侯敏[1]1997年在《人胚胰腺导管上皮细胞的体外长期培养及永生化》文中研究说明有关人的胰腺导管上皮细胞的生理功能调节、受体分布、基因表达调控、癌变机制等方面的研究，仍是较为薄弱的领域，其中最重要的原因是分离培养以胰腺导管上皮细胞为主的细胞群十分困难，特别是体外长期培养的问题至今没有解决。基于本领域研究工作的迫切需要，我们进行了这方面的工作。 首先，采用胶原酶消化的方法，分离人胚(中期引产的胎儿，20-30周)胰腺上皮细胞为细胞团，将10％FBS完全培基加入到这些细胞团中，接种至50ml塑料培养瓶，24小时后换2％FBS完全培基进行原代培养。经过近20个胎儿的胰腺标本的分离培养，摸索出了适合于胰腺导管上皮细胞原代培养的方法和条件。若原代培养的细胞不传代，其生活状态可维持长达2月之久；也可以传代，传第3代的细胞仍以上皮细胞为主，细胞生长良好。 对原代培养细胞进行了初步的鉴定，结果为培养77、96小时的原代细胞，淀粉酶检测阴性，Cytokeratin免疫细胞化学染色阳性，说明原代培养的细胞为导管上皮细胞而非腺泡细胞，为进行体外转化奠定了基础。 在成功地建立胰腺导管上皮细胞原代和传代培养的基础上，利用SV40 T基因掺入细胞基因组DNA后可以造成细胞转化，使转化细胞能够在体外长期传代培养的特性，将载有SV40 T基因的质粒pSV-T，通过脂质体Lipofectin介导，转染原代和传代(第3代)培养的胰腺导管上皮细胞，经过2-7周的筛选，终于
王晓静[2]2004年在《运用nestin-EGFP转基因小鼠研究脑和胰腺中nestin阳性细胞的体外增殖分化潜能》文中进行了进一步梳理背景: 近年来,干细胞的研究成为生物医学领域的一个热点,引起了广大研究者的关注,是因为干细胞的研究为一些长久困扰人们的医学难题和顽症提供了治疗新思路。有些成体干细胞的研究比较深入,如造血干细胞和神经干细胞;有的刚刚开始,如胰腺干细胞、皮肤干细胞、肝干细胞等。总的来说现在干细胞的研究还处于初级阶段,还有许多问题没有解决:干细胞由于缺乏特异性的标记,其分离纯化还未有好的解决方法;体外培养体系的建立还不完善;干细胞的增殖、分化的确切分子机制尚不清楚;目前诱导干细胞向某些表达特异标记的细胞分化,尚未找到成熟的方法等等。此外,干细胞研究与胚胎的伦理地位、克隆人等若干问题也有着极为密切的关系。 目的: 本课题旨在通过建立细胞内源蛋白nestin的启动子/增强子所驱动的报告基因EGFP表达的转基因小鼠,经过流式细胞仪分选出脑和胰腺中nestin阳性细胞,在体外检测脑来源的nestin阳性细胞是否具有神经干细胞的增殖分化潜能,能否代表神经干细胞群体;胰腺来源的nestin阳性细胞是否是胰腺的干细胞,是否具有干细胞的特性。这为神经干细胞的分离纯化提供一种可行有效的方法,并为胰腺干细胞的初步研究提供一套简便可靠的体外分离、培养、诱导分化、鉴定的方法。这对于研究神经系统和胰腺的发育过程,研究发育机制及临床治疗神经系统疾病和糖尿病都具有十分重要的意义。 方法: 1.转基因小鼠的获得:纯化基因片段nestin-hsp68-EGFP,用显微注射方法把基因片段注射到受精卵的雄原核中,获取转基因小鼠。 2.转基因小鼠nestin表达模式的鉴定:通过荧光显微镜观察和以小鼠尾巴基因组DNA为模板的PCR反应来鉴定阳性转基因小鼠,分别取胚胎、成年小鼠
蒋磊[3]2009年在《TIEG1基因在TGF-β1介导肝癌细胞生长抑制中的作用及抗肿瘤研究》文中研究表明第一部分TIEG1基因在TGF-β1介导肝癌细胞生长抑制中的作用研究背景:肝癌是世界上第五大恶性肿瘤,晚期患者治疗难度大、疗效差,目前尚无有效的治疗策略。因此研究肝癌的发病机制,寻找新的治疗靶点和疗法是目前研究热点。TGF-β在体外能抑制肝细胞增殖和诱导细胞凋亡,在体内控制肝细胞的生长,维持肝脏大小。然而,在肝癌细胞中,往往对TGF-β失去敏感性,被认为是肝癌发病的机制之一,但其机理尚未完全阐明。研究目的:通过筛选对TGF-β1不同敏感程度的细胞株(包括正常肝细胞和肝癌细胞),以此为模型,研究肝癌细胞对TGF-β敏感性缺失的主要原因以及TIEG1抑制肝癌细胞生长的作用机制。研究方法:选取了对TGF-β敏感的肝癌细胞株Hep3B和正常永生化的肝细胞株MIHA,以及对TGF-β不敏感的两株肝癌细胞株(HepG2、Bel7404)做为细胞模型。TGF-β1处理0、0.5、1、2、4 h后,RT-PCR方法检测TGF-β不同敏感程度的细胞株之间TGF-β信号通路主要相关基因表达的差异;利用siRNA抑制TGF-β敏感肝癌细胞Hep3B的TIEG1表达,观察细胞对TGF-β1敏感性的改变;利用慢病毒载体在TGF-β不敏感肝癌细胞(HepG2、Bel7404)中过表达TIEG1,研究TIEG1在TGF-β1对肝癌细胞生长抑制中的作用。Western blot检测TGF-β1和TIEG1对stathmin表达的影响;萤光素酶报告基因检测TIEG1对stathmin启动子的调控;采用染色质免疫共沉淀方法,观察TIEG1对stathmin启动子区域的直接结合作用;并进一步在TIEG1过表达的肝癌细胞中同时过表达stathmin,研究对逆转TIEG1抑制细胞生长的作用。研究结果:(1)在检测TGF-β1处理细胞后的早期基因反应中,发现在TGF-β敏感的细胞(Hep3B、MIHA)中,TGF-β1能强烈诱导TIEG1基因表达上调(7～11倍),并在1h时达到高峰;而在对TGF-β不敏感的细胞(HepG2、Bel7404)中,TIEG1基因表达只有微弱的上调(2～3倍),TGF-β敏感的细胞中TIEG1基因表达变化显著高于TGF-β不敏感的细胞。(2)应用siRNA抑制TGF-β敏感肝癌细胞Hep3B中TIEG1基因表达,可以使Hep3B细胞对TGF-β1的敏感性降低。(3)在TGF-β不敏感的肝癌细胞(HepG2、Bel7404)中过表达TIEG1,可以抑制肝癌细胞的增殖和诱导凋亡。(4) TIEG1可以通过直接结合stathmin启动子区域,调控启动子活性,下调stathmin的表达;TGF-β1处理敏感肝癌细胞Hep3B也可使stathmin表达下调。(5)在TIEG1过表达的肝癌细胞中同时过表达stathmin,可以明显逆转TIEG1对肝癌细胞的生长抑制作用。结论:(1) TGF-β1处理后,TIEG1基因早期表达反应能力的减弱,是导致肝癌细胞对TGF-β1丧失敏感性的主要原因。(2)阐明了TGF-β1对TIEG1基因及下游stathmin的调控作用,提出假设的“TGF-β1—＞TIEG1—＞stathmin—＞细胞增殖抑制”新的信号通路,揭示TIEG1基因在TGF-β1介导肝癌细胞生长抑制中的重要作用。本研究为探讨肝癌发病机制,寻找新的治疗靶点提供了实验依据。第二部分慢病毒载体过表达TIEG1对胰腺癌细胞生长抑制和化疗药物的增敏作用研究背景:胰腺癌是目前已知的恶性程度最高的肿瘤之一。近年来,人胰腺癌的发病率和死亡率呈上升趋势,严重影响着人们的生活质量。大部分胰腺癌细胞对化疗药物耐药,导致胰腺癌预后极差。寻找更加有效的治疗方法,成为目前胰腺癌治疗的关键。TIEG1可以诱导TGF-β敏感胰腺癌细胞凋亡,抑制细胞生长,但对TGF-β不敏感胰腺癌细胞生长和化疗药物敏感性的影响尚未阐明。研究目的:研究在胰腺癌细胞中过表达TIEG1对胰腺癌细胞生长和化疗药物敏感性的影响,并探讨其作用机制。研究方法:利用慢病毒转基因系统,在胰腺癌细胞株(SW1990和Canpan-2)以及永生化正常胰腺导管细胞株(HPDE6-E6E7-c7)中过表达TIEG1,MTT法测定其对胰腺癌细胞和正常细胞生长抑制作用的差异;DAPI染色法检测TIEG1对胰腺癌细胞凋亡的影响;MTT法测定过表达TIEG1后,胰腺癌细胞对化疗药物吉西他滨敏感性的改变;实时定量PCR和Western blot方法检测TIEG1对胰腺癌细胞stathmin表达的影响;用慢病毒过表达stathmin,研究对逆转TIEG1抑制胰腺癌细胞生长的作用;利用特异性siRNA抑制stathmin的表达,观察对胰腺癌细胞生长的影响。研究结果:(1)慢病毒载体过表达TIEG1基因能抑制胰腺细胞生长,并且在肿瘤细胞中抑制效果明显高于正常胰腺癌细胞株,具有统计学意义。(2)过表达TIEG1基因可以诱导胰腺癌细胞凋亡,促进肿瘤细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性。(3) TIEG1可以下调胰腺癌细胞stathmin的表达;同时用慢病毒转染方法过表达stathmin可以一定程度逆转TIEG1基因对肿瘤细胞的生长抑制作用。(4)用siRNA转染胰腺癌细胞,下调stathmin的表达,也可以抑制胰腺癌细胞的生长。结论:TIEG1基因主要通过下调stathmin表达抑制胰腺癌细胞株的生长,促进对化疗药物吉西他滨的敏感性,有可能成为胰腺癌基因治疗及联合化疗药物治疗的新靶点。
参考文献：
[1]. 人胚胰腺导管上皮细胞的体外长期培养及永生化[D]. 侯敏. 中国协和医科大学. 1997
[2]. 运用nestin-EGFP转基因小鼠研究脑和胰腺中nestin阳性细胞的体外增殖分化潜能[D]. 王晓静. 山东大学. 2004
[3]. TIEG1基因在TGF-β1介导肝癌细胞生长抑制中的作用及抗肿瘤研究[D]. 蒋磊. 浙江大学. 2009