张黎[1]2004年在《豆类丝核菌次级代谢产物的生物效应研究》文中指出目的：筛选出生长稳定，产生SW量大的优良的豆类丝核菌菌株，为该菌进行发酵动力学研究奠定基础，并获得该菌在生长及形态上的系统鉴定资料；同时研究该菌的次级代谢产物的抗肿瘤病理及免疫效应，从而探索SW的抗肿瘤应用；探索该菌或其次级代谢产物的动植物损害在细胞生物学上的关系，从而为SW的毒理学研究及肿瘤病理学研究提供新的研究思路。方法：①通过野外分离和保存菌株复活纯化方法，获得生长稳定的豆类丝核菌，并进通过光学显微镜和扫描电镜进行形态学鉴定，对不同菌株分别与标准菌和相互进行菌丝融合试验。②将筛选分离的稳定菌株用改良的Czapek’s培养基进行培养，获得豆类丝核菌次级代谢产物，并通过气相色谱法测定其苦马豆素（Swainsonine,SW）含量。③通过建立种植性肝癌（H22）实体瘤动物模型，并给荷瘤小鼠灌胃含有SW且剂量分别为2.7/mg/kg/d（Ⅱ组）和16.2mg/kg/d（Ⅲ组）的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液，分别于不同时间测定荷瘤鼠T淋巴细胞活化指数（SI）、肿瘤抑制率和腹腔巨噬细胞吞噬百分率和剖检荷瘤动物并取肿瘤组织与肝组织进行病理组织学和电镜观察。④制作豆类丝核菌次级代谢产物污染的饲料和人工污染豆类丝核菌饲料，饲喂家兔17d ,剖检家兔并取其脑、肝脏、肾脏等组织分别进行病理组织学和电镜观察；同时将不同浓度的次级代谢产物和不同株的豆类丝核菌分别污染回接的绿豆，待84h培养后，分别进行组织学和电镜观察。结果与小结：① 获得6株生长稳定的菌株，且6株菌属于同一菌种的不同融合群，均具有豆类丝核菌的形态特征，属于豆类丝核菌，其产生的次级代谢产物中含有大量的SW，02-6B和02-3A代谢产生的 SW 较高，分别达到1 093.17 mg·L-1和1 199.64 mg·L-1。②在抗肿瘤试验中，Ⅲ组SI在8d时显着升高，明显高于对照组（Ⅰ组）的1.333±0.053，达到1.670±0.527（P<0.05）。Ⅲ组荷瘤动物腹腔巨噬细胞吞噬率在灌药后8d时也显着高于肿瘤对照组（Ⅰ组）的腹腔巨噬细胞吞噬率（P<0.05），达到33.99±1.56％。Ⅱ、Ⅲ两组肿瘤抑制率8d时分别为26.44％和33.91％，16d时分别为46.98％和47.24％。Ⅱ组与Ⅲ组在8、16d时肿瘤细胞出现大量且严重的脂肪变性及大面积坏死，且坏死区呈网络状，将瘤组织分割成小的瘤细胞团。表明该次级代谢产物能够使荷瘤动物细胞免疫应答增强，并能抑制种植性实体瘤（H22）的生长和转移；其中含SW16.2mg/kg/d剂量标准的次级代谢产物对荷瘤动物的免疫增强作用与抗肿瘤作用明显。③在对动植物细胞损害作用中，豆类丝核菌次级代谢产物使家兔脑组织和淋巴细胞空泡变性，神经细胞核糖体脱颗粒，粗面内质网扩张等；同时能使植物根部组织结构受
杨萍[2]2007年在《豆类丝核菌次级代谢产物对阿霉素毒性的保护作用及其联合抗肿瘤作用研究》文中认为目的:复制阿霉素(adriamycin,ADR)诱导小白鼠骨髓抑制及心肌损伤模型,为探索豆类丝核菌次级代谢产物对其毒性的保护作用提供动物模型;通过血常规、心电图、生化指标、病理学观察等方面研究该代谢产物对损伤动物的保护作用;探索两者联合应用的体内外抗肿瘤作用,为该代谢产物在抗肿瘤方面的应用提供新的思路。方法:①分别给小白鼠腹腔注射2mg·kg-1、4mg·kg-1、6mg·kg-1的ADR,隔日一次,共五次,或一次腹腔注射ADR20mg·kg-1,建立能够造成动物骨髓抑制及心肌损伤的方法。②给小白鼠注射阿霉素的同时灌胃豆类丝核菌次级代谢产物,其苦马豆素(Swainsonine, SW)含量分别为8mg·kg-1、16mg·kg-1、32mg·kg-1,末次用药24h后检查小鼠血常规;描记心电图;测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活力,心肌超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量;并对心肌进行病理组织学观察,探索豆类丝核菌次级代谢产物对阿霉素所致小鼠骨髓抑制及心肌损伤的保护作用并确定保护剂量。③建立移植性肉瘤S180动物模型,随机分为四组,对照组(Ⅰ组,生理盐水组)、代谢产物组(Ⅱ组,SW16 mg·kg-1)、ADR组(Ⅲ组,ADR2.5mg·kg-1)、联合用药组(Ⅳ组,SW16 mg·kg-1+ADR2.5mg·kg-1),末次用药48h后计算肿瘤抑制率、小鼠脾指数、测定荷瘤小鼠T淋巴细胞活化指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能,并剖检动物,取瘤组织与心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行病理组织学观察。④以不同浓度的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液(10、5、2.5、1.25、0.62、0.31μg·ml-1)作用于对数生长期的人肝癌细胞株HepG2,测定其72h后的IC50。以该代谢产物的IC50与阿霉素(60μg·ml-1、6μg·ml-1)联合作用于肝癌细胞,72h后,测细胞存活率。结果:①ADR以4 mg·kg-1隔日腹腔注射5次可以造成小白鼠骨髓及心肌损伤。②豆类丝核菌次级代谢产物(SW含量为16mg·kg-1、32mg·kg-1)对ADR诱导的骨髓抑制和心肌损伤具有一定的保护作用,可抑制ADR引起的白细胞数、红细胞数、血红蛋白量的减少;使心率加快,心电图Q波振幅减小,QRS波时间缩短和S-T段回升;降低血清CK、LDH活力,增强心肌SOD活力,降低MDA含量,减轻心肌组织损伤。③在体内抑瘤实验中,Ⅳ组抑瘤率最高(达64%),表明两药联合具有相加作用;Ⅳ组小鼠的脾指数为38.97±4.03,高于Ⅲ组的24.90±1.4(3p<0.01),T淋巴细胞活化指数为1.22±0.03,高于Ⅲ组的1.12±0.04(p<0.05),且瘤组织中坏死面积较大,证明SW一方面直接作用于瘤细胞,另一方面通过调节机体免疫水平发挥抗肿瘤作用。④体外实验结果显示,随着豆类丝核菌次级代谢产物中SW含量的增加,肝癌细胞HepG2的存活率下降,其作用72h的IC50为1.25μg·ml-1;但将该代谢产物与ADR联合作用于HepG2细胞,却不具有相加作用,可能是由于SW对机体的免疫调节作用在抗肿瘤过程中发挥了较重要的作用。结论:①ADR以4mg·kg-1隔日腹腔注射共5次可以建立小白鼠骨髓抑制及心肌损伤模型;②豆类丝核菌次级代谢产物16mg·kg-1、32mg·kg-1(以SW含量计)对ADR造成的骨髓抑制及心肌损伤具有保护作用;③SW与ADR联合使用对抑制小鼠移植性肉瘤S180具有相加作用,但对人肝癌细胞HepG2不具有相加作用。
张伟[3]2009年在《豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠生殖毒性的研究》文中认为目的:将本实验室原有的3.2871A株豆类丝核菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上传代,再将传代后、生长良好的3.2871A株豆类丝核菌接种于改良的Czapek's培养基内,制备出无污染的该株菌次级代谢产物,利用传统的一般生殖毒性试验和围产期毒性试验检验其对小白鼠是否具有该方面毒性。通过整个试验,对3.2871A株豆类丝核菌次级代谢产物的安全性做出了初步评价,为其将来作为一种新型抗肿瘤药应用于临床奠定了理论基础。方法:(1)制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。(2)将原有的3.2871A株豆类丝核菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上,传代培养7d。(3)将培养7d后的、生长良好的该株菌接种到改良的Czapek's培养基内,培养14d。(4)对培养14d后的Czapek's培养基进行处理,制备出该株菌次级代谢产物。(5)检验豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠有无一般生殖毒性,将3.2871A株豆类丝核菌次级代谢产物配制成高、中、低叁个剂量,给小鼠灌胃,雄鼠交配前连续灌胃给药28d,雌鼠交配前连续灌胃给药14d,均1次/d,0.2mL/10g体重。雌雄按1:1比例交配。雌鼠交配成功后继续给药13d(至多器官形成期)。雄鼠给药期间每周称一次体重,交配成功后处死,检测相关指标。半数雌鼠于交配成功后第14d处死,解剖观察胎鼠情况,半数自然生产,连续观察仔鼠至第28d。(6)检验豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠有无围产期毒性,将60只小鼠按雌雄2:1的比例交配,待有20只雌鼠交配成功后,停止交配。将成功受孕0d的母鼠按体重随机分为正常对照组,豆类丝核菌次级代谢产物56.62mg/kg、14.15mg/kg、3.54mg/kg 4个组。母鼠妊娠后第15d到分娩后第21d连续给药,1次/d,0.2mL/10g体重。(7)根据一般生殖毒性试验结果和围产期毒性试验结果对豆类丝核菌次级代谢产物的生殖毒性作出评价。结果:(1)7d后马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上长出大量豆类丝核菌,长出的新菌与原代菌一样,菌丝深褐色,菌丝上散布有黑色菌核。(2)14d后的Czapek's培养基上漂浮有一层深黑色的菌苔,像发黑的蘑菇,菌苔下面的培养液为深黄色,清亮,悬浮物质少,与文献报道一致。(3)对一般生殖毒性试验数据分析后表明,高剂量组药物对雄鼠、雌鼠、仔鼠均有影响,表现为雄鼠附睾重量(P<0.01)、附睾系数(P<0.05)、精子总数(P<0.01)的异常;雌鼠体重的下降(P<0.05)以及仔鼠第4d成活率的降低(P<0.05)。中剂量药物使雄鼠附睾重量(P<0.01)和附睾系数(P<0.05)降低并造成精子总数增多(P<0.05)。低剂量药物则对所有指标无显着影响(P>0.05)。(4)在围产期毒性试验中,高剂量组药物造成仔鼠体重(P<0.01)、游泳生存时间(P<0.05)、内脏指数(P<0.05)、生理发育指标(P<0.05)和反射发育指标(P<0.05)异常。中剂量组药物对母鼠、仔鼠均有影响,表现为母鼠体重(P<0.05)、仔鼠体重(P<0.05)、游泳生存时间(P<0.01)、内脏指数(P<0.01)、反射发育指标(P<0.01)异常。低剂量组药物则导致仔鼠体重(P<0.01)、游泳生存时间(P<0.01)、生理发育指标(P<0.05)、反射发育指标(P<0.01)异常。结论:(1)高、中剂量组药物对小鼠有一般生殖毒性,低剂量组药物无该方面毒性。(2)高、中、低剂量组药物对小鼠均有围产期毒性,在临床应用时,孕妇应禁用。
郭卫华[4]2009年在《豆类丝核菌次级代谢产物对化疗致骨髓抑制的保护及对肝肾功能的影响》文中研究表明目的:环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)诱导小白鼠骨髓抑制模型。为探索豆类丝核菌次级代谢产物对其毒性的保护作用提供动物模型;通过血常规、脾脏指数、脾集落形成单位(CFU-S)、骨髓有核细胞(BMC)数、骨髓细胞增殖试验、病理学观察等方面研究该代谢产物对损伤动物的保护作用;探索两者联合应用对小鼠肝肾功能的影响,为该代谢产物在今后肿瘤化疗方面的应用提供新的思路。方法:①分别给小白鼠腹腔注射40 mg/kg、80 mg/kg的CTX,每日一次,共叁次,或一次腹腔注射CTX 160 mg/kg,建立能够造成骨髓抑制的动物模型。②给小白鼠注射CTX的同时灌胃豆类丝核菌次级代谢产物,其苦马豆素(Swainsonine,SW)剂量分别为8、16、32 mg/kg,末次用药24h后检查小鼠血常规;脾脏指数;脾集落形成单位(CFU-S);骨髓有核细胞(BMC)数;骨髓细胞增殖试验。探索豆类丝核菌次级代谢产物对CTX所致小鼠骨髓抑制的保护作用及可能机制,并确定保护剂量。③将豆类丝核菌次级代谢产物与CTX两者联合应用,随机均分为5组:Ⅰ组(正常对照组);Ⅱ组(CTX对照组);Ⅲ组(SW 8 mg/kg + CTX 100 mg/kg);Ⅳ组(SW 16 mg/kg + CTX 100 mg/kg);Ⅴ组(SW 32 mg/kg + CTX 100 mg/kg)。末次用药24h后采血制备血清,测定血清中总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cre),并剖检动物取肝脏、肾脏进行病理组织学观察。结果:①CTX以80 mg/kg连续腹腔注射3次可以造成小鼠骨髓抑制。②豆类丝核菌次级代谢产物(SW剂量为16 mg/kg)对CTX诱导的骨髓抑制有一定的保护作用,可较好地抑制CTX引起的WBC、RBC、HgB、BMC的减少;各剂量的SW能明显增加CFU-S数,其中以SW16mg/kg效果最佳。而当SW为8mg/kg时,能很好的刺激骨髓细胞增殖。③肝肾功能影响的试验中,Ⅱ组血清中ALT、ALP、BUN、Cre最高,与Ⅱ组相比,Ⅰ组和Ⅲ组血清中ALT、ALP均达到显着性差异(P<0.05) ;Ⅳ组BUN极显着低于Ⅱ组(P<0.05);Ⅱ组Cre与Ⅰ组Cre相比,明显高于Ⅰ组(P<0.05);各组间TP接近,无显着性差异。结论:①CTX以80 mg/kg连续腹腔注射3次可以造成小鼠骨髓抑制。②豆类丝核菌次级代谢产物(SW剂量为8、16 mg/kg)对CTX诱导的骨髓抑制具有一定的保护作用。③豆类丝核菌次级代谢产物(SW剂量为8 mg/kg)对CTX诱导的小鼠肝功能有一定改善作用,而对肾的影响不明显。
张志敏[5]2008年在《苦马豆素对小鼠免疫功能的影响及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理苦马豆素(swainsonine, SW)是豆科黄芪属和棘豆属有毒植物(疯草)的主要有毒成分,其分子质量小,化学本质为多羟基吲哚里西啶生物碱。由于疯草分布广泛,国内外在疯草的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展,但目前,对SW免疫毒理学的研究还未广泛展开。SW是α-甘露糖苷酶抑制剂,通过抑制细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶Ⅰ的活性,影响糖蛋白的代谢,导致细胞空泡变性;根据SW可抑制高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性,国外学者对其抗肿瘤和免疫调节活性进行了研究,发现其医用前景广阔。了解SW与机体免疫功能之间的关系及弄清其影响免疫功能的细胞和分子机制,无疑将为SW的抗肿瘤临床应用和毒性作用机理研究提供理论依据,同时也将对疯草资源的合理利用起到现实指导意义。本研究首先从变异黄芪中提取SW,然后以小鼠为实验动物,初步探讨SW与小鼠免疫功能之间的关系。为研究SW影响小鼠免疫功能的细胞和分子机制,试验采用淋巴细胞转化增殖试验MTT法、流式细胞术、ELISA法、NOS酶法、化学比色法以及吞噬杀伤试验,检测了正常小鼠和环磷酰胺所致免疫抑制小鼠在灌服不同剂量SW后,淋巴细胞增殖效果、T细胞亚群的变化、腹腔巨噬细胞吞噬杀伤活性以及在免疫应答调节中起重要作用细胞因子TNF-α、H2O2分泌量和NOS活性的变化,结果如下:1.从变异黄芪中提取出SW,提取率为25 mg/kg;提取物经高压气相色谱测得SW纯度为98.17%。2.给小鼠灌服5个不同剂量的SW生理盐水溶液,每天1次,连续21 d,研究SW与小鼠免疫功能之间的关系。结果发现,SW剂量为6.4 mg/kg时,小鼠免疫器官胸腺和脾脏指数减小;外周血液中白细胞、红细胞、淋巴细胞、粒细胞数减少,血红蛋白含量降低;血清中TNF-α与H2O2分泌量减少,NOS活性降低;病理组织学发现肝脏、脑、脾脏、肾脏组织细胞中出现空泡变性,表明SW剂量达到6.4 mg/kg时对小鼠具有一定的免疫毒性。SW低于6.4 mg/kg剂量时,病理组织学检查小鼠肝脏、脑、脾脏和心肌细胞排列整齐,结构清晰,未见异常;且SW在0.2～0.8 mg/kg之间,可以提高小鼠胸腺和脾脏指数、血液中白细胞和淋巴细胞数、血红蛋白含量,血清中TNF-α和H2O2分泌及NOS活性增强。3.用血清溶血素试验检测SW对小鼠血清抗体溶血素的影响。结果发现,SW在0.05～3.2 mg/kg剂量范围内,小鼠血清溶血素值没有变化;SW在6.4 mg/kg时,血清溶血素值下降。表明低剂量SW不会引起小鼠特异性体液免疫反应,剂量达到6.4 mg/kg时可引起特异性体液免疫活性降低。4.用淋巴细胞转化试验MTT法检测SW体外对淋巴细胞增殖活性的影响。取正常小鼠脾脏淋巴细胞,用不同浓度SW单独作用及协同丝裂原刺激下,测定淋巴细胞的增殖效果。结果表明,在SW浓度为0.2μg/mL,其单独或协同ConA、PHA-P作用时,能够刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖;SW协同LPS作用时,对其增殖活性没有影响。SW浓度为4μg/mL时,淋巴细胞的增殖均受到抑制。5.用淋巴细胞转化试验MTT法检测SW体内灌服后,对正常小鼠和环磷酰胺所致免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖能力的影响。结果发现,SW单独作用或协同ConA、PHA-P刺激时,SW在0.2～0.8 mg/kg剂量范围内,正常小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性增强;SW剂量为0.8 mg/kg时,可以拮抗免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖活性,但未能使其增殖活性恢复到正常水平;SW协同LPS刺激时,淋巴细胞增殖活性变化均不明显。SW剂量6.4 mg/kg时,其单独作用或协同各种丝裂原下,正常小鼠淋巴细胞增殖活性均受到抑制;免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖受抑制作用进一步加强。6.用流式细胞术检测小鼠外周血液淋巴细胞数时发现,SW剂量为0.8 mg/kg或0.2 mg/kg时,可以显着提高正常小鼠或免疫抑制CD3+和CD4+T细胞数,CD4+/CD8+比值均增大。结果表明,外周血液中CD3+和CD4+T淋巴细胞数和CD4+/CD8+比值的变化,与SW改善小鼠特异性细胞免疫功能有关。7.对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能检测结果发现,SW剂量在0.2～0.8 mg/kg之间,能提高正常小鼠和免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬中性红和杀伤肿瘤细胞的活性,并能刺激巨噬细胞培养上清液中TNF-α和H2O2的分泌及NOS活性,表明低剂量SW可以通过提高NOS活性介导巨噬细胞信号传递通路,促进TNF-α和H2O2生成,发挥其吞噬和杀伤功能。SW剂量在6.4 mg/kg时,对正常小鼠和免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能具有明显的抑制作用。以上结果表明,SW对小鼠免疫功能的影响具有双向调节作用,该作用与SW的作用剂量密切相关;高剂量SW对小鼠的细胞免疫和体液免疫功能具有明显的抑制作用;低剂量SW主要通过改变小鼠特异性和非特异性细胞免疫功而发挥其免疫效应。
杨国栋[6]2012年在《疯草内生真菌合成苦马豆素的研究》文中指出疯草是世界范围内危害草原畜牧业发展的最为严重的毒草之一，大量研究表明，苦马豆素是疯草的主要有毒成分。近年来，从疯草中分离到能产苦马豆素的Undifilum属内生真菌；疯草中苦马豆素含量与疯草感染Undifilum属内生真菌的数量具有很高的相关性；因此，部分研究人员把疯草感染Undifilum属内生真菌并产生苦马豆素看作是动物发生疯草中毒病的根本原因(Oldrup et al.,2010; Ralphs et al.,2008)。基于本实验室对我国主要疯草内生真菌的分离鉴定和遗传特征研究，本文主要对疯草内生真菌（FEL4-F5）菌液体培养基优化、内生真菌中的苦马豆素累积特性、内生真菌中苦马豆素的液相检测方法、内生真菌合成苦马豆素的前体物筛选、碳氮标记的赖氨酸的稳定性同位素示踪等方面进行了研究，为探讨内生真菌合成苦马豆素的生物途径、筛选高效生产苦马豆素的内生真菌奠定基础。1．疯草内生真菌FEL4-F5液体培养基的优化用Plackett-Burman试验对内生真菌FEL4-F5液体培养基组分、初始pH值、培养时间、培养温度等9个因素进行考察。结果发现蔗糖、K_2HPO_4、蛋白胨这3个因素对于内生真菌FEL4-F5的苦马豆素产量有显着影响。用响应面分析法Box-Behnken design试验最终优化出的疯草内生真菌液体培养条件为:培养基配方MgSO_4·7H_2O0.6g/L，KCl0.6g/L，FeSO_40.02g/L，蔗糖15.58g/L，K_2HPO_40.62g/L，蛋白胨0.34g/L，蒸馏水1000mL；培养时间28d、温度为18℃、pH值为7.5。该结果为后续研究疯草内生真菌合成苦马豆素合成途径的相关试验奠定了基础。2．疯草内生真菌FEL4-F5产苦马豆素累积特性的研究建立了改良酶分析法检测苦马豆素的方法，在0.05～0.5μg/mL的浓度范围内，苦马豆素浓度的负对数与其抑制的甘露糖苷酶的活性比值成线性关系。线性方程为：Y=0.5169X0.1129(R~2=0.9972)。在所述的培养基和培养系统中，菌丝重量在第20天达到高峰，而菌丝中的苦马豆素含量在第28天时达到最大。结果表明，疯草内生真菌菌丝的生长和菌丝中苦马豆素的累积是不同步的。菌丝在生长至第24天时，进入苦马豆素快速合成期，第28天时菌丝中苦马豆素的合成量达到最大值。即内生真菌合成苦马豆素集中发生在其生长到第24～28天之间。这对于进一步探讨疯草内生真菌合成苦马豆素的途径有重要意义。3．疯草内生真菌中苦马豆素的HPLC-ELSD检测法建立根据苦马豆素的理化特性，对多种色谱柱、流动相进行了系统的筛选，对蒸发光检测器的运行参数进行优化，建立HPLC-ELSD检测内生真菌中苦马豆素含量的方法。色谱条件：Waters Xbridge HILIC色谱柱（150mm×4.6mm,3.5μm粒径），流动相乙腈∶乙酸铵（5mM/L）=1∶1（vol/vol）（另含0.02％氨水溶液），流动相流速0.5mL/min，进样量20μL。蒸发光检测器运行参数：气体流速25psi，漂移管温度55℃，增益值150。在15.625～250μg/mL的浓度范围内，苦马豆素浓度的对数与其对应峰面积的对数成线性关系，建立的线性方程为：Y=1.0641X+2.5679（R=0.9990）。苦马豆素的回收率在99.68～104.28％之间，R.S.D.在1.72～5.01％之间。因此，本试验所建立的色谱条件可以应用于液质联用仪，这为后续的研究疯草内生真菌合成苦马豆素合成途径的同位素示踪试验提供了技术保障。4．疯草内生真菌合成苦马豆素的前体物筛选试验在疯草内生真菌培养基中添加某些化合物，通过筛选试验发现添加L-组氨酸、脯氨酸、色氨酸、L-赖氨酸、哌可酸可对疯草内生真菌产苦马豆素的产量产生显着影响。结合已有的生源学说理论和苦马豆素生物合成途径的研究资料，认为L-赖氨酸和L-哌可酸很可能是疯草内生真菌合成苦马豆素的前体物质。5．碳氮标记赖氨酸的稳定性同位素示踪试验利用碳氮全标记的赖氨酸进行示踪试验，结果表明L-赖氨酸被标记的碳氮原子可以掺入到哌可酸和苦马豆素中，掺入率分别为88.74%和3.91%；推测在疯草的Undifilum属内生真菌中存在着一条由L-赖氨酸经哌可酸最终合成苦马豆素的合成途径。α位上的氮原子进行N~(15)标记的L-赖氨酸（C_6~(12)H_(14)N_α~(15)N_ε~(15)O_2）的示踪试验表明L-赖氨酸的α位上的氮原子能够转化到L-哌可酸中。即疯草的Undifilum属内生真菌能够通过P6C途径来实现由L-赖氨酸到L-哌可酸的转化。本研究为进一步研究合成苦马豆素详细的分子机制和动物疯草中毒病的防治提供理论依据。
杨洁[7]2012年在《枯草芽孢杆菌E1R-j产抗菌脂肽的发酵条件优化及分离纯化》文中提出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，这些抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒和菌原体等的正常生长，在植物病害防治方面具有重要的应用价值。而防治植物病害的主要活性物质是脂肽类化合物，但由于其产量不高使其应用受到限制。本研究利用一株分离自小麦根部的内生枯草芽孢杆菌E1R-j，前期试验发现，其无菌发酵滤液对小麦全蚀菌、苹果腐烂菌、小麦赤霉菌、番茄早疫菌等均具有很好的抑制作用，同时也对小麦全蚀菌具有很好的大田防治效果，为了使该菌株在生产实践中得到推广和工业化应用，本研究利用单因素和响应面法相结合的方法，以粗脂肽物质的产量为指标，对其发酵条件进行优化，同时通过质谱鉴定进一步明确具有抑菌活性物质的分子量大小。得到以下结果：1.通过优化过程中的单因素试验结果表明，温度、培养基初始pH、接种量、装液量和转速对枯草芽孢杆菌E1R-j在Landy培养基中的脂肽类物质产量均有显着影响。在单因素筛选出的因素及水平的基础上，利用响应面法确定其最佳发酵条件为：温度40℃，培养基初始pH9.0，接种量3.0%，装液量50mL，转速200rpm。在优化后的发酵条件下培养，粗脂肽物质浓度达1.39g/L，是原发酵条件下0.55g/L的2倍多，极大的提高了粗脂肽物质的产量。2.脂肽物质纯化后共得到四个组分P_1、P_2、P_3和P-4，它们的抑菌活性大小和抑菌谱各不相同，其中P1对小麦全蚀菌和番茄早疫菌有较好的抑制效果，P_2只对小麦全蚀菌有较好的抑制效果，二者的抑菌活性均小于P3；P3的抑菌活性最大，且对供试的小麦全蚀菌、苹果腐烂菌、番茄灰霉菌和番茄早疫菌都有很好的抑制效果；P_4只对小麦全蚀菌和番茄早疫菌有微弱的抑制效果。3.通过MODI-TOF-TOF/MS质谱鉴定，P_1物质组分复杂，未得到有效纯化；P2分子量为915.5576Da；P_3是分子量分别为1477.846Da，1491.898Da，1505.960Da和1513.964Da，1527.992Da的两组同系物；P_4是分子量为901.6007Da，915.6376Da和902.5656Da，916.5887Da的两组同系物。4.以小麦全蚀菌为靶标菌，研究表明P_3在80℃~121℃的高温处理后与25℃下的抑菌效果无显着差异，其对温度不敏感；P_3对蛋白酶K具有稳定性并且能在不同的有机溶剂甲醇、乙腈、丙酮中均保持活性，但在甲醇中的活性最高。
张黎[8]2007年在《玉米幼芽提取物对皮肤氧化损伤的保护作用及其机制研究》文中认为目的:研究玉米幼芽提取物(Extracts of Maize Plumule, EMP)对皮肤细胞生长发育、对氧化损伤的真皮肤细胞结构和蛋白表达的影响。评价EMP抗皮肤氧化损伤和抗衰老的效果并探讨其相关机制,初步探讨EMP对间充质干细胞生长的影响。方法:(1)原代分离获得生长稳定的小鼠皮肤成纤维细胞,通过形态观察、MTT和结构相关蛋白基因表达测定,分析EMP对其生长的影响。(2)小鼠皮肤成纤维细胞预先用EMP保护后,复制小鼠皮肤成纤维细胞体外H2O2氧化损伤模型,通过H.E染色、扫描电镜、透射电镜、Hoechst凋亡率检测、NADPH分布等手段,观察EMP对小鼠皮肤成纤维细胞的抗氧化作用;通过细胞微丝、微管的间接免疫荧光检测,观察抗氧化损伤过程中EMP对细胞骨架的影响;同时通过半定量RT-PCR法检测氧化损伤后细胞内β-Actin、Tubulin-α、I型前胶原、III型前胶原基因的表达量,从而全面分析EMP对小鼠皮肤成纤维细胞体外抗氧化作用的影响。(3)对小鼠局部皮肤脱毛后,用EMP进行保护,并对局部皮肤组织用30%的H2O2持续涂抹进行损伤,通过大体观察、病理切片和透射电镜等手段观察其病理学变化,同时检测局部皮肤组织中SOD、CAT、GSH-PX活性和MDA、羟脯氨酸含量,从而分析EMP对小鼠局部皮肤氧化损伤的影响。(4)通过给幼龄家蚕服用EMP,观察其生长和抗逆能力等相关各项生命指标,分析其抗衰老机制;并通过复制5龄家蚕局部氧化损伤模型,通过对其生长、抗逆能力、血淋巴中抗氧化酶活性和局部损伤皮肤中微管蛋白、家蚕胶原蛋白基因表达量的变化进行检测,从而分析EMP对局部皮肤氧化损伤所引起的全身抗氧化应答的影响。(5)分离获得小鼠骨髓间充质干细胞,并在培养体系中添加EMP,通过观察其生长情况、细胞周期和胶原相关基因表达情况,从而初步探索EMP对间充质干细胞生长的影响。结果:(1)在小鼠皮肤成纤维细胞培养体系中添加20 mg/L EMP经过120 h后,MTT的OD值达到1.097±0.021,显着高于其它各组(0.360±0.010～1.023±0.031)(p<0.01);其96h单视野细胞数为279.333±15.308个,显着高于对照组的133.000±32.527个(p<0.01)。(2)在细胞体外氧化损伤过程中,EMP保护组细胞骨架和亚细胞结构与损伤对照组相比更加完整,细胞凋亡率为(38.38±3.544)%,显着低于损伤对照组的(70.98±3.045)%(p<0.01);EMP保护组Tubulin-α、I型前胶原、III型前胶原基因表达产物相对灰度值分别为0.811±0.067、0.659±0.026和0.549±0.078均显着高于损伤对照组的0.628±0.055、0.237±0.035和0.217±0.040(p<0.05)。(3)在皮肤组织的体内氧化损伤过程中,EMP保护组和EMP+Vc保护组与损伤对照组相比皮肤组织结构更加完整,皮肤组织各层结构连接紧密,试验各组SOD、CAT、GSH-PX活性均显着高于损伤对照组(p<0.05或p<0.01),其中EMP保护组和EMP+Vc保护组GSH-PX活性分别为116.793±5.544和117.187±4.482,均显着高于损伤对照组的44.515±4.629(p<0.01);此外EMP保护组和EMP+Vc保护组羟脯氨酸含量分别为23.848±2.721和26.970±1.571,均高于损伤对照组的6.827±1.901(p<0.01);而MDA含量分别为10.108±1.836和7.258±1.002均显着低于损伤对照组的11.866±1.666(p<0.01)。(4)在EMP对家蚕抗衰老作用的研究中,用20mg/kg和40 mg/kg EMP饲喂家蚕时,家蚕幼虫寿命(617.793±2.4506 h和23.793±1.378 h)与对照组(613.997±4.289 h)相比分别延长了约4h和10h(p<0.01),此外其幼虫的抗逆能力与对照组相比也有所提高;在家蚕皮肤氧化损伤模型中,EMP各保护组幼虫体重均显着高于损伤对照组,20mg/kg EMP保护组家蚕血中SOD、CAT活性分别为1656.908±108.461和26.404±0.068,均显着高于损伤对照组的1411.539±79.444和17.268±0.136(p<0.01);此外EMP保护组家蚕皮肤细胞胶原的基因表达量也显着高于损伤对照组。(5)在EMP对间充质干细胞生长的影响试验中,EMP组细胞增殖指数为(61.00±0.72)%,显着高于空白对照组的(52.73±0.87)%(p<0.01),同时该组I、III型前胶原基因均有表达。结论:EMP具有明显的抗氧化损伤作用,能够促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖,有效抑制了细胞凋亡的发生,维持了氧化损伤中细胞膜、细胞骨架等亚细胞结构完整性和前胶原等基因的表达量;有效保护全层皮肤结构的完整性和紧密性,促进了氧化损伤后皮肤组织的修复,提高皮肤组织中抗氧化酶活性,并有效的清除活性氧自由基。EMP还具有明显的抗衰老作用,它不但能延长家蚕衰老模型的寿命,提高其抗逆能力,而且能有效激活全身抗氧化系统对家蚕局部皮肤损伤的应答作用。而EMP对骨髓间充质干细胞的生长则具有一定的干扰作用,在促进细胞增殖的同时,使得部分细胞发生了分化。
参考文献：
[1]. 豆类丝核菌次级代谢产物的生物效应研究[D]. 张黎. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 豆类丝核菌次级代谢产物对阿霉素毒性的保护作用及其联合抗肿瘤作用研究[D]. 杨萍. 西北农林科技大学. 2007
[3]. 豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠生殖毒性的研究[D]. 张伟. 西北农林科技大学. 2009
[4]. 豆类丝核菌次级代谢产物对化疗致骨髓抑制的保护及对肝肾功能的影响[D]. 郭卫华. 西北农林科技大学. 2009
[5]. 苦马豆素对小鼠免疫功能的影响及其作用机制研究[D]. 张志敏. 西北农林科技大学. 2008
[6]. 疯草内生真菌合成苦马豆素的研究[D]. 杨国栋. 西北农林科技大学. 2012
[7]. 枯草芽孢杆菌E1R-j产抗菌脂肽的发酵条件优化及分离纯化[D]. 杨洁. 西北农林科技大学. 2012
[8]. 玉米幼芽提取物对皮肤氧化损伤的保护作用及其机制研究[D]. 张黎. 西北农林科技大学. 2007