谢军 彭贤东 王伟
（四川省南充市中心医院药学部 四川 南充 637000）
【摘要】 目的：建立替硝唑螺内酯乳膏的微生物限度检查方法。方法：使用常规法、培养基稀释法对替硝唑螺内酯乳膏进行验证，通过比较回收率来确定适宜的检验方法。结果：采用培养基稀释法（0.1mL／皿）进行细菌计数；采用常规法进行霉菌、酵母菌和控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）检查。结论：所建立的微生物限度检查方法可用于替硝唑螺内酯乳膏微生物限度检查，消除本品抑菌活性对试验的干扰。
【关键词】替硝唑螺内酯乳膏；微生物限度检查法；抑菌作用
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）10-0118-02
替硝唑螺内酯乳膏是我院研制的用于治疗寻常痤疮的复方制剂。主要成分为具有杀灭痤疮丙酸杆菌作用的替硝唑和选择抑制皮脂腺分泌作用的螺内酯，两者联用质量稳定、可控，疗效确切，不良反应少[1-2]。根据2010年版《中国药典（二部）》[3]及参考文献[4-5]对替硝唑螺内酯乳膏微生物限度检查方法的建立进行探讨。
1.材料
1.1 仪器
DC82型隔水式电热恒温培养箱（上海南汇老港机械厂）；LRH-150B型生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）。
1.2 药品与试液
供试品：替硝唑螺内酯乳膏（南充市中心医院自制，批号：140611，规格：每10g含替硝唑200mg与螺内酯30mg）；稀释液：0.9﹪无菌氯化钠溶液，5%聚山梨酯80-pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.3 培养基
营养琼脂培养基（批号120329）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号140303）；营养肉汤培养基（批号140120）；甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号120424）；胆盐乳糖培养基（批号1402102）；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号130618）均由中国药品生物制品检定所提供。
1.4 菌种
大肠埃希菌 [CMCC(B) 44102]；金黄色葡萄球菌 [CMCC(B) 26003]；铜绿假单胞菌 [CMCC(B) 10104]；枯草芽孢杆菌 [CMCC(B) 63501]；白色念珠菌 [CMCC(F) 98001]；黑曲霉 [CMCC(F) 98003] 均为第三代，由四川省药品质量研究所提供。
2.方法与结果
2.1 供试液的制备
取本品10g，加5%聚山梨酯80-pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，在45℃水浴中放置约20分钟，并不时振摇使其分散均匀，制成1:10供试液。
2.2 回收率计算
计算公式：试验组的菌回收率=[(试验组的平均菌落数－供试品溶液对照组的平均菌落数)／菌液组的平均菌落数]×100%；
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.3.1平皿法 取供试液1mL和金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌和黑曲霉各1mL，分别注入平皿中，前三种试验菌用营养琼脂培养基培养，白色念珠菌和黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基培养。各平行制备两皿，作为试验组。取试验菌各1ml注入平皿，用适宜的培养基培养，作为菌液组。取供试液1mL注入平皿，作为供试液对照组。分别置规定温度培养、观察。实验结果见表1。白色念珠菌和黑曲霉回收率高于70%，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌的回收率均低于70%。该品种有抑菌作用，不能采用平皿法进行细菌计数。
按培养基稀释法（0.1mL/皿）平行二次试验，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌的回收率均大于70%，说明此方法可消除本品对细菌的抑菌作用。可按该方法进行细菌的计数。
2.4 控制菌检查法验证
2.4.1菌液的制备 取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1mL，用0.9﹪无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。
2.4.2金黄色葡萄球菌检查 取供试液10mL，分别接种至3瓶200mL营养肉汤培养基中，其中一瓶加入1mL金黄色葡萄球菌（10～100个/mL）为阳性菌对照，一瓶加入1mL大肠埃希菌（10～100个/mL）为阴性菌对照，按金黄色葡萄球菌检查法检验，结果见表3。
表3 常规法检查样品中控制菌-金黄色葡萄球菌结果
检验组别营养肉汤甘露醇氯化钠琼脂平板结论
供试液澄清-未检出
阳性对照浑浊+检出
阴性对照澄清-未检出
阳性菌对照中检出金黄色葡萄球菌，阴性菌对照未检出金黄色葡萄球菌。表明本品的金黄色葡萄球菌检查可按常规方法。
2.4.2铜绿假单胞菌检查 取1:10供试液10mL，分别接种至3瓶100mL胆盐乳糖培养基中，其中一瓶加入1mL铜绿假单胞菌（10～100个/mL）为阳性菌对照，一瓶加入1mL金黄色葡萄球菌（10～100个/mL）为阴性菌对照，按铜绿假单胞菌检查法检验，结果见表4。
表4 常规法检查样品中控制菌-铜绿假单胞菌结果
检验组别胆盐乳糖培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂平板结论
供试液 澄清 - 未检出
阳性对照 浑浊 + 检出
阴性对照 澄清 - 未检出
阳性菌对照中检出铜绿假单胞菌，阴性菌对照未检出铜绿假单胞菌。由以上结果可见，本品可采用常规法可进行铜绿假单胞菌检查。
3.讨论
替硝唑螺内酯乳膏是具有一定抑菌作用的制剂。根据文献[3]规定，具有抑菌成分的药物进行微生物限度检查时，要求供试品自身在试验条件下能有效地排除其抑菌作用。上述验证试验所建立的微生物限度检查方法可消除本品抑菌活性对试验的干扰，可按培养基稀释法（0.1ml/皿）进行细菌计数；采用常规平皿法进行霉菌、酵母菌测定；采用常规法进行控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）检查。
【参考文献】
[1] 彭贤东,唐志立,龙凤等.HPLC法测定替硝唑螺内酯乳膏的含量[J].西北药学杂志,2013,28（2）:145-147.
[2] 彭贤东,唐志立,龙凤等.替硝唑螺内酯乳膏治疗寻常痤疮62例[J].中国药业,2010,19（17）:77-78.
[3] 国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：附录107-116．
[4] 由亚宁，彭霞．两种规格奥硝唑微生物限度检查方法的建立[J]．中国药业，2010，19（15）：31-32．
[5] 姚华，李慧娥，罗世书等．人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法的探讨[J]．中国药品标准，2009，10（4）：281-283．
论文作者:谢军,彭贤东,王伟
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第10期供稿
论文发表时间:2015/7/20
标签：培养基论文; 替硝唑论文; 葡萄球菌论文; 内酯论文; 铜绿论文; 金黄色论文; 检出论文; 《医药前沿》2015年第10期供稿论文;