卢美光[1]2004年在《小菜蛾对菊酯的kdr抗性机制及抗性的分子检测方法研究》文中研究表明本文对溴氰菊酯高抗小菜蛾品系从室内毒理、种群遗传学、生物化学和基因水平对其kdr抗性特性做了研究，旨在揭示小菜蛾对溴氰菊酯的kdr抗性机制及抗性的分子检测方法，从而为合理的使用菊酯类农药、延长其使用寿命及有效检测害虫kdr抗性的分子方法提供理论依据。通过比较萝卜苗与甘蓝叶片饲养小菜蛾的方法，改进和确定一套简便可行的室内饲养小菜蛾的方法。对采自北京、安徽、广西和海南田间小菜蛾用点滴法进行抗性监测，结果表明，田间小菜蛾对溴氰菊酯己产生高水平抗性，尤以海南抗性最高，抗性倍数在3570倍以上。利用群体选育与单对选育相结合的方法，选育溴氰菊酯抗性和敏感小菜蛾种群。溴氰菊酯群体汰选小菜蛾8次后，对溴氰菊酯的抗性＞3500倍；经1代的单对反选育，相对敏感种群对溴氰菊酯的敏感性提高了2.6倍。通过溴氰菊酯抗性小菜蛾品系的交互抗性测定表明，对高效氯氰菊酯有很高的交互抗性，抗性倍数在1500倍以上，对DDT也产生了正交互抗性，但对有机磷与氨基甲酸酯类药剂辛硫磷和灭多威无正交互抗性。比较研究了多功能氧化酶抑制剂增效醚(PB)和酯酶抑制剂S，S，S-叁丁基磷酸叁硫酯(DEF)对溴氰菊酯抗性小菜蛾品系的增效作用。结果表明，PB对抗性品系有增效作用，但不能完全消除抗性品系对拟除虫菊酯的抗性；而DEF对几个菊酯及DDT增效作用不明显。说明小菜蛾对拟除虫菊酯的抗性与酯酶无关，与多功能氧化酶活性有密切关系，但不是唯一的抗性机制。用遗传学方法研究了小菜蛾对溴氰菊酯抗性的遗传方式。结果表明，小菜蛾对溴氰菊酯的抗性是由常染色体控制的不完全隐性遗传。依据已报道相关引物设计，用RT-PCR、nest-PCR扩增小菜蛾品系para型钠通道的区域Ⅱ的保守序列，研究小菜蛾的kdr抗性的分子机制。扩增出溴氰菊酯抗性小菜蛾para型钠通道314bp片段，其核苷酸序列与敏感品系同源性为98.7％，推导的氨基酸序列的同源性为92.2％，与果蝇para、家蝇的氨基酸序列的同源性分别为96.2％和93.3％。与敏感小菜蛾核苷酸序列比较，抗性小菜蛾核苷酸序列包含四个基本的变化。其中两个突变与家蝇和德国蜚蠊的突变一致，一个位于第1014位的IIS6，从敏感品系的亮氨酸(CTT)到抗性品系的苯丙氨酸(TTT)的替换(L1014F)，一个位于IⅡS4-S5连接环上，从甲硫氨酸(ATG)到苏氨酸(ACG)的突变(M918T)，这是在小菜蛾中首次发现的与super-kdr抗性相关的突变。第叁个突变位于ⅡS5，与super-kdr家蝇品系不同，是从苏氨酸(ACC)到异亮氨酸(ATC)的突变(T929I)。第四个新突变位于IIS6，从敏感品系的苯丙氨酸(TTC)到抗性品系的亮氨酸(TTA)的替换(F1020L)。从毒理、种群遗传学、生物化学和基因水平等结果与害虫kdr抗性特性的一致性表明小菜蛾对溴氰菊酯的kdr抗性机制的重要作用。依据钠通道保守序列及L1014F、T929I点突变设计5对不同引物，用PASA、Bi-PASA和SSCP分子检测技术，检测抗性和田间小菜蛾kdr抗性不同基因型，研究小菜蛾kdr抗性分子检测方法。结果表明，小菜蛾抗性RR、敏感SS和杂合RS品系在PASA、Bi-PASA和SSCP分子检测中分别呈现不同的带型图样，PASA、Bi-PASA和SSCP分子检测技术能有效的区分小菜蛾RR、SS和RS品系，灵敏度较高。
宋春满[2]2005年在《云南烟蚜抗药性的监测及抗性机制研究》文中认为烟蚜是许多重要农作物上的重要害虫，主要通过取食和传播病毒造成危害。防治烟蚜主要是每年多次使用化学农药，这导致了烟蚜抗药性的发生和发展。在云南烟蚜是烤烟大田生产期的主要害虫之一，它不仅直接为害烟草叶片，降低烟叶品质，而且传播多种病毒病。目前烟蚜已对多种农药产生了抗性，原有化学农药防治效果显着降低。农药使用量的加大，不仅增加了防治成本，而且加剧了环境污染。烟蚜的抗药性机制在遗传学主要有3种(Devonshire et al，1998)。第一种是两种相似的羧酸酯酶的过量产生(E4 and FE4)，它们隔离和降解某些农药，产生了对有机磷农药和大部分氨基甲酸酯类农药的高度抗性，以及对菊酯类农药的一定抗性(Devonshire and Moores，1982)。另外2种与靶标位点不敏感相关的抗性机制也在烟蚜中发现，乙酰胆碱酯酶变构个体对二甲基氨基甲酸酯类农药如抗蚜威表现高水平抗性。而针对云南烟叶生产过程中烟蚜抗药性问题，还未见系统研究，因此本文研究研究了云南烟叶生产期烟蚜抗性发生发展状况，结果如下： 通过检测我省烟草种植历史较短地区和非烟草种植区的烟蚜抗性水平，选择到非烟草种植区迪庆州维西县统维乡上凉台村的烟蚜种群作为相对敏感品系进一步筛选的种群，并筛选获得了相对敏感品系烟蚜，对硫丹、灭多威、甲胺磷、辛硫磷、氧化乐果、敌杀死、高效氟氯氰菊酯7种杀虫剂的敏感度较高，同时确定了烟蚜对这7种杀虫剂的抗性诊断剂量分别为5638.4mg／kg、1248.3mg／kg、579.7mg／kg、989.3mg／kg、1005.6mg／kg、19.3mg／kg和5.3mg／kg。 采用“浸渍法”检测了我省9个主要烟区烟蚜种群对氧化乐果、辛硫磷、甲胺磷、硫丹、灭多威、高效氟氯氰菊酯及溴氰菊酯的抗性水平，掌握了我省主要烟区烟蚜种群的抗性现状和抗性分布特征。总体来看，我省玉溪和大理烟区烟蚜种群的抗性水平相对较高，对多数农药已产生了较强的抗药性；楚雄、红河、曲靖、昭通和昆明烟区烟蚜种群的抗性水平中等，对少数农药产生了较强的抗药性；保山和丽江烟区烟蚜种群的抗性水平相对较低，仅对少数农药产生了抗性。我省大多数烟区的烟蚜种群对硫丹和灭多威尚未产生明显的抗性，对其他药剂均已产生不同程度的抗性，其中对有机磷类杀虫剂氧化乐果和甲胺磷已产生了很强的抗药性。 统研究了底物浓度、反应时间、反应温度、反应体系pH等影响α-乙酸萘酯羧酸酯酶、β-乙酸萘酯羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶和乙酰胆碱酯酶活力的因素，确定了采用单头烟蚜同时检测多种与抗性相关酶类活力的生化检测方法。 研究了烤烟品种对烟蚜解毒酶与靶标酶活力的影响，发现烤烟品种对烟蚜α-
卢美光, 高希武, 范贤林[3]2005年在《田间小菜蛾对菊酯的kdr抗性相关特性研究》文中进行了进一步梳理本文为研究田间菊酯抗性小菜蛾的分子检测方法,对溴氰菊酯高抗小菜蛾田间品系从室内毒理、种群遗传学对其kdr抗性特性做了研究,旨在明确kdr抗性在此田间菊酯抗性小菜蛾中的重要作用,为本研究进一步的kdr抗性分子基础研究提供依据。
王建军[4]2001年在《小菜蛾Plutella xylostella （L.）杀虫剂靶标抗性的分子生物学研究》文中研究说明小菜蛾Plutella xylostella（L）是世界性的十字花科蔬菜的重要害虫，对小菜蛾的防治主要依赖于使用有机合成杀虫剂，长期以来在其常发区己经形成抗药谱广，抗性水平高的特点，国内外学者对小菜峨抗性机制进行了大量的研究，然而这些研究大都局限于生物化学水平，对小菜蛾抗性的分子生物学机制知之甚少，这无疑影响了小菜蛾抗性治理和对小菜蛾抗药性微进化现象的认识。 本文以重要农业害虫小菜蛾为材料，对南京郊区小莱蛾进行了抗性测定。通过增效作用测定和抗性生化机制研究发现，靶标不敏感性是南京郊区小菜蛾对拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂产生抗性的主要机制，在此基础上，对这两杀虫剂的作用靶标—钠离子通道和乙酰胆碱酯酶基因进行了克隆和序列分析。 抗性测定结果发现，与武汉敏感品系相比，南京郊区小菜蛾对氯氰菊酯和溴氰菊酯产生了极高的抗性，抗性指数分别为122.04倍和大于176.64倍，对敌敌畏和甲基毒死蜱也产生了抗性，抗性指数分别为9.54倍和22.59倍。活体增效试验显示，酯酶抑制剂TPP对氯氰菊酯和溴氰菊酯的增效作用分别为1.46和1，多功能氧化酶抑制剂PBO对氯氰菊酯和溴氰菊酯的增效作用分别为3.02和1，这表明击倒抗性，即神经敏感性下降，可能是小菜蛾对拟除虫菊酯类杀虫剂产生高抗性的主要机制。 点滴法测定结果表明阿维菌素、氟虫腈、巴丹和杀虫单对抗性小菜蛾的触杀毒力较高，LD_(50)分别为0.003、0.0052、0.122和0.19μg/头。这4种杀虫剂可作为今后防治抗性小菜蛾的替换药剂。杀虫剂联合毒力测定结果表明，氟虫腈与啶虫脒、氟虫腈与阿维菌素、敌敌畏与阿维菌素、敌敌畏与杀虫单、杀虫单与啶虫脒以及杀虫单与阿维菌素的混剂组合对抗性小菜蛾具有显着的增效作用，共毒系数分别为288.71、215.22、206.36、215.86、232.57和642.98；敌敌畏与啶虫脒的混剂组合对抗性小菜蛾具有拮抗作用，共毒系数为35.89；而氟虫腈与敌敌畏、氟虫腈与杀虫单以及啶虫脒与阿维菌素的混剂组合对抗性小菜蛾具有相加作用，共毒系数分别为115.8、94.88和112.63。 生化测定结果发现，以4龄幼虫整体匀浆为酶液，以α-乙酸萘酯为底物，武汉敏感品系和南京抗性品系的酯酶活性分别为213．80和226．27nmolimgPthlllll，两品系酯酶活性没有显着差异；以CDNB为底物，武汉敏感品系和南京抗性品系的谷肌甘肽转移酶活性分别为0．9654和0．65710D偷gh，南京品系是武汉品系的0．68倍：以DCNH为底物，武汉敏感品系和南京抗性品系的谷耽甘肽转移酶活性分别为0．07755和0．07992OD／m帅in，南京品系是武汉品系的1刀3倍，没有显着差异；以对硝基苯甲醚为底物，武汉敏感品系和南京抗性品系的多功能氧化酶卜脱甲基活性分别为0．3806和0．4408rpol／mgPt／min，南京品系是武汉品系l．16倍，没有显着差异。乙酚胆碱酯酶动力学研究发现，武汉敏感品系和南京抗性品系的AChE动力学特征具有显着差异，南京品系的兄和Vo分别为武汉品系的1．57和1．37倍。抗性生化机制研究表明，靶标不敏感性可能是南京小莱蛾对拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂产生抗性的主要机制。 利用反转录多聚酶键式反应（RT－PCR）的方法对小菜峨抗拟除虫菊酯品系的钠离子通道基因cDNA片段进行了克隆和序列分析。通过特异性上游引物和简并性下游引物从单头抗性小菜峨4龄幼虫中同时扩增出了位于钠离子通道基因 IIS6和第H个连接区的 383hp和 3峋两个 cDNA片段，分别命名为DBMI和 DBMZ（口沾nbthe登录号为 AF273106和 AF273107）。与小菜峨参考敏感品系钠离子通沮基因核昔酸序列相比，编码第8位氨基酸Leu的叁联密码子的第一位碱基C突变为T，并导致Leu突变为Phe。对获得的小莱蛾钠离子通道基因CDNA片段氨基酸序列的同源性分析表明，DBM！与果蝇pp和烟蚜夜峨hsCp的氨基酸同源性分别为76％和84％，这表明采用的这一对引物扩增出了与果蝇p钠离子通遭基因同源的小菜蛾钠高子通道基因cDNA片段。DBMI与 DBMZ相比较，除了存在两个氨基酸差异外，DBMI比DBMZ多了13个氨基酸的序列·GLKAALCGRCVSS。将CDNA片段碱基序列与通过PCR扩增获得的对应基因组 DNA碱基序列（Genbank登录号为 AF273 105）进行比较发现，在该区域存在长度分别为 110和 11 69hp的两个内含子。与果蝇 para ＄因相比，这两个内含子的位置具有保守性。而DBMI与DBMZ则是钠离子通道基因选择性剪接的结果，由 13个氨基酸 GLKAALCGRCVSS组成的的 39hp序列片段是一个选择性微外元（Optiond dcroeon人进一步研究发现，在抗性和敏感小莱 2 蛾幼虫期、蛹期和成虫期的钠离子通道都存在这一选择性剪接，但DBMZ的 表达水平在不同发育阶段存在差异。 利用聚合酶链式反应，通过特异性上游引物和下游引物分别从小菜蛾武汉 敏感品系和南京拟除虫菊酯抗性品系基因组DNA中扩增出了位于钠离子通道 ?
毕锐[5]2016年在《大豆蚜抗高效氯氟氰菊酯的分子机制及差异蛋白质组学分析》文中研究指明大豆蚜(Aphis glycines Matsumura)属于半翅目(Hemiptera)蚜科(Ahpididae),以刺吸式口器为害大豆和野生大豆,并且可以传播植物病毒,造成重大的经济损失,是重要的大豆害虫。高效氯氟氰菊酯作为一种有效杀虫剂,由于长期应用防治大豆蚜,已经产生抗药性。昆虫抗药性形成的机制包括表皮穿透力降低,解毒代谢作用增强和靶标敏感度降低,其中解毒代谢抗性和靶标敏感度降低是导致昆虫产生抗药性的主要机制。本研究以大豆蚜为研究对象,从生物化学、分子生物学和蛋白质组学角度揭示大豆蚜对高效氯氟氰菊酯的抗性机制,对有效防治大豆蚜,开展抗药性治理具有现实意义。在实验室通过多代抗性筛选,建立遗传背景相同的大豆蚜高效氯氟氰菊酯敏感品系(CSS)和抗性品系(CRR),CRR品系抗性倍数为43.42倍。建立了高效氯氟氰菊酯与其他杀虫剂的交互抗性谱,为田间合理使用农药提供了实验依据。在大豆蚜CRR品系和CSS品系中加入酶的相关抑制剂,研究增效剂对高效氯氟氰菊酯的增效作用。在建立稳定抗药性品系基础上,通过对比分析两个品系羧酸酯酶活力;应用q RT-PCR技术,揭示了CRR品系羧酸酯酶m RNA转录水平的变化,结果表明羧酸酯酶过量表达与抗性产生相关。酯酶活性增高和细胞色素P450活性增强是昆虫产生抗性的主要机制,通过对细胞色素P450表达量的分析,明确了其表达量的增加是大豆蚜对高效氯氟氰菊酯产生抗性的重要因素。钠离子通道作为菊酯类杀虫剂的作用靶标,通过对其基因IIS4-S6的克隆与序列分析,探讨了钠离子通道相关基因与大豆蚜产生抗性的关系。在此基础上,应用差异蛋白质组技术,比较了大豆蚜高效氯氟氰菊酯CSS品系和CRR品系蛋白表达的差异,对抗药性响应蛋白进行了分析。交互抗性毒力测定结果显示,大豆蚜高效氯氟氰菊酯抗性品系对毒死蜱产生中等水平的交互抗性(11.66倍),与乙酰甲胺磷产生低水平交互抗性(8.20倍),与顺式氰戊菊酯产生中等水平交互抗性(13.83倍),与氟氯氰菊酯产生中等水平交互抗性(9.64倍),与氯氰菊酯产生较高水平交互抗性(37.23倍),与联苯菊酯产生低水平交互抗性(4.81倍),与灭多威产生中等水平交互抗性(9.32倍),与克百威产生中等水平交互抗性(14.60倍),与溴虫氰、吡虫啉、啶虫脒、丁醚脲和阿维菌素无交互抗性。增效剂研究结果表明,在高效氯氟氰菊酯中加入TPP、DEF、PBO增效剂,大豆蚜CRR品系增效系数分别达到了5.85、23.00和40.59;对于CSS品系增效系数为0.26、0.35和3.00,结果显示增效剂对抗性品系作用明显,说明大豆蚜对高效氯氟氰菊酯产生抗性与酯酶相关。酯酶动力学测定结果表明,抗性品系酶活比率是敏感品系的1.405倍,CSS品系和CRR品系间羧酸酯酶比活力存在极显着差异(p<0.01)。利用q RT-PCR技术对大豆蚜羧酸酯酶表达量进行了分析,CRR品系是CSS品系的5.87倍,CRR品系和CSS品系羧酸酯酶基因m RNA转录水平差异显着。除此之外,对大豆蚜细胞色素P450氧化酶家族基因进行了测定,在大豆蚜高效氯氟氰菊酯抗性品系中CYP6A13-like,CYP6A2-like,CYP6A14-like和Cytochrome b-c1基因表达量显着增加。钠离子通道基因IIS4、IIS5、IIS6的克隆和测序发现,核苷酸序列中包含了kdr和super-kdr位点,如果大豆蚜抗性品系钠离子通道基因序列相对应的位点发生了突变,说明这两个位点跟大豆蚜对高效氯氟氰菊酯的kdr和super-kdr相关,为研究钠离子通道与大豆蚜对高效氯氟氰菊酯抗性机制奠定了一定的理论基础。利用双向电泳(2-DE)技术,对大豆蚜CSS品系和CRR品系蛋白质差异表达情况进行了研究,2-DE图谱分析结果表明,共检测到36个蛋白丰度差异表达变化在2倍以上的蛋白点,有24个蛋白得到了有效鉴定,包括微管结合蛋白、肌动蛋白、表皮蛋白、果糖1,6-二磷酸醛缩酶、烯醇酶、热激蛋白等,部分抗药性响应蛋白在大豆蚜抗高效氯氟氰菊酯中发挥重要的作用。
黄剑, 吴文君[6]2003年在《小菜蛾抗药性研究进展》文中指出小菜蛾作为各种十字花科蔬菜的重要害虫 ,对多种有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、苯甲酰脲类昆虫生长调节剂、农用抗生素甚至植物源杀虫剂都产生了不同程度的抗药性。本文就小菜蛾的抗药性的形成与发展、杀虫剂之间的交互抗性、抗性的生理生化机制以及分子、遗传机制等方面研究进展进行了论述。
黄剑[7]2005年在《小菜蛾抗阿维菌素品系细胞色素P450的研究》文中认为为探讨小菜蛾Plutella xylostella L.对阿维菌素产生抗性的解毒代谢机制,本论文主要就抗阿维菌素小菜蛾抗性品系中细胞色素P450 的酶含量、单加氧酶活性、光谱特性、诱导特性等生理生化基础,及小菜蛾的细胞色素P450 基因进行了初步研究。结果如下:1 小菜蛾对新型杀虫剂的敏感性研究及阿维菌素抗性品系的选育 用浸叶法测定了陕西杨凌地区小菜蛾田间种群对阿维菌素等几种新型杀虫剂的敏感性。结果表明,田间种群小菜蛾对阿维菌素、氟虫腈、啶虫咪、溴虫腈、茚虫威、多杀霉素、甲胺基阿维菌素等的抗性倍数分别为2.75、1.65、1.10、1.27、1.16、1.14 和1.32倍,还没有产生明显的抗药性。用阿维菌素在室内以点滴法处理小菜蛾敏感品系4 龄幼虫,连续继代淘汰选育其抗药性,至18 代,药剂汰选的小菜蛾对阿维菌素的抗性指数为选育前的20.6 倍,可以认为形成了抗性品系。增效剂试验结果表明,多功能氧化酶抑制剂PBO 和羧酸酯酶抑制剂TPP 对阿维菌素有明显的增效作用,说明小菜蛾对阿维菌素产生抗性的机理可能与多功能氧化酶和羧酸酯酶有关。2 抗性和敏感小菜蛾品系细胞色素P450 酶系的发育特征敏感和抗性品系小菜蛾从2 龄幼虫发育到成虫,细胞色素P450 和b5 含量均在4 龄幼虫和预蛹期达到最大值。抗性品系小菜蛾的P450 含量在不同的发育阶段均显着大于敏感品系小菜蛾,P450 含量的增长倍数从1.21 倍至1.75 倍,这表明小菜蛾对阿维菌素产生的抗性,可能与细胞色素P450 介导的解毒代谢有关。研究还发现,无论是抗性品系还是敏感品系,细胞色素b5 的增长与P450 的增长具有较高的相关性,表明细胞色素P450 酶系介导的小菜蛾对阿维菌素的抗性可能还与细胞色素b5 有关。3 抗阿维菌素小菜蛾的细胞色素P450 酶系活性对小菜蛾敏感品系和阿维菌素抗性品系的细胞色素P450 单加氧酶活性以及细胞色素P450 还原酶的活性测定结果表明,抗性品系细胞色素P450 还原酶活性是敏感品系的1.97 倍;使用不同模式底物,抗性品系中甲氧试卤灵-O-脱甲基酶活性(MROD)、乙氧试卤灵-O-脱乙基酶活性(EROD)、乙氧基香豆素-O-脱乙基酶活性(ECOD)以及对硝基苯甲醚-O-脱甲基酶(PNOD)活性均明显高于敏感品系,分别为敏感品系的9.41 倍、4.15 倍、1.67 倍和2.94 倍,达到极显着差异水平。说明细胞色素P450 单加氧酶的脱烷基活性增加可能是小菜蛾对阿维菌素产生抗性的一个重要因子。
王兴亮[8]2012年在《小菜蛾对多杀霉素和氯虫苯甲酰胺抗性的特征及机理》文中研究说明小菜蛾Plutella xylostella (Lepidoptera:Yponomeutidae)属于鳞翅目菜蛾科,是世界范围内的一种重要害虫,每年造成的经济损失达40～50亿美元。小菜蛾寄主植物种类达40多种,主要为害十字花科蔬菜。由于生活周期短、繁殖能力强、世代重迭严重及田间不合理用药,使小菜蛾几乎对所有的防控用药(至少涉及84种杀虫剂)产生了不同程度的抗性。小菜蛾抗药性问题给十字花科蔬菜生产带来严重威胁和巨大挑战,抗性治理形势严峻。多杀霉素是一种作用于烟碱型乙酰胆碱受体的抗生素类药剂,氯虫苯甲酰胺是作用于昆虫鱼尼丁受体的二酰胺类杀虫剂。这两种新型杀虫剂均对鳞翅目等靶标害虫具有优异的防治效果,并具备良好的环境安全性。本文系统研究了小菜蛾对多杀霉素和氯虫苯甲酰胺抗性的特征(包括抗性筛选、抗性稳定性、交互抗性谱及抗性遗传方式等)以及抗性机理,研究结果对于了解小菜蛾对新型杀虫剂抗性演化的分子机理及制订抗性治理对策具有重要意义。1.小菜蛾对多杀霉素抗性特征的分析利用浸叶法对小菜蛾SZ-Spin56品系进行26代连续筛选,获得多杀霉素高抗品系SZ-Spin83。与室内敏感品系Roth和室内对照品系SZ相比,SZ-Spin83品系对多杀霉素的抗性分别达到10,000倍和4,000倍。对该高抗品系用多杀霉素继续筛选或停止筛选,抗性均无显着变化,表明小菜蛾SZ-Spin83品系对多杀霉素抗性稳定(抗性基因已经纯合)。交互抗性测定结果显示,SZ-Spin83品系对阿维菌素和乙基多杀菌素存在高水平交互抗性(交互抗性分别为468倍和2396倍),对茚虫威、高效氯氰菊酯、氟虫腈、溴虫腈、巴丹、啶虫隆、丁醚脲、虫酰肼、氰氟虫腙和氯虫苯甲酰胺均没有明显交互抗性。抗性遗传方式分析表明,小菜蛾SZ-Spin83品系对多杀霉素的抗性受位于常染色体、共显性遗传的两个或两个以上基因控制。2.小菜蛾对多杀霉素的抗性机制叁种解毒酶抑制剂(PBO、DEM和DEF)在室内敏感品系Roth、室内对照品系SZ和抗性品系SZ-Spin83中对多杀霉素均不存在显着的增效作用(增效比<2倍)。SZ-Spin83品系多功能氧化酶、酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性相对于敏感品系Roth有所升高(<2倍),但与其初始种群SZ品系水平相当(<1.2倍)。因此,代谢酶介导的解毒作用与SZ-Spin83品系对多杀霉素的抗性关系不大,其主导抗性机理可能为靶标变异。通过RT-PCR和RACE技术克隆了小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体Pxa2基因,该基因在多杀霉素抗性品系和敏感品系间不存在保守的氨基酸突变位点,并且该基因mRNA表达水平在抗性品系SZ-Spin83与其初始种群SZ之间没有显着差异。另外,对已报道的多杀霉素抗性基因Pxa6进行了研究。通过对敏感品系Roth55个和抗性品系SZ-Spin8358个阳性克隆的测序,检测到Pxa6亚基的6种转录本,其中3种类型为本研究首次发现。Pxa6基因在抗性和敏感品系间不存在保守的氨基酸突变位点,同时SZ-Spin83品系与其初始种群SZ相比,Pxa6的mRNA表达量没有差异。因此,我们认为小菜蛾对多杀霉素的抗性机理以靶标抗性为主,但与烟碱型乙酰胆碱受体a6亚基(Pxa6)和α2亚基(Pxa2)无关,或为nAChR其它亚基突变所致,亦不排除其它靶标基因参与抗性演化的可能性。3.小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感毒力基线和抗性监测利用浸叶法测定了2007-2009年间采集自我国11个地区的16个田间种群和7个室内饲养品系对氯虫苯甲酰胺的敏感性。16个田间种群的LC50值介于0.221-1.104mg/L之间,敏感性波动幅度在5倍以内；7个室内饲养品系基于LC50值的敏感性波动范围小于10倍。同时,利用16个田间种群的毒理学数据确定了15mg/L的诊断剂量,7个室内品系和5个田间小菜蛾种群在该剂量下的平均死亡率为99.75%(98%-100%)。该结果表明我国小菜蛾田间种群对尚未用于蔬菜害虫防控的氯虫苯甲酰胺具有较高的敏感性。本研究建立的小菜蛾对氯虫苯甲酰胺敏感毒力基线对于抗性监测与预警具有重要价值。在2010-2011年间,监测了我国12个地点采集的20个小菜蛾种群对氯虫苯甲酰胺敏感性的变化。结果表明,采自北部地区的14个田间种群对氯虫苯甲酰胺仍然敏感,LC50值在0.226-0.71mg/L,波动范围仅3倍。采自广东省的6个田间种群对该药剂的抗性水平差异很大,LC50值在0.343-256.2mg/L之间,波动幅度达770倍。与敏感品系Roth相比,广东珠海(ZH)和增城(ZC)种群分别具有150倍和2,140倍的抗性。该结果表明,必须合理使用氯虫苯甲酰胺防治小菜蛾以延缓抗性；同时,加强小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的监测,在高抗地区必须停止使用氯虫苯甲酰胺。4.小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性特征的分析2011年秋季采集的对氯虫苯甲酰胺具有抗性的PY、ZH和ZC种群(F3测定抗性倍数为18-1,150倍),对氟虫双酰胺表现出相近的抗性水平(15-800倍),说明二酰胺类的两种药剂之间存在着交互抗性。药剂选择压力移除以后,ZC种群对氯虫苯甲酰胺的抗性表现出不稳定性,由2,040倍下降至25倍仅用6代时间。抗性遗传方式分析表明,小菜蛾ZC高抗种群对氯虫苯甲酰胺的抗性为常染色体、不完全隐性遗传。由ZC分离一部分建立ZC-R品系,对其进行的增效实验表明PBO、DEF和DEM对氯虫苯甲酰胺毒力具微弱的增效作用(增效比为2.2～2.9),表明代谢酶介导的解毒作用在氯虫苯甲酰胺的抗性形成中作用有限,靶标抗性可能为小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的主要机理。5.小菜蛾鱼尼丁受体的变异与氯虫苯甲酰胺抗性的关系昆虫鱼尼丁受体是二酰胺类杀虫剂的作用靶标。我们克隆了小菜蛾的鱼尼丁受体基因(PxRyR)cDNA全长,从而为研究靶标抗性奠定基础。PxRyR由15,495bp的ORF框、267bp的5'-UTR区和351bp的3'-UTR区组成,编码5164个氨基酸,分子量约为583.7KDao PxRyR具备鱼尼丁受体的普遍特征：保守的羧基端结构,此区域含6个跨膜结构域可形成功能性的Ca2+通道,胞浆区为大的氧基端结构域。PxRyR与昆虫RyR在氨基酸水平上的一致性很高,为78%-80%. PxRyR全长cDNA存在10个缺失多态性位点,说明单个PxRyR基因可以产生多种类型的转录本。同时,PxRyR基因在小菜蛾卵期、幼虫期和成虫期mRNA表达量分别是蛹期的1.36、2.47和1.40倍,幼虫期表达量显着高于蛹期；在幼虫不同组织部位中的表达量相对一致,没有显着差异。分别以氯虫苯甲酰胺抗性小菜蛾品系ZC-R和室内敏感品系Roth为材料,利用PxRyR碱基13,349位存在的保守替换位点作为抗性、敏感个体的分子标记,通过遗传分析发现氯虫苯甲酰胺抗性与PxRyR基因连锁。对抗性和敏感品系PxRyR基因羧基端1691个氨基酸序列进行了比对分析,发现抗性品系ZC-R在氨基酸4790(I到K)和4946(G到E)位存在50%和41%的突变频率,遗传分析结果表明G4946E点突变与氯虫苯甲酰胺抗性具有相关性。以β-actin和EF-1α基因为内参的定量PCR分析表明,ZC-R品系PxRyR基因mRNA表达量仅为室内敏感品系Roth和室内对照品系SZ的41-46%。上述研究结果表明,小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性与鱼尼丁受体基因连锁,该基因可能通过氨基酸点突变、mRNA表达下调或两者协同作用导致高水平抗性的形成。
王利华[9]2007年在《烟粉虱对高效氯氰菊酯和阿维菌素抗性的生化和分子机理》文中提出一、烟粉虱生物型鉴定利用西葫芦接虫法、酯酶同功酶电泳和线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(mtDNACOⅠ)基因序列比较等方法对南京(NJ)品系烟粉虱生物型进行了鉴定。NJ品系烟粉虱接种西葫芦后能诱导西葫芦产生银叶症状，其酯酶同功酶谱与Q型烟粉虱明显不同，mtDNA COⅠ基因片段序列与B型烟粉虱同源性达98％以上，这些结果说明NJ品系的生物型为B型。二、烟粉虱钠通道基因克隆与抗性相关突变检测通过RT-PCR克隆了烟粉虱钠离子通道结构域ⅡS4-6cDNA片段，发现位于925位亮氨酸到异亮氨酸的突变(L925I)与拟除虫菊酯抗性相关，并建立了L925I突变的PASA检测技术。与SUD-S敏感品系相比，NJ品系对高效氯氰菊酯有266倍的抗性，采用高效氯氰菊酯对该种群进行多次筛选后获得NJ-R1品系，对高效氯氰菊酯的抗性提高到785倍。PASA检测结果表明NJ-R1品系中100％个体都具有L925I突变(61.1％的个体为L925I突变纯合子，38.9％的个体为杂合子)，而未筛选的NJ品系只有75％个体具有L925I突变(35％个体为L925I突变纯合子，40％的个体为杂合子，25％的野生型)，该结果表明烟粉虱钠离子通道L925I突变与其对高效氯氰菊酯的抗性密切相关。叁、Kdr突变和代谢酶在B型烟粉虱对高效氯氰菊酯抗性中的相对作用NJ品系对高效氯氰菊酯有266倍的抗性(与SUD-S品系相比)。通过对NJ品系进行群体筛选和单对交配筛选分别获得NJ-R1和NJ-R2品系，其对高效氯氰菊酯的抗性分别达到785和2634倍。增效试验表明PBO对这叁个品系的增效作用均为20倍左右，因为在烟粉虱中PBO即是多功能氧化酶抑制剂，也是酯酶抑制剂，而谷胱甘肽S-转移酶与抗性无关，因此推断代谢酶在B型烟粉虱对高效氯氰菊酯的抗性发展中起到的相对作用可能为20倍左右，而且这种抗性是B型烟粉虱天生的；TPP(酯酶的专一性抑制剂)对NJ品系的增效作用为12倍，说明PBO增效作用主要是由于抑制酯酶而引起的，即代谢抗性大部分由酯酶所贡献。在解除代谢酶的作用后(通过PBO处理)，NJ-R2、NJ-R1和NJ叁个品系对高效氯氰菊酯的抗性分别为149，40和14倍，这部分抗性由kdr突变所贡献．这一结果说明kdr突变频率是B型烟粉虱对拟除虫菊酯抗性水平的决定因子，因为NJ-R2品系为L925I突变纯合子，所以推测kdr突变的最大贡献可达约150倍．四烟粉虱对阿维菌素的抗性筛选和抗性生化机理采用群体筛选方法，用阿维菌素对采自南京地区的B型烟粉虱品系(NJ)连续筛选18代后获得一个对阿维菌素具有14.5倍抗性的品系(NJ-Abm)．NJ-Abm对锐劲特没有交互抗性，对吡虫啉和阿维菌素类似物-甲氨基阿维菌素苯甲酸盐分别有3.4倍和4.4倍的交互抗性．与NJ品系相比，NJ-Abm品系的多功能氧化酶和谷胱甘肽S-转移酶活性分别提高了2.1和2.0倍．增效剂PBO和DEM对NJ-Abm品系分别有3.9和4.1倍的增效作用，对NJ品系的增效作用分别为1.6和1.3倍，TPP对两个品系都没有增效作用．这些结果说明多功能氧化酶和谷胱甘肽S-转移酶活性上升是烟粉虱NJ-Abm品系对阿维菌素产生抗性的主要原因．五烟粉虱谷氨酸受体基因cDNA的克隆和序列分析采用RT-PCR和RACE技术，首次获得B型烟粉虱谷氨酸受体α亚基cDNA全长序列，将该基因命名为BtGluCla1．BtGluCla1cDNA序列长1353bp，编码450个氨基酸．Blast基因树显示BtGluCla1与果蝇谷氨酸受体α亚基同源性最高(81％，NP_732447)，与昆虫谷氨酸受体α亚基亲缘关系较近，与线虫谷氨酸受体亚基亲缘关系较远．Expasy蛋白质功能区分析结果表明，BtGluCla1亚基包括一个配基结合位点，九个磷酸化位点和构成半胱氨酸环的四个半胱氨酸残基位点；TMHMM压跨膜区预测结果表明BtGluCla1亚基有四个靠近C端的跨膜区．比较敏感(NJ)和抗性(NJ-Abm)品系BtGluCla1cDNA序列，发现在NJ-Abm品系中存在8个氨基酸多态性位点，NJ品系中只有3个．另外，在NJ和NJ-Abm品系中均存在一个缺失跨膜区Ⅳ的谷氨酸受体基因，命名为dBtGluCla1．在NJ品系cDNA中dBtGluCla1出现频率为20％，在NJ-Abm品系cDNA中dBtGluCla1出现的频率大于80％。单头烟粉虱成虫BtGluCla1基因组DNA序列分析表明，BtGluCla1和dBtGluCla1由不同的基因编码，由此推测抗性和敏感品系dBtGluCla1出现频率的差异可能是这两个基因相对表达量的不同而造成的．
王兴全[10]2008年在《二斑叶螨对甲氰菊酯的生化抗性机理研究》文中认为二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)是果树、蔬菜和农作物上危害最为严重的害螨种群,长期以来主要使用菊酯类杀螨剂来防治,如甲氰菊酯等。菊酯类杀螨剂由于对害螨毒力高,与环境相容性好,对人畜低毒,无残留污染,对天敌安全等特性,成为我国果树蔬菜生产中害螨防治的支柱品种。但大量、单一和连续使用,带来了二斑叶螨等各种害螨的抗药性。本文通过雌雄单系扩繁二斑叶螨,室内培育二斑叶螨抗甲氰菊酯品系,用15种常用杀螨剂对二斑叶螨抗甲氰菊酯品系进行交互抗性测定,为农药的合理轮换和混用,提供了可靠的理论依据;对抗性品系进行生理生化分析,明确二斑叶螨抗甲氰菊酯品系体内解毒酶的变化与抗药性的关系,为二斑叶螨对菊酯类农药的酶学抗性监测技术奠定理论基础。本文获得了以下主要研究结果:1二斑叶螨对甲氰菊酯抗性选育及交互抗性测定二斑叶螨敏感种群采自甘肃省兴隆山,通过雌雄单系扩繁。室内用甲氰菊酯对二斑叶螨进行药剂培育抗性品系。二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性上升可分为5个阶段:F_3～F_5、F_5～F_(11)、F_(11)～F_(12)、F_(12)～F_(14)和F_(14)～F_(19);当筛选19代后,抗性倍数达88.37倍;表明二斑叶螨对甲氰菊酯很容易产生抗药性,如果继续筛选,二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性还会继续上升。对15种常用杀螨剂的交互抗性测定结果表明,该种群对叁氯氟氰菊酯(抗性指数12.21倍)和苦皮藤生物碱(10.82倍)有明显交互抗性;对氧乐果、苯丁锡、唑螨酯、氯氰菊酯及叁唑锡交互抗性次之,达6.35倍,7.54倍6.878倍、9.79倍、和6.65倍。2二斑叶螨对甲氰菊酯抗性的生化机制二斑叶螨抗甲氰菊酯品系(FeR)与敏感品系(susceptible strain,S)的羧酸酯酶(carboxylesterases,CarE)活性差异显着,抗性品系(FeR)的酶活力为敏感品系(S)的酶活力的1.0969倍;在相同的反应条件下,羧酸酯酶(CarE)活性随着酶液浓度的增加,吸光值也逐渐增加,当酶液浓度为2.5头/mL时,抗性品系的吸光值为0.27,而敏感品系的吸光值为0.245,相对抗性倍数为1.102倍,这说明在任何一个阶段羧酸酯酶(CarE)的活性都与抗性增强有关。抗性种群体内酸性磷酸酯酶(Phosphatase,acid,ACP)、碱性磷酸酯酶(Alkalinephosphatase,AKP)的活性分别为0.1410μM/mg.pr/30min和0.1181μM/mg.pr/30min,而在敏感品系中ACP、AKP的活性较低,活力分别为0.1328μM/mg.pr/30min、0.0072μM/mg.pr/30min,二斑叶螨抗、感品系磷酸酯酶活性有差异,这说明二斑叶螨対甲氰菊酯抗性的产生与磷酸酯酶的活性相关,磷酸酯酶活性升高是二斑叶螨对甲氰菊酯产生抗性的原因之一。通过测定在3min内吸光值(OD值)的变化,随着时间的变化,敏感品系(S)谷胱甘肽-S转移酶(Glutathione S-transferase, GSTs)的活性呈下降趋势,而抗性品系(FeR)的活性除了在40s前之外,其他都高于敏感品系(S),表明了FeR品系谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活力增高,导致二斑叶螨对甲氰菊酯产生抗药性,并随时间的增长,抗性逐渐增高。多功能氧化酶氧脱甲基(Mixed function oxidase,MFOs)是重要的解毒酶之一,抗性品系( 0.1628mmol·L~(-1)·mg-1Pro·(30min)~(-1) )的活性为敏感品系( 0.0550 mmol·L~(-1)·mg~(-1)Pro·(30min)~(-1))的2.9471倍,在本实验检测的叁种解毒酶中抗性倍数最大,抗性品系活力高于敏感品系0.1078 mmol·L~(-1)·mg-1Pro·(30min)~(-1),表现出极显着差异性,这说明MFOs在二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性生化机理中起到举足轻重的作用,可能为二斑叶螨对甲氰菊酯产生抗性的关键酶。3河西3地区二斑叶螨对7种常用杀虫杀螨剂抗性测定为了明确甘肃省河西地区二斑叶螨对常用农药的田间抗性状况,采用室内生物测定方法,对采自武威、张掖和酒泉叁地区的二斑叶螨种群对7种药剂进行抗性测定。结果表明:3个地区的二斑叶螨对7种药剂都有不同程度的抗性,3地区二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性水平相似,属于中等抗性水平;对于高效氯氟氰菊酯的抗性顺序为:武威种群>张掖种群>酒泉种群;二斑叶螨对阿维菌素、叁氯杀螨醇、哒螨灵的抗性较低。
参考文献：
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[9]. 烟粉虱对高效氯氰菊酯和阿维菌素抗性的生化和分子机理[D]. 王利华. 南京农业大学. 2007
[10]. 二斑叶螨对甲氰菊酯的生化抗性机理研究[D]. 王兴全. 甘肃农业大学. 2008
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