解玉泉[1]2012年在《Th17细胞/白介素-17在病毒性心脏病中的作用及机制研究》文中认为病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是由各种病毒感染引起的以心肌局灶性或弥漫性坏死为特征,伴随心肌间质的非特异性急、慢性炎症反应、纤维化或心脏扩张等临床表现的常见疾病。VMC好发于青壮年,其发病有逐年升高的趋势。绝大多数VMC可以自愈,但是15～25%VMC患者可演变为扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),最终导致心力衰竭或恶性心律失常,其预后不良,病死率较高。Rose根据不同类型免疫细胞浸润将心肌炎分为淋巴细胞性心肌炎、巨细胞性心肌炎、嗜酸粒细胞性心肌炎和DCM等类型,同时国内外学者将VMC分为病毒复制期、免疫反应期和DCM期。因此,免疫损伤机制在VMC中起着重要的作用。既往研究认为,病毒感染机体后,急性期大量病毒在宿主心肌细胞中复制,直接导致心肌细胞的损伤、坏死及凋亡。而在急性期后若病毒未被机体清除,一方面病毒在心肌细胞中持续低水平复制,可以继续直接损伤心肌结构及功能；另一方面也可通过激活并维持免疫反应而导致心肌进一步损伤。因此本研究主要从VMC发生、发展及演变过程中可能存在的免疫机制为线索,探索细胞免疫在VMC发生、发展中的作用机制,为VMC的早期临床诊断及探寻免疫治疗的新靶点提供理论依据。在经典的辅助性CD4+T淋巴细胞亚群Th1/Th2的研究过程中,发现了一种新型的Th17细胞亚群,其分化发育和功能特征明显不同于之前发现的辅助性T淋巴细胞亚群Thl和Th2。Th17细胞的分化发育依赖于局部微环境及特定细胞因子的作用,其主要分泌的效应分子为IL-17A/F、IL-22和IL-21。最初的研究认为,VMC机体中CD4+T细胞向Thl分化增加,分泌IFN-γ以降低病毒的复制,从而减少心肌免疫细胞的浸润及炎症刺激,并导致心肌纤维化的程度减轻,保护心肌细胞避免过度免疫损伤并降低心肌纤维化的程度。此外,有研究表明心肌炎的病理损伤与Th2型细胞免疫反应密切相关。目前研究认为,Th17与机体抗病原体感染及一些自身免疫病密切相关,即Th17细胞可诱导机体局部组织的炎症反应的发生、放大和级联反应,继而加重其病理类型的发生与发展。近年来,Thl7细胞在自身免疫性心肌炎中的作用已成为心血管疾病研究的热点,在实验性自身免疫性心肌炎中的研究也取得了一定的进展。而VMC与实验性自身免疫性心肌炎在病理类型、临床表现、转归及预后上具有相同之处。那么,Th17细胞在机体受到病毒感染后的作用如何?当柯萨奇病毒感染后心肌局部炎症发生、发展及演变中的作用机制如何?同时Treg细胞亚群具有免疫抑制功能的CD4+T细胞亚群,在免疫炎症性疾病中具有保护作用。Treg口Th17均起源于CD4+T细胞亚群,在特定地局部免疫微环境作用下,二者可以相互转化、相互制衡。Th17/Treg细胞亚群失衡在多种自身免疫性疾病中受到了广泛地关注,那么,VMC与其它类型的自身免疫性疾病一样也存在Th17/Treg失衡现象?国内外学者尚缺乏深入地阐述和研究。在病毒性心肌炎向扩张型心肌病的演变过程中,心肌炎症是病毒感染导致心肌纤维化、心室重构和心力衰竭的共同通路,而心肌炎症反应主要依赖于不同类型的免疫细胞浸润,形成不同的局部免疫微环境。目前在不同T淋巴细胞亚群在VMC中的作用及其机制研究甚少,特别是Th17细胞在VMC细胞外基质的合成、分解和基质金属蛋白酶系统中作用的研究更少。因此,本研究通过探索Th17细胞在心肌组织局部微环境对心肌ECM的合成与分解和基质金属蛋白酶系统免疫调节中的作用机制,有利于寻找VMC的免疫诊断与治疗的新途径。柯萨奇B3病毒感染的小鼠在不同时期的心肌标本中有多种免疫细胞浸润,其中以大量巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞为主,伴随少量的B细胞、树突状细胞(dendritic cells, DC)和自然杀伤细胞。其中DC作为抗原提呈细胞,可以捕获提呈抗原,并逐渐演变为成熟的DC,在体内迁移,最终激活免疫反应。那么,DC在VMC的病因中的作用尚未清楚,但是DC从外周组织沿传入淋巴管迁移至邻近的次级淋巴组织后,与抗原特异性的初始T淋巴细胞聚集,诱导其活化并增殖,使其分化为效应性T细胞,从而启动机体的一系列免疫应答。随着新型免疫细胞亚群的发现及Th17/Treg调节机制的不断深入研究,DC在病毒性心脏病的发病机制也受到广泛地重视。因此,DC在VMC的发生、发展、演变及转归等方面的作用,特别是在病毒性心脏病中Th17/Treg细胞亚群分化的作用机制等方面,值得我们进一步研究与探索。本研究致力于探讨Th17细胞在急性病毒性心肌炎中的作用机制,特别是与其它细胞亚群的关系,如Treg细胞亚群；阐述Th17细胞在病毒性心肌炎向心肌纤维化演变过程中的作用机制,并探索DC在病毒性心脏病中Th17/Treg细胞亚群分化中的调节作用,以寻求临床上有效的免疫治疗靶点。全文共分为以下四部分：第一部分CVB3致小鼠病毒性心肌炎、扩张型心肌病模型的建立目的建立小鼠急、慢性心肌炎和扩张型心肌病动物模型。方法雄性Balb/c小鼠210只,体重12-16g,随机设立病毒感染后不同时间点,分别为0天组(n=35)、7天组(n=35)、10天组(n=35)、14天组(n=35)、2月组(n=35)和3月组(n=35)。每组随机抽取10只,腹腔注射不含病毒的Eagel's培养液(EMEM),作为正常对照组(Control group)；其余小鼠腹腔均接种柯萨奇病毒B3(CVB3)建立小鼠急、慢性心肌炎和扩张型心肌病动物模型；分别于接种病毒后第0、7、10与14天及2月、3月末处死动物并收集外周血、血清、脾脏及心脏组织等标本；于感染后第7天、2月、3月末动物模型组与同期对照组小鼠分别进行心脏超声检查、病理学染色并计算心肌胶原容积积分。结果小鼠心肌在感染后第7天出现心肌纤维断裂、心肌细胞变性坏死、间质充满炎性细胞浸润,伴心肌纤维化增生,主要以局限在心肌坏死灶周边；计算心肌病理积分结果显示,在感染后第7天明显升高,第10天最高,第14天后开始下降。而CVB3复制水平在感染后第7天最高。至第2月末感染小鼠出现心肌纤维断裂,心肌内炎性细胞浸润,心肌间质纤维化增加,心腔扩大及心脏收缩及舒张功能均减退；第3月末小鼠心肌间质大量胶原异常增生呈弥漫性分布,心肌炎性细胞浸润减少,左室腔明显扩大,心脏舒张功能显着减退；同时心肌胶原容积积分明显升高。结论以CVB3单次和增量重复感染Balb/c小鼠成功建立了急、慢性病毒性心肌炎和扩张型心肌病动物模型。在急性病毒性心肌炎中,以感染后第7-10天心肌病理损伤最为明显,CVB3病毒复制水平在第7天最高。在慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病中,以感染后第2个月后心脏结构与功能显着减退,但心肌胶原容积积分以第3个月最为显着。第二部分Th17细胞在急性病毒性心肌炎中的作用机制及对Treg细胞的影响目的探讨Th17细胞/白介素-17在急性病毒性心肌炎中的作用机制及其对Treg细胞亚群的影响。方法首先采用流式细胞仪技术分别检测正常对照组、急性病毒性心肌炎组(0、7、10、14天)脾脏中Th17细胞的表达,同时使用Real-time PCR技术检测急性心肌炎心肌组织中CVB3病毒复制水平与IL-17、TGF-β表达并进行相关性分析。采用激光共聚焦显微镜及酶联免疫吸附试验方法分别观察Th17、Treg细胞在心肌组织及外周血清中IL-17、TGF-β的表达水平。分别对各组小鼠心肌组织进行HE染色计算心肌损伤的病理积分,使用Real-time PCR检测病毒复制水平。再将Balb/c小鼠70只,随机分为对照组(Control)(n=10)、急性心肌炎组(AVMC)(n=20)、Isotype组(n=20)及Anti-IL-17组(n=20)。Control组小鼠腹腔注射等量EMEM;而AVMC、Isotype及Anti-IL-17A组小鼠均腹腔接种CVB3；然后Isotype及Anti-IL-17组小鼠于病毒感染后隔日分别腹腔注射IgG(100μg)、IL-17Ab (100μg)。所有小鼠均于病毒感染第7天后处死并取心脏组织、血清及脾脏组织；采用流式细胞仪测定CD4+, CD8+, CD4+/CD8+T淋巴细胞数量,并检测CD4+Perforin+T淋巴细胞,CD8+Perforin+T淋巴细胞,CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞的表达量。使用Real-time PCR检测心肌组织中IL-17A及CVB3病毒复制水平,并使用H&E染色计算心肌病理积分观察各组心肌损伤的程度,最后采用Western blot法检测心肌组织中IFN-γ、TGF-β1及VP1等蛋白表达水平,Cytomix方法检测血清中T细胞亚群相关细胞因子的表达谱。结果急性病毒性心肌炎感染后第7、10及14天脾脏中Th17细胞数较正常对照组明显增加,其中以第10天增加最为明显,Real-time PCR实验结果显示心肌组织中IL-17A mRNA及CVB3RNA水平表达均升高,二者呈显着正相关关系。而心肌组织中TGF-β mRNA在心肌中的表达也呈明显升高趋势,但是与CVB3RNA水平呈显着负相关关系；结合Western-blot及Cytomix方法检测心肌组织及血清中Th17相关细胞因子IL-17A,IL-6,IL-21,IL-10,IFN-γ,和IL-2的表达水平,与正常对照组相比,这些细胞因子的表达均明显升高。在急性病毒性心肌炎模型中,心肌组织H＆E染色计算病理积分结果显示,感染后第10天心肌损伤最重,而CVB3病毒复制在第7天最明显。采用IL-17A中和抗体干预后,结果显示IL-17A能够改善急性病毒性心肌炎心肌病理损伤程度,并能够降低心肌CVB3病毒复制水平；结合流式细胞技术及Western blot检测结果显示,IL-17A中和抗体干预能够显着降低Treg细胞、提高体内CD8+T细胞的数量及穿孔素的表达水平,使Treg细胞导致杀伤性T细胞的抑制功能恢复；同时上调心肌组织中IFN-γ的表达。从血清学的检测结果也显示,IL-17A中和抗体干预使体内Th17细胞相关的细胞因子IL-6、IL-17A及IL-22的表达明显下降,而IFN-γ的表达却明显升高。结论急性病毒性心肌炎模型中小鼠脾脏Th17细胞及心肌中IL-17A表达与正常对照组比较明显增加。同时在急性心肌炎心肌组织中IL-17A mRNA的水平与CVB3病毒复制水平升高,二者呈正相关关系；而TGF-β mRNA在心肌中的表达也呈上升趋势,但是与CVB3复制水平呈负相关关系。其中在感染后第10天Th17细胞表达最多,而CVB3病毒复制水平在第7天最高。IL-17A中和抗体明显改善急性病毒性心肌炎的病毒复制水平及心肌病理损伤程度,这一过程的作用机制可能是通过IL-17中和抗体减轻Treg细胞过度抑制杀伤性T细胞效应及促进IFN-γ的表达增加有关。第三部分：Thl7细胞/IL-17在心肌炎向心肌纤维化演变中的作用及机制研究目的研究阻断IL-17R干预IL-17后,对急性心肌炎后向心肌纤维化演变过程中的作用及机制研究。方法体内试验：将Balb/c小鼠50只,随机分为3组,即慢性病毒性心肌炎组(n=10),慢性病毒性心肌炎+AdIL-17R:Fc组(n=20),慢性病毒性心肌炎+Ad:null组(n=20)。慢性病毒性心肌炎+AdIL-17R:Fc组及慢性病毒性心肌炎+Ad:null组给予腹腔接种CVB3后,分别给予Ad:IL-17R:Fc及等量Ad:Fc;观察各组小鼠死亡率,并在3个月末进行心超检查后处死小鼠,采用天狼猩红染色及免疫组织化学方法检测心肌内胶原含量并运用图像分析软件计算CVF和Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量；使用ELISA方法测定血清中IL-6及TNF-α的含量,采用Western blot检测小鼠心肌组织中TGF-β1、IL-17A、ADAMTS-1及MMP-2/TIMP-1的表达水平,同时采用Real-time PCR方法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达水平。体外试验：使用不同浓度IL-17A细胞因子作用于体外培养的心肌成纤维细胞,了解其对细胞增殖及心脏细胞外基质中重要的金属蛋白酶ADAMTS-1及MMPs/TIMPs表达的影响,同时测定心肌成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA水平变化,最后使用Real-time PCR方法观察IL-17A对心肌成纤维细胞中ADAMTS-1的作用是否通过ERK、p38、JNKMAPK的磷酸化修饰来实现的。结果使用流式细胞仪方法检测病毒感染后第2月、3月不同时间段Th17细胞的表达量。结果发现：与对照组比较,Th17细胞在第2月上升最为明显；采用AdIL-17R:Fc干预后,我们发现明显提高了小鼠的生存率(44%VS20%,p<0.05)；降低慢性心肌炎小鼠血清中IL-6和TNF-α细胞因子的水平；同时降低小鼠心肌组织中IL-17A的表达,而对IL-17RA的表达无明显影响。通过流式细胞仪技术检测外周Th17细胞,结果发现AdIL-17R:Fc(?)够降低外周脾脏中Thl7细胞(7.88±1.01%VS10.3±1.67%,p<0.05)的表达。从心脏功能及形态学结果上发现,AdIL-17R：Fc能够改善心功能并减轻心脏过度扩大,明显降低心脏/体重比值。从心肌组织病理学检测结果表明：AdIL-17R：Fc显着降低心肌组织中CVF(4.27VS8.7,p<0.05)及Ⅰ型、Ⅲ型胶原在心肌组织中的沉积。经过蛋白印迹定量检测结果发现：AdIL-17R:Fc(?)抑制心肌ADAMTS-1和MMP-2蛋白的表达,而对TIMP-1的表达无明显影响；体外实验研究结果显示：IL-17A细胞因子能促进ADAMTS-1、MMP-2及TIMP-1的蛋白表达,并刺激心肌成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达增加；同时促进心肌成纤维细胞的增殖。进一步通过体外实验进一步探索IL-17A对心肌成纤维细胞ADAMTS-1作用的信号转导途径,结果显示：IL-17A通过p38及ERK磷酸化途径影响ADAMTS-1mRNA水平的表达；而不是通过JNK的磷酸化途径来实现的。结论在慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病中,脾脏Th17细胞及心肌中IL-17A表达与正常对照组比较明显增加,而在感染后第2月Th17细胞数量较同期对照组明显上升,而感染后第3月有所下降。同时第2-3月心肌损伤及纤维化程度较同期对照组明显增加,并且在感染后第3月的增加更为明显。AdIL-17R:Fc干预后结果显示：AdIL-17R：Fc能降低扩张型心肌病小鼠死亡率及减轻心肌纤维化的机制,可能与其抑制Th17细胞及其分泌的IL-17A细胞因子后产生免疫调节作用有关。同时AdIL-17R：Fc使心肌组织中ADAMTS-1、MMP-2/TIMP-1表达明显下降,减轻其对心肌细胞外基质的降解作用,从而减少心肌细胞外基质的破坏及降低心肌纤维化。另外在体外实验也证明,IL-17A在心肌成纤维细胞中对ADAMTS-1作用的信号转导通路与p38及ERK MAPK磷酸化密切相关,验证了体内实验中AdIL-17R:Fc可能导致IL-17A的产生,进一步降低细胞外基质的破坏,从而产生抗纤维化的保护作用。第四部分DC在急性病毒性心肌炎中的作用机制及其对T细胞分化为Th17、Treg细胞亚群的影响目的探讨DC在急性病毒性心肌炎中的作用机制及其对T细胞向Th17、Treg细胞亚群分化的影响。方法通过采集正常对照组(n=15)、急性病毒性心肌炎组(n=15)小鼠骨髓来源的DC进行原代培养,并对成熟的DC进行影像学及流式细胞仪鉴定DC表面分子标记物的表达。提取正常对照组小鼠外周脾脏组织CD4+T细胞,并使用磁珠分选后CD4+T细胞,重悬于RPMI-1640培养液,待与DC细胞共培养使用。然后采集正常对照组及急性病毒性心肌炎组小鼠骨髓来源的DC,并使用磁珠分选两组来源的DC后,与分选后CD4+T细胞共培养,并将不同组T淋巴细胞进行体外定向Th17及Treg细胞亚群分化。采用流式细胞技术及ELISA方法检测Th17、Treg田胞的数量及上清夜中IL-17A和TGF-p的含量,并使用细胞增殖实验(CCK-8)了解负载病毒抗原DC对CD4+T细胞增殖的影响。结果首先在小鼠骨髓来源的DC原代培养后观察,DC早期呈现贴壁生长方式,第2-3天后呈现多处集落生长,并且可见出芽状的突起,5-7天后集落渐渐减少,突起变长,呈悬浮生长方式,即从未成熟状态转化为成熟状态的DC。采用流式细胞技术对急性病毒性心肌炎骨髓来源的DC表面分子标志物检测,结果显示CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表达比正常对照组明显增加,而CD86表面分子在二者之间未见显着性差异。在小鼠外周脾脏组织提取CD4+T细胞,使用磁珠分选的后CD4+T、DC细胞的纯度分别达到92%和95%,然后将来源于不同组别提取的DC向Th17和Treg细胞定向分化培养,结果显示：负载病毒抗原的DC能够刺激CD4+T淋巴细胞的增殖增加；同时促进CD4+T细胞向Th17细胞亚群分化增加,与对照组相比,有显着统计学意义；而二者在向Treg细胞亚群分化中,无显着统计学意义。结论急性病毒性心肌炎模型中骨髓来源的DC的成熟度与正常对照组比较明显增加。同时采用体外共培养及定向分化实验,结果表明：柯萨奇病毒感染机体后,能促进CD4+T细胞的增殖,并且促使初始T淋巴细胞向Th17细胞分化增加,而向Treg细胞亚群分化不明显。因此,在急性病毒性心肌炎模型中,Thl7细胞亚群的增加可能与负载病毒抗原DC的递呈作用有关,而这种作用可能是促使CD4+T细胞向Thl7分化增加的原因之所在。
陈相健[2]2001年在《病毒性心肌炎向扩张型心肌病转化的分子细胞机制及药物干预研究》文中进行了进一步梳理背景：病毒性心肌炎是病毒引起的心肌急性、亚急性或慢性的炎症病变，可侵及心肌局部或呈弥漫性改变。最常见的是肠道病毒感染。病毒性心肌炎重症急性期病死率可达11.2％。其预后大多良好，约有13％左右患者后期可发展成为扩张型心肌病，约有25％-30％的扩张型心肌病患者心肌中可找到肠道病毒基因片断。从病毒性心肌炎向扩张型心肌病的转化是一个复杂的过程，多种因素参与其中，而病毒在心肌中的持续复制、免疫介导的损伤及细胞凋亡被认为是转变的主要原因。实验证明心肌中持续存在限制性复制的肠道病毒RNA可导致心肌病样改变，柯萨奇B3病毒protease 2A蛋白切割心肌细胞骨架蛋白dystrophin，其作用可能是病毒最终导致扩张型心肌病的缘由。新发现的CAR（柯萨奇病毒-腺病毒-受体）介导的病毒感染和免疫应激正反馈机制为研究病毒性心肌炎的发病与治疗提供了新方向。内皮素系统在病理状况下过度激活参与了扩心病心室重构过程。因此探讨病毒性心肌炎急慢性期以及重复感染期CAR表达、心功能的变化、内皮素受体的变化及中药黄芪对其的影响，有助于更深一步了解病毒性心肌炎的发病、转归及治疗。 目的：研究病毒性心肌炎一次感染及重复感染急慢性期心肌病理、心肌肠道病毒、病毒受体、血流动力学及内皮素系统的变化，探讨病毒性心肌炎向扩张型心肌病转化的可能机制；以中药黄芪、培哚普利及维拉帕米进行干预，了解药物可能的作用机制。 内容与方法：1．建立病毒性心肌炎一次感染及重复感染急慢性期小鼠模型：采用柯萨奇B3亲心肌病毒株，感染BALB/c小鼠，同时给予受试药物，部分小鼠2周后重复感染病毒，观察日期为7天至5个月。观察小鼠死亡率、心肌病理形态学改变（HE染色）；采用 南京医科大学傅士学检论文RT—PCR 法定性或定量检测小鼠。o肌肠道病毒RNA、CARmRNA表达及ANPmRNA表达；用放射免疫分析法检测小鼠心肌ANP含量。2．建立小鼠心赃血流动力学栓测方法，了解病毒性。0肌炎小鼠 卜次感染及重复感染 急慢性期心脏血流动力学变化，探讨病毒感染、再感染及药物对小鼠心脏血流动力学的影响，并分析。c肌病理变化、肠道病毒RNA阳性对小鼠心脏血流动力学的影响。3．建立小鼠心肌 ETR放射配基分析法，了解病毒性心肌炎小鼠 （一次感染及重复感染）急慢性期心肌内皮素受体密度与亲和力的变化，RT－PCR法半定量检测小鼠。o肌ETAR、ETBRllutNfrt表达2 用放射免疫分析法检测小鼠心肌ET－1 含量。探讨病毒感染、再感染及药物对小鼠内皮素受体密度、亲和力及亚型mKNA表达的影响。 结果1．一次感染病毒性心肌炎模型1 组小鼠感染柯萨奇B3病毒后，死亡率 门 8石0％，8八3）及心肌病理积分增高，与正常组相比差异显着印＜0．05刀．01）；在实验过程k天至5个月）中，病毒性心肌炎小鼠模型组体重与同龄正常组小鼠相比无明显差异。感染3O 天内模型组小鼠。0肌肠道病毒RN A 扩增阳性率达91．67％OI八2），与正常组相上差异明显（P＜0．05）；同时小鼠心肌 CAR m叫A、ANPm叫A表达 tb正常组有增高趋势，但无统计学差异；感染5个月心肌ANPmRNA表达及ANP含量均高于正常组，但无统计学差异。 黄茁与培噪普利治疗的病毒性心肌炎小鼠一次感染组30天时死亡率分别为8．57％o35）及8．82％O04卜与模型组相比下降；。臼肌病理积分低于模型组，但与正常组相比仍有明显差异 印＜O．05X感染5个月时小鼠心肌Aw含量比模型组下降。维拉帕米治疗的病毒性心肌炎小鼠一次感染组14 天时死亡率达8．82OO／34），3个月时死亡率为26．47％（9o4），与正常组、黄瓮治疗组相比，差异显着 0＜o刀5心刀01）；买验过程中，小鼠心 6 南京医科大学博士学位论文肌病理积分均高于正常组，有统计学差异汐＜0刀5）；感染5个月时维拉帕米组小鼠心肌ANP含量高于正常组、模型组及其余治疗组，但无统针学差异。 重复感染病毒性心肌炎模型2组小鼠（一次感染后2 周再重复感染柯萨奇病毒）死亡均发生在实验3－5个月内，5 个月时死亡率为 10．34O（a9卜与正常组相比，差异明显（P＜0．05），与一次感染模型组相比，死亡高峰期后延。5 个月时重复感染小鼠体重比同龄正常组、一次感染模型1组小鼠明显下降，有统什学差异k＜o刀5）；同时小鼠心肌病理积分高于正常组，与模型1组相似，心肌病变主要以坏死灶及胶原增生为主。感染21一30天重复感染模型 2 组小鼠心肌肠道病毒 RNA ＃出率及CARmllNA表达均高于正常组小鼠，但与一次感染模型1 组小鼠相比，未见明显差异。感染5个月时模型2组小鼠心肌A NPNP含量明显高于正常组及模型1组，有统什学差异p＜o．05）正常组、一次感染组及重复感染组 5 个月 A呷 分别是 0．41i0．11ng／ml．pro
陈会君[3]2009年在《益气养阴、活血化瘀方药对CVB_(3m)诱导慢性心肌损伤小鼠心肌组织ADAMTS-1、TGF-β_1的影响》文中提出目的：通过观察益气养阴、活血化瘀方药对柯萨奇B_(3m)诱导慢性心肌损伤小鼠心肌组织ADAMTS-1、TGF-β_1的影响，探讨其作用机制，为早期防治病毒性心肌病提供客观依据。方法：采取多次反复腹腔接种CVB_(3m)方法诱导Balb／c小鼠发生慢性心肌损伤，建立早期病毒性扩张型心肌病动物模型。210只Balb／c小鼠，随机分为4组，空白对照组3 0只，模型对照组、中药高剂量组、中药低剂量组各60只。采用HE、VG染色观察其心肌病理形态学及超微结构的变化；采用RT-PCR法观察心肌组织ADAMTS-1和TGF-β_1表达水平的变化。结果：1．益气养阴、活血化瘀方药能降低病毒性心肌病小鼠心脏质量指数，以中药高剂量组效果为佳。2．益气养阴、活血化瘀方药能明显改善病毒性心肌病小鼠心肌病理形态及超微结构的变化，从而减轻心肌病理损伤。3．益气养阴、活血化瘀方药能下调病毒性心肌病小鼠心肌组织ADAMTS-1的表达水平，以中药高剂量组效果为佳。4．益气养阴、活血化瘀方药能下调病毒性心肌病小鼠心肌组织TGF-β_1的表达水平，以中药高剂量组效果为佳。结论：益气养阴、活血化瘀方药能减轻病毒性心肌病小鼠的病理损伤，下调心肌组织ADAMTS-1和TGF-β_1的表达，这可能是其防治病毒性心肌病的作用机制之一。
张占军[4]2008年在《益气养阴、活血化瘀法对病毒性心肌疾病小鼠T细胞亚群影响的研究》文中研究表明目的:通过观察益气养阴、活血化瘀法对病毒性心肌疾病小鼠的T细胞亚群的影响,从而探讨其作用机制,为早期防治病毒性心肌疾病提供客观理论依据。方法:采用多次腹腔注射CVB_(3m)病毒的方式,复制重复感染的早期病毒性心肌疾病动物模型。将210只Balb/c小鼠随机分为4组,模型对照组、中药高剂量组、中药低剂量组,每组各60只。另取30只Balb/c小鼠做为空白对照组。采用常规的方法观察病毒性心肌疾病小鼠心脏质量指数;采用HE、VG染色观察其心肌病理形态及超微结构,采用流式细胞仪检测脾细胞中CD4~+T、CD8~+T细胞含量,并计算CD4~+/CD8~+的比值。结果:1.与空白对照组相比,模型对照组及中药低剂量组小鼠心脏/体重比值均明显增高(P＜0.05),与模型对照组相比,中药高剂量组和中药低剂量组小鼠心脏/体重比值均明显降低(P＜0.05)。2.与空白对照组相比,各组小鼠心肌胶原容积分数均明显增高(P＜0.05),而中药高、低剂量组与模型对照组相比则明显降低(P＜0.05);中药高剂量组与中药低剂量组相比心肌胶原容积分数亦明显降低(P＜0.05)。3.与空白对照组相比,各组小鼠CD8~+T细胞含量明显升高,CD4~+/CD8~+明显降低(P＜0.05);与模型对照组相比,中药高、低剂量组能够明显降低CD8~+T细胞含量,升高CD4~+/CD8~+比值(P＜0.05);中药高剂量组与中药低剂量组相比无显着差异。各组间CD4~+T细胞含量无显着差异(P＞0.05)。结论:益气养阴、活血化瘀法能改善病毒性心肌疾病小鼠心脏质量指数和病理形态学及超微结构的改变;对病毒性心肌疾病小鼠的心肌具有免疫调节作用,从而对病毒性心肌疾病起到一定的防治作用。这可能是其防治病毒性心肌疾病的作用机制之一。
李明辉[5]2013年在《Calpain在柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎中的作用及其机制研究》文中研究说明前言病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是心肌局限性或弥漫性的炎性病变,可呈急性或慢性病程。绝大多数患者预后良好；约10-15%的患者由于急性期后炎症持续、病情迁延反复,进展为扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)。在原发性扩张型心肌病中,高达60%的患者能检测到病毒感染。表明病毒直接感染是心肌炎心肌病重要的触发因素之一。多种病毒可诱导病毒性心肌炎发病,其中以肠道病毒中柯萨奇B组病毒3型(Coxsackievirus B,CVB3)最为常见,在急性心肌炎及恢复期病人体内均可检测到CVB抗体滴度升高,因此寻找CVB3导致病毒性心肌炎的治疗靶点,探寻可能的干预途径,对病毒性心脏病的治疗具有重要的临床意义。柯萨奇B组病毒引起心肌组织损伤、进展为扩张型心肌病并最终引起心力衰竭病理过程的具体机制尚不十分清楚。通常将整个过程分为叁个阶段：第一阶段,病毒对心肌细胞的直接损伤；第二阶段,继发性细胞或体液免疫反应对心肌细胞的损伤；第叁阶段,损伤心肌的重塑及扩张型心肌病阶段。病毒感染触发心肌组织损伤,引起持续低水平的炎症反应,导致持续性心肌损伤及修复性纤维化的发生,炎症细胞产生基质降解酶类,共同导致左心室扩张和心功能损伤,形成了病毒性心脏病“病毒性心肌炎-扩张型心肌病-慢性心力衰竭”的连续病理过程。因此,病毒持续复制、心肌炎症细胞浸润以及心肌组织纤维化是柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心脏病发病及进展的叁个重要机制。Calpain是一类主要存在于细胞质中的Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白酶,目前已知有15个家族成员,分为组织特异性和非特异性两大类。Calpain底物众多,生理功能复杂多样,至今尚未完全明了。通常calpain不是将蛋白质底物降解成小多肽或氨基酸,而是通过特定地限制性蛋白水解,调节受体蛋白、细胞骨架蛋白、肌原纤维、蛋白激酶等底物的活性、结构和功能,从而参与信号转导、细胞的运动与迁移、组织修复、细胞凋亡等体内生理过程；在多种病理状态下包括肌肉萎缩、某些癌症、缺血-再灌注损伤、高血压、糖尿病等,calpain的活性均增高,并在病理发病过程中起重要作用。目前,许多研究显示calpain作为一种功能多样、分布广泛的酶类,与某些种属病毒的复制过程、机体免疫炎症反应过程及组织纤维化发生叁个方面均有相关性。但是,在柯萨奇B3病毒导致的病毒性心肌炎发病及进展过程中是否存在作用,又起着怎样的作用,目前尚未见报道。鉴于此,在本研究中,我们拟在目前已知的柯萨奇B3病毒导致病毒性心脏病的发病机制基础上,进一步探讨calpain在其中的具体作用及机制,以期阐明calpain作为病毒性心肌炎治疗靶点的可能性。第一部分：C57BL/6品系小鼠急、慢性病毒性心肌炎模型及扩张型心肌病模型的建立[目的]探讨以柯萨奇B3病毒(coxsackievirus B3,CVB3)感染C57BL/6小鼠建立急慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病模型的方法。[方法]以初始体重／周龄为依据将小鼠分为两组：A组(3-4周龄,11-15g)及B组(5-6周龄,15-20g)；每组分别下设叁个病毒感染滴度亚组,即：1,000TCID50/ml亚组、10,000TCID50/ml亚组、100,000TCID50/ml亚组以及对照组。感染7天后观察心肌组织中是否存在感染病毒以及心肌炎症细胞浸润的情况,以探索建立急性病毒性心肌炎的方法。在此基础上,依照建立急性病毒性心肌炎模型的方法,以病毒直接感染的方法,感染2月及3月分别建立慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病模型。[结果]在急性病毒性心肌炎模型建立过程中,免疫组化染色发现病毒感染各组心肌组织中存在病毒包膜蛋白VPl；低体重组各病毒滴度感染亚组表现出较高的死亡率(40-100%),高体重组小鼠感染后各亚组体重呈下降趋势；组织病理学观察发现低体重组小鼠存活个体心肌存在炎症浸润情况,而死亡个体未发现明显炎症细胞浸润；高体重组小鼠心肌随感染病毒滴度的增高心肌炎症情况呈增高趋势,且存活率高。以建立急性病毒性心肌炎模型条件感染小鼠后2月与3月,与Balb/c品系小鼠相比,C57BL/6品系小鼠心脏功能无明显变化,心肌组织病理学未见明显炎症浸润、组织纤维化改变。[结论]利用5-6周龄/15-20g体重的C57BL/6品系小鼠,以100,000TCID50/ml CVB3、0.3ml剂量感染,可以建立急性病毒性心肌炎模型；但是通过病毒直接感染的方法,无法在C57BL/6品系小鼠建立慢性病毒性心肌炎及扩张型心肌病模型。第二部分：Calpastatin过表达对柯萨奇B3病毒感染诱导的病毒性心肌炎心脏保护作用的研究[目的]Calpain是一类存在于细胞质中的钙离子依赖性的半胱氨酸蛋白酶,在体内底物众多,病理生理功能多样,其活性受到内源性特异性抑制剂calpastatir的负向调控。研究证明calpain参与病毒性心肌炎发病,并影响某些肠道病毒复制过程；但是关于calpain在柯萨奇B3病毒(Coxsackievirus B3, CVB3)导致的病毒性心肌炎中的作用目前尚未见报道。本研究拟利用过表达calpain内源性抑制剂calpastatin的转基因小鼠(Tg-CAST小鼠),观察calpain在CVB3诱导的病毒性心肌炎中的作用,并探讨其可能机制。[方法]以CVB3直接感染Tg-CAST小鼠建立病毒性心肌炎模型,同时设立相应对照组。观察心重／体重比值变化情况,行HE染色观察心肌组织炎症细胞浸润情况并进行病理学评分,同时检测外周血心肌损伤标志物CK-MB. cTnl的水平。分子生物学方法分别检测心肌组织中病毒包膜蛋白VP1表达水平变化；纤维化相关因子Smad3、MMP2表达及活性变化；炎症相关因子IL17、IFNy、穿孔素(perforin, PFN)表达变化。[结果]Tg-CAST小鼠心肌组织中calpastatin表达上调,calpain活性受到明显抑制。与病毒感染野生型对照相比,CVB3感染的Tg-CAST小鼠心重／体重比值降低,心肌组织炎症浸润减轻,对应心肌病理评分下降,同时外周血心肌损伤标志物CK-MB、cTnI的水平降低；心肌组织内VPl表达下降；心肌纤维化相关因子Smad3表达明显下降,MMP2表达和活性明显下降；炎症相关因子IL17、IFNy及PFN在心肌组织内的分布及表达也明显下降。[结论]以上研究说明calpastatin过表达对柯萨奇B3病毒导致的病毒性心肌炎表现出显着的心脏保护作用,提示calpain在病毒性心肌炎发病中的重要作用。病毒性心肌炎发病及进展过程中,病毒的持续复制、机体免疫炎症反应以及心肌纤维化是重要的致病机制；而围绕这叁个方面展开的研究结果显示calpain参与CVB3复制,参与调控炎症因子生成,参与心肌纤维化相关因子表达；因此,calpain可能通过以上多种机制参与病毒性心肌炎发病。第叁部分：Calpain介导自噬与凋亡在柯萨奇B3病毒复制中的作用研究[目的]Calpain是存在于细胞内的钙离子依赖性的中性半胱氨酸蛋白酶,参与许多生理及病理过程。有报道称calpain参与病毒复制、自噬及凋亡发生过程。然而,calpain通过自噬-凋亡串话(cross-talk)参与柯萨奇病毒复制的具体过程尚不清楚。本部分内容拟就此问题进行讨论。[方法]以CVB3直接感染培养的大鼠原代心肌细胞及H9c2心肌细胞系,建立体外病毒性心肌炎模型,分别观察感染后细胞内calpain活性、caspase3活性、细胞自噬动态变化情况；在适宜的时间窗内,通过药物调节calpain活性,观察其对细胞凋亡及自噬情况的影响；通过调节自噬活性变化,观察细胞凋亡情况的影响；在培养大鼠原代心肌细胞中,观察调节calpain活性及自噬活性,对病毒包膜蛋白VPl表达及病毒子代复制能力的影响。[结果]病毒感染后24小时内,calpain活性被持续激活。抑制calpain舌性减少了自噬的发生而增加calpain活性则促进了自噬的发生,说明calpain介导了CVB3感染过程中自噬的发生过程；在感染后10小时内,calpain活性也抑制了凋亡的发生；而在此时间段内,增强与抑制自噬分别抑制和促进了凋亡的发生,说明CVB3感染诱导的自噬抑制了细胞的凋亡；抑制calpain活性及自噬活性分别减少了病毒复制水平。[结论]在CVB3感染过程中,病毒感染激活calpain,继而通过增加自噬活性,进一步抑制宿主细胞细胞凋亡,并促进子代病毒复制。第四部分：Calpain对柯萨奇B3病毒性心肌炎心肌纤维化发生的影响及机制研究[目的]观察抑制calpain活性后急性柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌组织总体纤维化程度的改变以及体外情况下calpain对心肌成纤维细胞增殖和迁移能力的影响,初步揭示calpain在病毒性心肌炎心肌纤维化过程中的作用。[方法]以CVB3单次感染C57BL/6品系小鼠及Tg-CAST转基因小鼠建立病毒性心肌炎模型；同期小鼠腹腔无菌注射等剂量不含病毒的DMEM液作为对照组。小鼠于第7天断颈处死,取出心脏,常规方法行组织病理学行Mallory染色观察心肌纤维化程度,并测量总体纤维化面积百分比；行天狼猩红染色观察心肌胶原分布情况。无菌条件下取SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,经纯化后铺板贴壁,去血清培养24h同步化,加入含梯度稀释的ALLN,20%FBS的细胞培养基培养24h；同时设无ALLN干预的心肌成纤维细胞同条件培养作为对照组；每组设5个复孔；采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测不同浓度的药物对成纤维细胞增殖的影响。分组及干预同上,将成纤维细胞接种到6孔板,采用细胞划痕损伤实验检测不同浓度药物对成纤维细胞迁移的影响。[结果]急性病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的总体程度比正常对照组及药物干预组均明显增加(P<0.01)；抑制Calpain的活性后,其心肌纤维化总体程度则有显着的下降(P<0.01)。体外培养成纤维细胞实验中,与正常对照组相比低浓度的ALLN (0.625μg/ml)作用于成纤维细胞24h后,即可导致成纤维细胞的吸光度值下降,即成纤维细胞增殖率下降,差别具有显着统计学意义(P<0.001)；ALLN浓度继续增加后,成纤维细胞的吸光度继续降低,即成纤维细胞增殖率继续下降,差别有统计学意义(P<0.05)。抑制Calpain的活性同时表现出对成纤维细胞迁移能力的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.001)；随着ALLN浓度的增高,对成纤维细胞的迁移能力呈更高的抑制作用。[结论]Calpain与急性柯萨奇B3病毒性心肌炎发病中的心肌纤维化相关,并在体外情况下参与调节心肌成纤维细胞的增殖,调控成纤维细胞的迁移运动。
于小华[6]2005年在《柯萨奇—腺病毒受体在病毒性心脏病中的表达及黄芪甲甙的干预研究》文中研究表明第一部分:CAR在VMC小鼠心肌中的表达及黄芪甲甙的干预 目的 柯萨奇-腺病毒受体(CAR)是一种含365个氨基酸的跨膜糖蛋白,为柯萨奇B组病毒(CVB)与腺病毒(ADV)的共同受体,在它们感染心肌细胞的过程中起着重要的介导作用.研究CAR在小鼠病毒性心肌炎(VMC)中表达的动力学特征,探讨其在病毒性心肌炎发病学中的意义及黄芪甲甙干预治疗对CAR表达的影响。 方法 (1)取BALB/C小鼠80只,分为实验组70只,对照组10只。实验组小鼠每只腹腔注射0.1mL内含1×10~2TCID_(50)CVB_3的Eagle's培养液,对照组小鼠每只腹腔注射不含病毒的Eagle's培养液0.1mL。实验组小鼠分别于接种病毒后3、7、15、30d随机各取10只处死,对照组小鼠在接种后30天处死作为总体对照。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化等方法半定量检测VMC小鼠不同时点心肌CAR基因转录及蛋白表达水平,同时应用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测血清IL-1β浓度。(2)取20只小鼠随机等分为对照组和重组IL-1β(rIL-1β)组,rIL-1β组皮下注射rIL-1β,1μg/0.1mL,对照组注射等量PBS,均连续使用5天,第10天处死全部小鼠并取其心脏,用RT-PCR及免疫组化半定量分析CAR mRNA及蛋白表达水平。(3)取BALB/C小鼠100只,随机分成6组。非感染小鼠腹腔无菌注射不含病毒的Eagle's培养液0.1mL,分为正常对照组(A组,10只,以羧甲基纤维素钠0.1mL灌胃7d)、高剂量对照组(B组,10只,9%黄芪甲甙0.1mL灌胃7d);余80只小鼠以腹腔无菌注射0.1mL内含1×10~2TCID_(50) CVB_3的Eagle's培养液制作VMC模型,VMC小鼠随机分为心肌炎对照组和低、中、高剂量干预组,分别以生理盐水、1%、3%、9%黄芪甲甙(分
张召才[7]2004年在《病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制及其药物干预研究》文中研究说明心肌纤维化是在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚或胶原成分发生改变,是病毒性心脏病(包括急、慢性心肌炎和部分扩张型心肌病)特征性病理变化,过度的心肌纤维化是病毒性心脏病出现心律失常、心力衰竭、心脏性猝死等并发症以及由心肌炎发展到心肌病的决定因素,但其发生机制尚未完全阐明。本研究致力于探讨心肌纤维化在病毒性心脏病不同阶段的发生机制并寻求有效的药物干预手段。全文共分为以下四部分: 第一部分:病毒性心脏病动物模型的建立目的 建立急、慢性心肌炎和扩张性心肌病系列动物模型。 方法 Balb/c 小鼠120 只,随机分为 3 组,分别 7 天组(n=30)、叁月组(n=40)和 9 月组(n=50)。从每组中任选 10 只,腹腔注射 Eagel’s 病毒培养液(EMEM),作为正常对照;其余小鼠均以柯萨奇病毒 B3 腹腔注射制作急、慢性心肌炎和扩张型心肌病动物模型;分别于接种后第 7 天、第 3 月和第 9 月对各组 (对照组和模型组) 小鼠行心脏超声检查;其后杀鼠取心脏作组织学和形态学检查,提取血清样品作后续生化检测。结果 第 7 天感染小鼠心肌细胞变性坏死、间质有大量炎性细胞浸润;第 3 月感染小鼠心肌内炎性细胞浸润减少,心肌间质纤维化明显,心脏收缩功能减退;第9 月小鼠心肌间质弥漫性纤维化而无炎性浸润, 心脏收缩功能明显减退、心腔扩张。 结论 以柯萨奇病毒 B3 感染 Balb/c 小鼠成功建立了急、慢性心肌炎和扩张型心肌病。关键词:心肌炎;扩张型心肌病;柯萨奇病毒 B;模型 第二部分:病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制研究目的 探讨病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制。 方法 对各期病毒性心脏病模型组以及对照组小鼠心脏切片行胶原特异的苦味酸天狼星红染色,计算胶原容积积分;以酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组小鼠血清 III 型前胶原氨基端前肽(PIIINP)、I 型前胶原氨基端前肽(PINP)和 I 型前胶原羧基端前肽(PICP);以免疫印迹增强化学发光法(Western Blot ECL)检测各组小鼠心肌中致纤维化细胞因子(TGFβ1 和 PDGF-B)、胶原酶及其组织抑制物(MMP1/TIMP1、MMP13 1 复旦大学博士论文. 2004<WP=5>病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制及其药物干预研究中文摘要和 MMP14)、醛固酮合成酶(CYBIIB2)和 11β羟类固醇脱氢酶(11β-HSD)的表达;以微矩阵基因芯片分析各组小鼠心肌组织中非胶原细胞外基质(ECM)基因的表达变化,其后以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法验证芯片筛选结果;以缺口末断标记(TUNEL)法检测各组小鼠心肌细胞凋亡,其后以小鼠细胞凋亡专用基因芯片检测凋亡相关基因的表达变化。 结果 组织学和血清学检测结果显示:急性期胶原的合成和分解同时增强,为修复性纤维化;慢性期是修复性纤维化与反应性纤维化并存,胶原合成增多而降解减少;心肌病期主要是反应性纤维化,胶原合成亢进。致纤维化细胞因子 TGF-β1 在各期病毒性心脏病小鼠心肌中表达上调;另一个致纤维化细胞因子 PDGF 在病程中无变化。心肌局部醛固酮合成酶(CYP11B2)在感染急性期即表达增多,慢性期和心肌病期其表达上调更加显着,提示心脏局部 RAS 系统可能对病程起重要作用;11β类固醇脱氢酶(11β-HSD)对病程无影响。MMP-1 的表达量随病程进行性减少,而 TIMP-1表达量在病程中无变化,MMP-1/TIMP-1 比例进行性下降;MMP13 的表达随病程逐渐增多;MMP14 在感染早期表达上调,慢性期和心肌病期无变化。基因芯片和 RT-PCR 检测证实, 急性期有 5 个非胶原性 ECM 基因表达异常增高,其中有 ILK 和 Lamr1 是肿瘤相关基因,ADAMTS1 与炎症和肿瘤侵袭均有关的基因,Fin15 与 Itgb1bp1 的功能需要进一步确定;细胞凋亡贯穿病毒性心脏病全程,凋亡专用基因芯片发现多个凋亡相关基因在病程中异常表达。 结论 心脏局部微环境发生重大变化是病毒性心脏病发生心肌纤维化的原因, 这些变化包括心脏局部 RAS 功能紊乱,致纤维化细胞因子、胶原酶、非胶原性 ECM 异常表达,细胞凋亡活跃等。关键词:心肌纤维化;胶原酶;基因芯片;细胞凋亡;细胞外基质 第叁部分:黄芪甲甙对病毒性心肌炎心肌纤维化的影响目的 观察黄芪甲甙对急、慢性心肌炎小鼠心肌纤维化的影响并探讨其作用机理。 方法 研究分为急性期和慢性期干预两部分。急性期:Balb/c小鼠 100 只,随机分成 6 组。非感染小鼠腹腔注射病毒培养液,分为正常对照(A组,12 只, 以生理盐水灌胃 7d)、高剂量黄芪甲甙对照组(B组,16 只, 黄芪甲甙 0.6 mL/kg.d-1灌胃 7d);余 72 只小鼠以柯萨奇病毒(CVB3)腹腔注射制作病毒性心肌炎模型,感染小鼠分别为心肌炎对照组和低、中、高剂量黄芪甲甙干预心肌炎组,分别以生理盐水和低、中、高剂量(0.07, 0.2, 0.6 mL/kg.d-1)黄芪甲甙灌胃 7d (分别为C、D、E、F组,每组 18 只)。14d后处死小鼠,以ELISA法检测血清胶原前肽(PICP、PINP和PIIINP)浓度,心脏组织用天狼星红染色后测定胶原容积积 2 复旦大学博士论文. 2004<WP=6>病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制及其药物干预研究 中文摘要分(CVF),以流
王莹威[8]2006年在《益气养阴降浊法对CVB_（3m）重复感染致病毒性心肌炎心室重构影响的研究》文中研究指明目的:探讨重复感染致病毒性心肌炎心室重构的发生机制,MMPs家族在心肌炎心室重构过程的作用及与相关的细胞因子之间的作用。通过中药干预探讨对心肌炎心肌损伤的保护作用及其作用机制。 方法:建立重复感染病毒性心肌炎模型:用CVB_(3m)病毒以剂量梯度倍增方式连续4次经腹腔感染小鼠,治疗组于首次接种病毒当日给予灌胃给药,持续至60天。在末次感染后不同时期观察HE染色光镜下心肌形态学变化、脏器指数变化、VG染色心肌胶原间质增生变化、RT-PCR法测定心肌中细胞因子MMP-1、TIMP-1、TNF-α、TGF-β_1的mRNA表达水平;Western Blot法检测心肌中的MMP-1和TIMP-1的蛋白表达水平,ELISA法测定血清中TNF-α和TGF-β_1水平。 结果:①病理结果显示,正常对照组小鼠心肌组织未见异常,中药组、西药组小鼠心肌组织病理改变较病毒组明显减轻。②心脏指数变化:病毒组、中药组、西药组小鼠心脏指数高于正常组,但病毒组小鼠心脏指数明显高于中药组和西药组。③病毒性心肌炎急性期(末次感染后5～10d),心肌内坏死灶较多,大量炎细胞浸润,TNF-α转录和翻译水平明显增加。MMP-1变化与TNF-α并行;各治疗组对早期TNF-α mRNA表达有抑制作用,同时亦对MMP-1表达有抑制作用;在慢性期(末次感染后20d)心肌坏死灶逐渐吸收,胶原增生明显,血清中TGF-β_1表达增加,心肌中TIMP-1水平与之并行。出现早期心肌纤维化改变。各治疗组检测结果显示:对TGF-β_1表达有明显降低趋势,同时亦下调TIMP-1表达水平,且与病毒组相比,具有统计学意义。 结论:①本实验成功地建立了重复感染致病毒性心肌炎心肌坏死和心室重构的实验动物模型。②本研究通过实验证实本法
申锷[9]2007年在《CVB_3致小鼠病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制及其药物治疗研究》文中研究指明心肌纤维化是指心肌组织中胶原纤维过量积聚或胶原成分和/或比例发生变化,是病毒性心脏病(包括急、慢性心肌炎和部分扩张型心肌病)的特征性病理表现。心肌组织过度纤维化可引起心脏结构和功能异常,被认为是心肌炎发展到心肌病的关键因素,但其详尽发生机制不明。本研究致力于探讨病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制并寻求有效的药物治疗。全文共分为以下四部分:第一部分:病毒性心肌炎、扩张型心肌病动物模型的建立目的建立小鼠急、慢性心肌炎和扩张性心肌病系列模型。方法雄性Balb/c小鼠100只,随机分为3组,分别为7天组(day7,n=30)、3月组(mon3,n=30)和9月组(mon9,n=40)。每组中任选10只小鼠,腹腔注射不含病毒的Eagel's培养液(EMEM)作为正常对照;其余小鼠以单次或增量重复腹腔接种柯萨奇病毒B_3(CVB_3)制作急性、慢性心肌炎以及扩张型心肌病的动物模型;分别于接种后第7天、第3月末和第9月末对模型组及同期对照组小鼠行心脏超声检查,其后处死小鼠取心脏行组织病理学检查。结果小鼠感染CVB_3后第7天为炎症高峰期,病理表现为心肌纤维断裂、心肌细胞变性坏死、间质有大量炎症性细胞浸润,有心肌纤维化发生,但局限在心肌坏死灶周边,心室大小和心功能无变化;第3月末感染小鼠无明显心肌纤维断裂,心肌内炎性细胞浸润减少,心肌间质纤维化明显,心脏收缩功能减退;第9月末小鼠心肌间质大量胶原异常增生呈弥漫性分布而几无炎性细胞浸润,左室腔明显扩大、心脏收缩功能进一步显着减退。结论以CVB_3单次或增量重复感染Balb/c小鼠成功建立了急、慢性心肌炎和扩张型心肌病动物模型。第二部分:ADAMTS-1在病毒性心脏病心肌纤维化的作用机制目的探讨ADAMTS-1在病毒性心脏病心肌纤维化中的作用及其可能机制。方法分为体内和体外实验。体内实验,对各期病毒性心脏病模型组及其对照组小鼠心脏切片行胶原特异的苦味酸天狼猩红染色,计算胶原容积积分;RT-PCR检测小鼠心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-betal的mRNA表达变化;同期实时定量PCR(Real-timePCR)法检测小鼠心肌组织中细胞外基质(ECM)基因ADAMTS-1的改变,分析其与心肌纤维化的关系。体外实验,利用差速贴壁法分离、培养小鼠心肌成纤维细胞,分别以ADAMTS-1细胞因子、TGF-beta单用或联合应用处理成纤维细胞,分别检测成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA水平的变化。结果体内实验结果表明,各期病毒性心脏病小鼠均发生不同程度的心肌纤维化以扩心病期最为显着;慢性心肌炎及心肌病小鼠心肌组织内Ⅰ型胶原增生明显,并以扩心病组为着;Ⅲ型胶原只在扩心病有明显增加;与同期对照组比较,各病毒组小鼠心肌内TGF-betal mRNA亦明显增加,以慢性组及扩心病增加显着,扩心病组与慢性组比较,TGF-betal无显着差异;ADAMTS-1mRNA在各病毒组小鼠心肌组织中表达均较同期对照组明显增高,且以CVB_3感染后3月组为着。体外实验表明,致纤维化因子TGF-beta增加Ⅰ型胶原的合成,对Ⅲ型胶原mRNA表达无明显影响;利用ADAMTS-1细胞因子预处理心肌成纤维细胞后,再以TGF-beta继续处理心肌成纤维细胞,发现心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原表达明显减少。结论ADAMTS—1与CVB_3感染所致病毒性心脏病心肌纤维化关系密切,可能是通过抑制TGF-beta活动来降低Ⅰ型胶原mRNA的表达。第叁部分螺内酯改善扩张型心肌病心肌纤维化左室重构的作用机制目的探讨螺内酯对小鼠扩张型心肌病心肌纤维化左室重构的作用机理。方法Balb/c小鼠60只,随机分为对照组(con,n=10)、扩心病组(DCM,n=30)、扩心病+螺内酯干预组(Spi,n=20)。扩心病及螺内酯治疗组小鼠给予腹腔接种CVB_3;对照组小鼠腹腔注射EMEM。对照组和扩心病组小鼠每日以饮用水喂养,螺内酯治疗组在饮用水中加入螺内酯,药物浓度为20mg/L。9个月末行心超检查后,处死小鼠取心脏,以组织病理学方法进一步确认心肌纤维化的转归,其后运用Western Blot法检测心肌组织中致纤维化因子TGF-β1及其下游信号转导通路上关键调控蛋白p-Smad2/3、Smad4和Smad7的表达变化;以RT-PCR检测ADAMTS-1及PCPE-1 mRNA的变化。结果螺内酯治疗降低心肌胶原容积积分,减轻左室扩大,提高左室收缩功能,进而改善心室重构;Western blot结果显示,螺内酯治疗明显降低TGF-β1、p-Smad2/3及Smad4的表达,同时上调TGF-β1信号通路上负调控蛋白Smad7的表达。PCPE-1是水解Ⅰ型前胶原形成Ⅰ型胶原的限速步骤,螺内酯能显着降低PCPE-1mRNA的表达。螺内酯对ADAMTS-1表达无影响。结论螺内酯通过抗纤维化作用而改善左室重构,这一作用的部分机制可能是通过螺内酯影响TGF-betal/Smads信号通路上关键调控蛋白的活动和抑制PCPE-1表达实现的。第四部分:黄芪甲甙对CVB_3感染后扩张型心肌病心肌纤维化的影响目的研究黄芪甲甙对CVB_3致扩张型心肌病心肌纤维化的影响。方法Balb/c小鼠60只,随机分为正常对照组10只、扩心病组30只及扩心病+黄芪甲甙干预组20只。正常对照组小鼠腹腔注射EMEM,扩心病组及黄芪甲甙治疗组给予腹腔接种CVB_3;正常组及扩心病组每日以饮用水喂养,黄芪甲甙组在饮用水中加入黄芪甲甙,药物浓度为300mg/L。观察小鼠死亡率,并在9个月末心超检查后处死小鼠,血清学测定胶原前肽(PICP和PINP)的含量并计算PICP/PINP的比率,组织病理学及用偏光显微镜成像技术检测胶原转归情况并运用图像分析软件计算CVF和Ⅰ型胶原纤维含量,以Western Blot法检测实验小鼠心脏组织中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4和Smad7的表达以及p38MAPK磷酸化活动的变化,RT-PCR方法检测ADAMTS-1及Ⅰ型胶原mRNA水平变化。结果黄芪甲甙明显降低小鼠死亡率(35%vs 56%,P<0.05);降低血清中胶原前肽PICP含量及PICP/PINP比率;组织病理学检测结果表明黄芪甲甙显着降低心肌组织中CVF及Ⅰ型胶原纤维的堆积。蛋白定量检测结果显示:黄芪甲甙降低TGF-β1、p-Smad2/3及Smad4的表达,以Smad4表达降低最明显,对Smad7的表达无明显作用;抑制p38MAPK的磷酸化活动;Ⅰ型胶原是TGF-β1/Smad和TGF-β1/p38MAPK信号通路的靶基因,黄芪甲甙明显降低Ⅰ型胶原mRNA的表达。黄芪甲甙降低ADAMTS-1mRNA表达。结论:黄芪甲甙降低扩张型心肌病小鼠死亡率、减轻心肌纤维化;黄芪甲甙通过抑制TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4及p38MAPK活动发挥抗纤维化作用。
邓立梅[10]2007年在《益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌病小鼠心肌基质金属蛋白酶及其组织抑制因子的影响》文中进行了进一步梳理目的：以重复感染的病毒性心肌病小鼠为模型，观察中药益气养阴、活血化瘀方对其心肌基质金属蛋白酶1及其组织抑制因子1的影响，为今后防治病毒性心肌病提供客观理论依据。方法：采用反复多次腹腔注射CVB_(3m)的方法，建立重复感染的病毒性心肌病小鼠模型。将240只Balb／c小鼠随机分为4组，模型对照组、中药高剂量组、中药低剂量组及马来酸依那普利组，每组各60只。另取30只Balb／c小鼠做为空白对照组。采用常规的方法观察病毒性心肌病小鼠心脏质量指数；采用HE、VG染色观察其心肌病理形态及超微结构；采用RT-PCR法观察其心肌基质金属蛋白酶1(MMP1)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)的表达水平。结果：1．益气养阴、活血化瘀方能降低病毒性心肌病小鼠心脏质量指数，以高剂量组效果为佳。2．益气养阴、活血化瘀方能明显改善病毒性心肌病小鼠心肌病理形态及超微结构的变化，从而减轻其心肌病理损伤。3．益气养阴、活血化瘀方能下调病毒性心肌病小鼠心肌组织MMP1 mRNA的表达水平，升高TIMP1 mRNA的表达水平，以高剂量组效果为佳。结论：益气养阴、活血化瘀方能下调病毒性心肌病小鼠心肌组织MMP1 mRNA的表达水平，升高TIMP1 mRNA的表达水平，抑制细胞外基质降解及心肌重构，这可能是其防治病毒性心肌病的作用机制之一。
参考文献：
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[4]. 益气养阴、活血化瘀法对病毒性心肌疾病小鼠T细胞亚群影响的研究[D]. 张占军. 黑龙江中医药大学. 2008
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[8]. 益气养阴降浊法对CVB_（3m）重复感染致病毒性心肌炎心室重构影响的研究[D]. 王莹威. 黑龙江中医药大学. 2006
[9]. CVB_3致小鼠病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制及其药物治疗研究[D]. 申锷. 复旦大学. 2007
[10]. 益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌病小鼠心肌基质金属蛋白酶及其组织抑制因子的影响[D]. 邓立梅. 黑龙江中医药大学. 2007
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