脏），并静待4小时。而 后300r/分行20分钟离心分离血清；并于相同环境下将血清与药物混匀。行30分钟、56℃水浴灭活，并-20℃保存[1]。
1.2.3BGC-823细胞培养
在5%浓度二氧化碳、37℃环境下培养细胞，培养液成分：15%胎牛血清+100U/ML链霉素+100U/ML青霉素的RPMI-1640培养液。将细胞与培养液混合并置于上述环境中，于2-3日后行传代培养[2]。
1.2.4MTT法取存活率在95%之上的对数生长期胃癌细胞，以胰蛋白酶（25%）消化培养，后以RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）配出单个细胞悬液，接种在96孔培养板上（每孔1×104个细胞；体积20μl）。于细胞液中滴入5%浓度的各配伍组兔血清；同时设置5FU阳性组与正常兔血清组（对照组），放入上述细胞培养环境，培养一日、两日。每孔滴入20μlMTT溶液（5mg/ML），4小时后清除清液后，各孔滴150μlDMSO，晃动10分钟。用酶联免疫检测仪检测各孔光吸值（490纳米波长），计算平均值公式：（作参考）[3]。
1.2.5S-P免疫组化法取一瓶情况同上的胃癌细胞，培养液同上，细胞数调整为2×104个/ML，放入培养皿中（直径5cm，玻片3块），放入培养箱。一日后，除去培养液，滴入同上血清，继续培养2日，并以PBS液冲3次。以酒精固定（95%），室温干燥[4]。
将固定细胞以PBS液冲洗，滴入柠檬酸修复液行高温修复抗原，冲洗，加入氧化酶阻断剂。孵育10分钟（室温），冲洗，加非免疫性动物血清，同上孵育；除去血清，加抗bc1-2，放于冰箱中过夜（4℃）；冲洗。加生物素标记二抗，孵育；冲洗，加链亲和素-过氧化物酶溶液，孵育；行5-15分钟DAB显色液显色，自来水冲洗；苏木素复染，无水乙醇脱水，采用中性树胶封片后阅片、并拍照[5]。
1.3观察指标bc1-2肿瘤细胞薄膜、胞浆呈棕色则判定为阳性细胞，未显色或呈现其他颜色则无效，不纳入计算；计算阳性细胞百分率（100个细胞），方法为：。
1.4统计学方法将实验所得数据采用SPSS20.0软件包进行统计分析中，计数资料采用χ2，若P值小于0.05，则认为两组间存在显著性差异。
2结果
实验中，各组家兔总数3只，细胞存活率均有变化，其中苦降、辛开、辛苦等配伍可明显对细胞的繁殖有效抑制作用：第一日，其BGC-823细胞存活率分别为84.36%、70.84%、27.60%，第二日则下降至77.04%、28.34%、14.97%，各项数值比对结果均存在明显差别（P＜0.05）。半夏泻心方各配伍组含药血清对BGC-823细胞影响统计具体结果见表2。
3讨论
从中医的角度考量，胃癌多因脾胃虚弱、中焦升降失调、体内热毒、寒湿等所致。近年来大量临床研究数据证明，当研究药方中成分按一定比例调配后，可产生针对性疗效[6]。本院此次组织的研究活动，从血清药理学角度出发，着力调查《伤寒论》中半夏泻心方各种配伍对于诱导BGC-823细胞凋亡的关系，并取得显著成效。所有配伍组别有空白组、全方组、辛开祖、苦降组、辛苦组、甘补组、辛甘组、苦甘组以及阳性组。如表2中研究数据所示：苦降、辛开、辛苦等配伍可明显对细胞的繁殖有效抑制作用，在1日分别为84.36%、70.84%、27.60%，第2日则猛降至81.41%、28.34%、14.97%，各项数值比对结果均存在明显差别（P＜0.05）。据其他研究数据可得，苦降、辛开、辛苦等配伍组显色但，可凭肉眼见表达。其中辛苦组更可进一步使bc1-2阳性细胞百分率下降到36.5%。实验数据可进一步证实此次研究活动的有效性。
对于肿瘤，其产生、发展的关键因素在于基因改变，具体可呈现出相关基因突变、丢失等。据以往关于胃癌bc1-2表达的研究显示，bc1-2表达分布较混乱，具体过程为正常胃粘膜、萎缩性胃炎、肠化生、不典型增长、胃癌。在其变化过程中，表达渐趋强化，细胞凋亡指数却成下降趋势，可推测出，细胞凋亡指数、bc1-2蛋白表达的负相关关联。而本次研究活动中采纳的半夏泻心方，其中苦降、辛开、辛苦对于bc1-2基因表达可产生抑制作用。而其他配伍，例如甘补组、辛甘组、苦甘组等则呈现出高表达。同时，半夏泻心方对于寒热错杂类病症有针对性疗效。其配伍苦降等，强调升降同调，且用时温而不燥、寒热并用。苦降、辛开、辛苦等成分配置严谨，且以极少药量便可达到专病专攻的效果。
综上所述，半夏泻心方苦降、辛开、辛苦等配伍组别对胃癌细胞的繁殖具有抑制作用，并可下调其bc1-2基因表达。而该药方的配伍方式对其他抑癌基因、癌基因等的具体影响值得业内同仁进一步探索。
参考文献：
[1]王江，周永学，谢勇波.半夏泻心汤拆方对胃溃疡大鼠胃黏膜修复因子EGF、VEGF表达的影响及方中寒热并用配伍意义的研究[J].中华中医药学刊，2015（11）：2700-2702.
[2]王江，周永学，谢勇波.半夏泻心汤及其拆方对胃溃疡大鼠胃黏膜bFGF、PDGF表达的影响及方中寒热并用配伍意义的研究[J].中华中医药杂志，2016（7）：2728-2731.
[3]罗太敏，李晋奇，杨戈，等.半夏泻心汤及其苦降药组促进胃肠动力的PK-PD研究[J].药物评价研究，2015，38（6）：622-628.
[4]赵训冰，滕佳林.浅论黄连汤交通心肾[J].西部中医药，2016，29（1）：108-109.
[5]林志雄，徐光星.《金匮要略》中和性用药组方思维初探[J].浙江中医药大学学报，2015（6）：494-498.
[6]沈正泽，古锐，曾宪泉，等.基于数据挖掘的中药专利复方治疗幽门螺杆菌相关性胃病的用药规律分析[J].中国中西医结合消化杂志，2016（8）：608-611.
[7]张炜，刘喜平，明海霞，等.半夏泻心汤含药血清对胃癌微环境诱导腹膜间皮HMrSV5细胞凋亡的影响[J].中华中医药杂志，2016，31（9）：3735-3738.
论文作者:张红新
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年7月20期
论文发表时间:2018/8/30
标签：细胞论文; 血清论文; 半夏论文; 胃癌论文; 培养液论文; 药方论文; 辛苦论文; 《中国误诊学杂志》2018年7月20期论文;