王雪妹[1]2015年在《鳗弧菌多克隆抗体和单克隆抗体的制备及其特性分析》文中研究指明鳗弧菌感染鳗鲡、鲈鱼、黄鱼、鲑鱼、香鱼、大菱鲆、牙鲆、虹鳟、对虾等广大水产养殖生物,具有发病快,致死率高和流行广泛特点,给水产养殖业造成较大的危害,受到广泛关注,成为研究热点。制备鳗弧菌(SMW5)全菌灭活抗原,免疫新西兰兔,制备兔抗多克隆抗体血清,其效价达1:320000;对鳗弧菌检测灵敏度为1×104CFU/mL;与副溶血弧菌(ATC17802)、嗜水气单胞菌(JS01-1)和类志贺邻单胞菌(LCCi190625)有微弱的交叉反应;Western-Blot表明多克隆抗体与抗原的40 kDa蛋白有结合,与25-35 kDa的蛋白也有抗原抗体反应。所制备的3株单克隆抗体,其中1H9效价好、抗体分泌稳定、灵敏度高、特异性强,可应用于鳗弧菌ELISA或金标试纸条的研制。以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞融合技术,制备鳗弧菌单克隆抗体:细胞融合率达94.6%,融合阳性率达到62.4%;筛选得到3株单克隆抗体分别命名为1H9、1C12、6F8,阳性细胞株培养上清的效价分别为 1:6400、1:3200、1:800,细胞亚类分别为 IgG2a、IgM、IgG2b,对鳗弧菌(SMF5)的检测灵敏度分别为:4×103CFU/mL、2×103CFU/mL和 8×103CFU/mL。1H9免疫小鼠制备腹水效价为1:640000。单克隆抗体的交叉反应表明,单克隆抗体1H9、6F8和1C12均能与鳗弧菌(SMW5)、鳗弧菌(参考株)起阳性反应;单克隆抗体1C12与溶藻弧菌(Js60517NA1)、创伤弧菌(FJ04-L1)、嗜水气单胞菌(JS01-1)呈非特异性反应;单克隆抗体6F8与副溶血弧菌(A4C17802)、哈维氏弧菌(03152)、非0-1群霍乱弧菌(96-2)呈现非特异性反应;1H9与所检测的菌株均未出现交叉反应,表现出较强的特异性。稳定性试验表明3株单克隆抗体均表现出较好的稳定性。
唐旭[2]2006年在《豚鼠气单胞菌单克隆抗体及抗独特型单克隆抗体的制备研究》文中研究表明豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)是养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物常见的细菌性病原体，可通过受损伤的皮肤及伤口感染上述生物，并可进一步通过食物链感染人。此菌所致鱼类等豚鼠气单胞菌病具有流行广、发病快、死亡率高等特点，常常造成养殖渔业的巨大经济损失，严重危害渔业及其它水产业的发展。目前国内外有关豚鼠气单胞菌鱼病的研究多局限于病原微生物学方面，对该病的诊断主要依靠临诊病理观察及细菌学鉴定，两种方法在准确性及检测速度上均有一定限制；防治方面主要利用抗生素或减活、灭活疫苗，安全性和有效性均不理想。鉴于此，本研究设计制备抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体并进而制备其独特型单克隆抗体，为豚鼠气单胞菌病的检测及防治提供新的技术方法，并为其它鱼用疫苗的研制提供参考。具体实验方法及结果如下： (1) 通过动物免疫、细胞融合、筛选、克隆化及利用ELISA检测技术，制备并鉴定抗豚鼠气单胞菌的单克隆抗体(mAb)。共得到7株能稳定分泌mAb的细胞株，分别命名为：0E10、1A2、1C4、1F1、1F10、1H8和2A1。染色体鉴定结果7株细胞染色体均符合杂交瘤细胞染色
夏永娟[3]2000年在《抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的研制》文中提出鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是养殖及野生鱼类的主要细菌性病原体，可通过受损伤的皮肤及伤口而轻易感染鱼体并可通过食物链感染人。此菌流行广，发病快，死亡率高，大面积感染将会给渔业带来巨大经济损失。敏感鱼种主要有鳗鲡、虹鳟、大麻哈鱼、真鲷、香鳟等几十种。目前，国内外有关鳗弧菌鱼病的研究多限于病原微生物学方面，诊断主要通过临诊病理观察及细菌学鉴定，检测速度及准确性均受限制。防治方面主要利用抗生素或减活、灭活疫苗，安全性和有效性均不理想。鉴于此，本研究设计制备抗鳗弧菌单克隆抗体并进而制备其抗独特型抗体，为鳗弧菌疾病的检测及防治提供新的技术方法，并为其它鱼用疫苗的研制提供参考。具体实验方法及结果如下： (1) 通过动物免疫、细胞融合、克隆化及ELISA检测技术制备并鉴定抗鳗弧菌的单克隆抗体(mAb)。共得到8株能分泌mAb的细胞株，分别命名为：2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E6、4E12。亚类鉴定显示：2H2，3D2，3B2和4E12为IgG_3；3A3、4A6和3C4为IgG_1；4E3为IgG_(2a)。mAbs腹水效价范围是1×10~(-5)～1×10~(-7)。交叉试验证明：2H2和3A3 mAbs与弧菌属中其它几种菌均不出现交叉反应，能用于特异性地检出鳗弧菌。其它6株mAbs不同程度的可分别与溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌、佛尼斯弧菌、拟态弧菌及麦氏弧菌中
夏永娟, 黄威权, 黄宝成, 金晓航, 李别虎[4]2001年在《抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的制备及鉴定》文中指出利用具有中和活性的抗鳗弧菌单克隆抗体 4A6作为免疫原 ,通过单克隆抗体技术制备出 7株分泌抗独特型单抗的杂交瘤细胞。以ELISA竞争抑制实验及诱导Ab3的功能实验证实 ,其中 4株属于Ab2 β,有可能用于疫苗生产。
张星[5]2009年在《抗独特型单克隆抗体制备的研究》文中提出嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)在自然界分布广泛,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物常见的细菌性病原体,可通过受损伤的皮肤及伤口感染上述生物,并可进一步通过食物链感染人。此菌所致鱼类等嗜水气单胞菌病具有流行广、发病快、死亡率高等特点,常常造成养殖渔业的巨大经济损失,严重危害渔业及其它水产业的发展。目前国内外有关嗜水气单胞菌鱼病的研究多局限于病原微生物学方面,对该病的诊断主要依靠病理观察及细菌学鉴定,两种方法在准确性及检测速度上均有一定限制;防治方面主要利用抗生素或减活、灭活疫苗,安全性和有效性均不理想。鉴于此,本研究设计制备嗜水气单胞菌抗独特型单克隆抗体,为嗜水气单胞菌病检测及治疗提供新的技术方法,并为其它鱼用疫苗的研制提供参考。具体实验方法及结果如下:利用本室自制的具有免疫中和活性的抗嗜水气单胞菌单克隆抗体1G10,通过动物免疫、细胞融合、筛选和克隆化,获得4株分泌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F9、1H10、3F5和4G3。杂交瘤细胞株的培养上清液及BALB/c小鼠腹水中抗独特型抗体效价范围分别为1×10~(-1)～1×10~(-2)和1×10~(-4)～1×10~(-5)。4株杂交瘤细胞系所分泌的IgG亚类是: 1F9、1H10、4G3为IgG2b;3F5为IgG3。ELISA竞争抑制实验结果显示:4株抗独特型抗体与兔抗嗜水气单胞菌多克隆抗体的结合都能被嗜水气单胞菌抑制,而且抑制百分率随着嗜水气单胞菌浓度的增加而增加,说明4株嗜水气单胞菌抗独特型单克隆抗体与嗜水气单胞菌之间存在相互竞争关系,均具有模拟嗜水气单胞菌抗原的特性。抑制百分率结果显示1F9、1H10受抑制程度比其余2株受抑制程度高,推测其模拟嗜水气单胞菌抗原的活性最好。生物学功能鉴定结果表明,制备4株嗜水气单胞菌抗独特型单克隆抗体腹水的BALB/c小鼠血清均能与嗜水气单胞菌反应,效价为1:100～1:1000,说明上述小鼠血清中含有抗嗜水气单胞菌抗体,提示4株嗜水气单胞菌抗独特型单克隆抗体均具有模拟嗜水气单胞菌抗原表位的作用,可用作预防鱼类嗜水气单胞菌病的疫苗。综上所述,本研究利用杂交瘤技术分别制备出多株抗嗜水气单胞菌的抗独特型单克隆抗体,为嗜水气单胞菌病的预防提供了条件。经检索,迄今未见嗜水气单胞菌抗独特型抗体疫苗成功制备的文献及专利报道。
甘玲玲[6]2013年在《大菱鲆迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸条的研制及应用》文中研究表明迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)隶属于肠杆菌科，爱德华氏菌属，是一种革兰氏阴性细菌，呈短杆状，兼性厌氧，具鞭毛及运动性。迟缓爱德华氏菌是水产养殖生物的常见致病菌之一，给水产养殖业带来了巨大的危害，对该病的及时诊断有利于降低损失。抗体的快速检测有助于疾病的早期预警及疫苗免疫效果的评价。目前常见的抗体检测方法，如中和试验、免疫凝集试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、抗体芯片技术、PCR技术、荧光定量PCR技术等均费时费力，本研究拟采用胶体金免疫层析原理制备迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸，以期得到一种准确、灵敏、安全、花费低、快速的抗体检测方法。1.鲆鲽类8种常见致病菌灭活疫苗及其抗血清的制备本研究采用甲醛灭活迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，用灭活菌液与弗氏佐剂等体积混匀并乳化后制得各菌灭活疫苗，通过肌肉注射免疫大菱鲆获得各菌的抗血清，大菱鲆接种迟缓爱德华氏菌灭活疫苗后，采用酶联免疫吸附试验测定抗血清，从第四周开始能检测出机体抗体，到第十周抗体水平达到最高，效价为1:102400，其他各菌灭活疫苗获得的效价分别为1:6400、1:6400、1:12800、1:12800、1:6400、1:6400、1:12800。各菌与各抗血清的交叉反应试验结果显示各菌与除自身外的抗血清存在一定的交叉反应，但与自身抗血清反应最为强烈。以上实验结果表明本实验制备的抗血清可以用于检测本研究拟研制的试纸条的灵敏性与特异性。2.大菱鲆免疫球蛋白IgM单克隆抗体的制备与鉴定本研究以纯化的大菱鲆血清免疫球蛋白IgM免疫小鼠，应用细胞工程的方法生产融合的杂交瘤细胞，经免疫学检测筛选方法筛选出分泌大菱鲆免疫球蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞，制备出大菱鲆IgM单克隆抗体。采用免疫印迹及酶联免疫吸附方法对单抗的效价、灵敏性及特异性进行检测，结果显示单抗识别纯化的大菱鲆IgM重链区，单抗与半滑舌鳎及草鱼、鲤鱼、鳙鱼、鲫鱼四种淡水鱼类无交叉反应，与鲈鱼、六线、黑鮶、红鳍东方鲀、牙鲆五种海水鱼类血清有一定的交叉反应，但与大菱鲆的血清的反应最为强烈，效价为1:1.024×106，对纯化大菱鲆免疫球蛋白的灵敏度为32ng/ml，表明该单抗具有良好的灵敏性和特异性，可以用于试纸条的制备。3.抗迟缓爱德华氏菌抗体胶体金检测试纸条的研制及应用采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，通过肉眼观察及紫外分光光度计扫描，制备的胶体金颗粒均一，直径为30nm。将胶体金调至弱碱性，用制备的胶体金标记单抗，最佳标记浓度为10μg/ml，并采用Dot-Elisa法检测金标抗体，结果显示金标抗体能与抗迟缓爱德华氏菌抗体反应。用X-only单向喷点仪将金标抗体均匀喷洒于用10%牛血清白蛋白处理过的玻璃纤维素膜上，干燥后制得金标垫。同时用喷点仪将迟缓爱德华氏菌破碎液上清及葡萄球菌A蛋白分别点射于硝酸纤维素膜(NC膜)上形成检测线和对照线，组装成试纸条。对所研制的迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸条进行重复性、稳定性、特异性及灵敏度检验试验，并与ELISA结果对比。结果显示阳性与阴性的符合率均为100%，且稳定性好，特异性高，对制备的迟缓爱德华氏菌抗血清灵敏度为1:102400，与ELISA的结果一致，并且试纸条与溶藻弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、哈维弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌抗血清均不发生交叉反应。试验证明迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸条的检测效果与ELISA水平相当，检测试纸条具有特异性强、敏感性高、高效便捷、操作简单、易于推广等优点。
吴园园[7]2013年在《鳗弧菌快速检测试纸条的研制》文中研究指明鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种可引起鱼类高致死性出血性败血症的病原菌,给水产养殖业带来巨大危害和经济损失,迫切需要建立一种准确、便捷的鳗弧菌检测方法用于疾病的防控。目前文献已报道的鳗弧菌检测方法存在检测时间长、操作过程复杂等问题,无法应用于养殖渔场等基层单位。本课题基于抗体标记技术开发以胶体金、量子点及上转磷光材料作为标记物的快速免疫层析法检测鳗弧菌,为鳗弧菌病害的防控提供便捷的检测方法。本课题以实验室分离的一株鳗弧菌毒株MVM425灭活菌体为抗原,制备鳗弧菌单克隆抗体5G4-G4和5G4-B8。以胶体金作为标记材料对鳗弧菌单克隆抗体进行标记,制备出鳗弧菌胶体金快速检测试纸条。该试纸条具有良好的特异性,与弧菌属常见的病原菌无交叉反应,其检测限达到105CFU/ml。据文献报道以量子点和上转磷光材料作为抗体标记物,可以大幅度提高检测灵敏度,实现对病原微生物的微量和定量检测。本课题考察了核-壳型量子点材料CdSe/ZnS和上转磷光材料NaYF4:Yb, Er作为抗体标记物在鳗弧菌检测中应用的可行性。通过优化抗体与这两种材料的最佳结合量,获得量子点和上转磷光材料标记鳗弧菌单克隆抗体,并以斑点杂交验证其应用于鳗弧菌检测的可行性,为后续研发量子点及上转磷光检测试纸条奠定了基础。
黄艺丹[8]2010年在《鱼类致病性豚鼠气单胞菌单克隆抗体—胶体金检测方法的建立》文中提出目的豚鼠气单胞菌是一种条件性致病菌：当鱼类抵抗力下降时或鱼体表有损伤时,容易被该菌侵入,反复感染后会导致其致病力增强,可形成很强的传染性。近年来,在我国养殖的南方鲇中发生了一种由豚鼠气单胞菌引起的以体表溃疡为特征的疾病,流行广、发病快、死亡率高,对水产养殖动物危害极大,导致巨大经济损失,严重危害我国渔业及水产业的发展。目前对豚鼠气单胞菌的鉴定主要依赖临床观察、解剖及一般细菌学检查法,操作过程既繁琐又费时,而且准确性不够,因此,建立快速、特异性强的诊断方法对更好防控豚鼠气单胞菌感染对水生养殖动物的危害具有重要的意义。本研究拟利用鱼类致病性豚鼠气单胞菌为抗原,制备抗该菌的单克隆抗体,并对其生物学特性进行了鉴定,在此基础上利用胶体金技术和所制备的单克隆抗体研制能快速检测豚鼠气单胞菌感染的胶体金试纸条,并进行性能测试,从而建立鱼类致病性豚鼠气单胞菌单克隆抗体-胶体金快速检测方法,为水产上豚鼠气单胞菌病的流行监测提供一种便捷的方法,同时也为该细菌引起的疾病检测方法研究积累一些资料。方法以福尔马林灭活的豚鼠气单胞菌按25μg/只、50μg/只分成两个剂量组,皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对豚鼠气单胞菌的单克隆抗体(McAb),用间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行特异性筛选,对筛选到的高特异性的单抗进行分离、纯化及鉴定：先通过饱和硫酸铵法粗提抗体,再用Protein A亲和层析法进一步纯化,然后对单抗进行了包括亚类鉴定、效价、相对亲和力的测定,并通过单克隆抗体的位点相加实验、与豚鼠气单胞菌脂多糖(LPS)的间接ELISA实验对单抗识别的抗原表位进行了初步研究。然后采用胶体金标记技术,通过双抗体夹心法(单克隆抗体—抗原—单克隆抗体),以所得单抗作为包被及标记抗体,制备胶体金-抗体结合物和反应膜,研制豚鼠气单胞菌胶体金快速检测卡,并通过特异性、灵敏度、重复性、稳定性和临床样本的检测进行方法学评价。结果获得了2株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞,并分别命名为3F3和2C9C3。经过鉴定,这2株McAb能够特异性的针对豚鼠气单胞菌,其抗体亚类分别为IgG1型和IgM型；腹水效价分别为10-6和10-5；相对亲和力较高；3F3针对豚鼠气单胞菌脂多糖表位,而2C9C3针对非脂多糖抗原位点。利用本实验制备的McAb建立了以McAb为基础的双抗夹心法膜式胶体金快速检测方法,所研制的豚鼠气单胞菌胶体金快速检测卡具有灵敏度好,最低检测量为1.71×104cfu/ml,特异性高,重复性100%,稳定性好(室温保存一年也不失活),检测时间快(5分钟可判定结果)等优点,对临床样本的检测准确率高,操作简便。结论成功地制备出抗豚鼠气单胞菌的单克隆抗体,并研制了能快速特异检测鱼类豚鼠气单胞菌的胶体金试纸条,为水产上豚鼠气单胞菌的快速鉴定和诊断以及该菌流行的监测提供有力的工具。
李晓莉, 张以芳, 曾令兵, 许映芳, 肖晶[9]2009年在《单克隆抗体在水产养殖中的应用》文中研究说明单克隆抗体具有高度特异性、均质性及来源稳定并可大量生产的优点,成为感染性疾病研究、诊断和治疗的一个有力手段。随着单克隆抗体技术应用的深入,其在水产养殖中也发挥了很大的作用。论文简要介绍了单克隆抗体的技术原理,对单克隆抗体在水产病原细菌性疾病、病毒性疾病的诊断以及水产激素、水产药物残留检测方面的研究及应用进行了概述,对单抗在水产方面的基础性研究工作进行了总结,并对存在问题和发展前景进行了讨论和展望。
夏永娟, 黄威权, 金晓航, 姜国良, 刘云[10]2000年在《抗鳗弧菌单克隆抗体免疫保护作用的实验研究》文中进行了进一步梳理本文以鳗弧菌感染牙鲆幼鱼为动物模型，对我们制备的三株抗鳗弧菌单抗４Ａ６，３Ｂ２， ４Ｅ１２， ３Ｅ７， ３Ａ４的免疫保护效果进行了研究，结果表明： ４Ａ６， ３Ｂ２和４Ｅ１２具有明显提高受５ＬＤ５０鳗弧菌感染的牙鲆存活率的作用，同时它们还可明显延长受大剂量鳗弧菌（１０ＬＤ５０）感染的牙鲆的平均存活时间。提示： ４Ａ６， ３Ｂ２和４Ｅ１２具有中和或减弱鳗弧菌毒性的作用。
参考文献：
[1]. 鳗弧菌多克隆抗体和单克隆抗体的制备及其特性分析[D]. 王雪妹. 福建农林大学. 2015
[2]. 豚鼠气单胞菌单克隆抗体及抗独特型单克隆抗体的制备研究[D]. 唐旭. 第四军医大学. 2006
[3]. 抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的研制[D]. 夏永娟. 第四军医大学. 2000
[4]. 抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 夏永娟, 黄威权, 黄宝成, 金晓航, 李别虎. 微生物学报. 2001
[5]. 抗独特型单克隆抗体制备的研究[D]. 张星. 第四军医大学. 2009
[6]. 大菱鲆迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸条的研制及应用[D]. 甘玲玲. 中国海洋大学. 2013
[7]. 鳗弧菌快速检测试纸条的研制[D]. 吴园园. 华东理工大学. 2013
[8]. 鱼类致病性豚鼠气单胞菌单克隆抗体—胶体金检测方法的建立[D]. 黄艺丹. 四川农业大学. 2010
[9]. 单克隆抗体在水产养殖中的应用[J]. 李晓莉, 张以芳, 曾令兵, 许映芳, 肖晶. 动物医学进展. 2009
[10]. 抗鳗弧菌单克隆抗体免疫保护作用的实验研究[J]. 夏永娟, 黄威权, 金晓航, 姜国良, 刘云. 海洋湖沼通报. 2000
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