（1哈尔滨医科大学基础医学院免疫教研室 黑龙江哈尔滨 150081）
（2黑龙江省农垦总局疾病预防控制中心 黑龙江哈尔滨 150090）
【摘要】目的：研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)和顺铂对前列腺癌细胞的杀伤作用及其协同作用。方法：选用前列腺癌细胞株DU145，将生长良好的细胞接种于96孔培养板，培养24h后用顺铂（1,5,10μg/ml）和TRAIL（10,100，1000ng/ml）分别/联合作用24h，倒置显微镜下观察细胞的形态变化，然后用MTT法测定细胞的生长抑制率。结果：（1）细胞形态变化：（100，1000ng/ml）的TRAIL组、（5,10μg/ml）的顺铂组、以及上述浓度的TRAIL和顺铂联合用药组部分细胞变圆，从培养皿壁脱落，核/浆比例增大，胞浆颗粒增多，胞核有皱缩变形，大小不均。上述改变的程度随着药物浓度的增加而加重。（2）细胞生长抑制率：细胞生长抑制率10ng/mLTRAIL和1μg/mL顺铂对DU145的生长抑制率和不用药组比较无显著性差异(P>0.05);(100,1000)ng/mLTRAIL和(5,10)μg/mL顺铂对DU145的生长抑制率显著高于阴性对照组(P<0.05),而且随着TRAIL和顺铂浓度的升高,生长抑制率显著增高(P<0.05);(100,1000)ng/mL的TRAIL和(5,10)μg/mL的顺铂分别联合作用对DU145的抑制率均高于单独给药组(P<0.05);10ng/mL的TRAIL单独用药对DU145的抑制作用虽不显著(P>0.05),但和(5,10)μg/mL 顺铂联合用药均能加强后者对DU145的抑制作用(P<0.05)。结论：TRAIL和顺铂在杀伤前列腺癌细胞时存在协同作用。
【关键词】TRAIL；顺铂；前列腺癌细胞；协同作用
【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）24-0073-02
TRAIL是新发现的肿瘤坏死因子超家族成员，其受体广泛表达于人体组织器官。TRAIL及其受体在诱导肿瘤细胞凋亡的同时能保护正常细胞而免于细胞毒副反应[1]，提示TRAIL可能成为一种新的抗肿瘤药物[2]。化疗药物与TRAIL联合使用时，可提高肿瘤细胞的凋亡率，这已在膀胱癌、直肠癌等恶性肿瘤的体内、体外实验中得到证实，但其两者对前列腺癌是否也存在协同作用，文献中却鲜有报道。本研究应用TRAIL和化疗药物顺铂联合作用DU145，观察其细胞形态及生长抑制率的变化，以初步探讨TRAIL和顺铂在杀伤前列腺癌细胞上是否存在协同作用，为进一步的机制研究和临床应用提供实验依据。
1.材料与方法
1.1 实验材料
前列腺癌DU145细胞株，TRAIL均由日本富山大学提供，顺铂购自Selleck Chemicals(美国)，二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) 购自 Sigma(美国)，RPMI1640培养液购自Gibco（美国）。
1.2 实验方法
1.2.1细胞培养 DU145用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640培养液，于37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱内常规培养。
1.2.2 MTT法测定细胞抑制率 将生长良好的DU145调至浓度为1×105/L，接种于96孔培养板，每孔100μL，培养24h后换成含不同浓度的顺铂(1、5、10μg/mL)、TRAIL(10、100、1000ng/mL)的培养液继续培养，每个浓度组设3个复孔，并设阴性对照组(不加顺铂和TRAIL)和空白对照组(不接种细胞，只加培养液)，24h后倒置显微镜下观察细胞形态的变化，然后加入5g/L的MTT溶液20μL/孔，继续培养4h，轻轻吸弃每孔中培养液，保留孔底部的沉淀，再加入DMSO150μL/孔，轻轻振荡摇匀后用酶标仪测其吸光度(A值)，测量波长570nm，参考波长690nm，重复检测3次。计算其生长抑制率（CI）=（阴性对照组A值-试验组A值）/阴性对照组A值×100%。
联合用药方法：将上述单独作用的各浓度 TRAIL和顺铂分别进行两两联合作用，其余步骤同上。
1.2.3统计方法
实验数据均用x-±s表示，SPSS 10.0统计软件，采用方差分析法进行处理。
2.结果
2.1 细胞形态变化
倒置显微镜下，10ng/mL TRAIL组、1μg/mL顺铂组的细胞形态和阴性对照组无明显差异：细胞呈梭形，贴壁良好，胞浆透亮且颗粒少，核圆且均匀。
(100，1000)ng/mL TRAIL组、(5，10)μg/mL的顺铂组、以及上述浓度的TRAIL和顺铂联合用药组的细胞形态发生明显变化:部分细胞变圆，从培养皿脱落，核/浆比例增大，胞浆颗粒增多，胞核有皱缩或胀大变形，大小不均。上述改变的程度随着药物浓度的增加而加重。
2.2 细胞生长抑制率
见表。
*P<0.05 对比第二组；△P<0.05对比第六组；■P<0.05对比第十组
3.讨论
前列腺癌是目前最常见的泌尿系统肿瘤，2012年美国癌症学会公布美国癌症的统计数据，其发病率占全身肿瘤第1位，死亡率占第2位，而亚洲男性前列腺癌发病也呈现持续增长趋势[3]。
TRAIL及其受体是TNF家族的一员，能够诱导多种肿瘤细胞发生凋亡作用，而对正常的细胞组织不具有明显的毒性作用[4]。TRAIL的这种选择性诱导肿瘤细胞凋亡的特点使其成为近年来研究较多的、潜在的抗肿瘤药物之一[5]。
顺铂是一种类烷化剂的金属铂类化合物，是目前临床常用化疗药物，作用机理是能够导致DNA链内或链间交联，或是DNA-蛋白质交联，改变DNA的修复作用，引起DNA修复障碍，抑制肿瘤细胞的分裂[6]。但顺铂的毒性大，对胃肠道、肾、神经系统及骨髓等都有严重的毒副作用[7]。因此，本实验设计联合TRAIL作用，能否降低顺铂的用量，又能提高或加强作用效果，使顺铂的应用更加安全。
本实验选用激素非依赖的DU145，采用不同浓度的TRAIL和顺铂对其进行单独和联合用药，观察其两者在DU145凋亡上的相互作用。
结果发现：(100，1000)ng/mL浓度的TRAIL和(5，10)μg/mL浓度的顺铂单独用药对DU145具有杀伤作用，联合用药时具有协同作用；10ng/mL浓度的TRAIL虽然单独用药时对DU145无明显杀伤作用，但联合(5，10)μg/mL浓度的顺铂时却能增强对DU145的杀伤作用。考虑原因可能是：小剂量的TRAIL虽然不能单独对肿瘤细胞产生明显的杀伤作用，但它可能已使肿瘤细胞的凋亡通路发生某些改变，在随后的化疗药物作用下能使更多的肿瘤细胞受到杀伤。文献报道，非毒性剂量的化疗药物可以增加TRAIL对肿瘤细胞诱导凋亡的作用，Lacour等证实，顺铂和依托泊苷可以上调DR4和DR5mRNA水平[8]。
综上所述，将不同浓度的TRAIL作用于前列腺癌细胞株，具有与药物浓度依赖的量效关系，并且化疗药物顺铂的联合作用可以增强细胞对TRAIL的反应性。本实验证实TRAIL和顺铂联合应用协同诱导了前列腺癌细胞的凋亡，为临床选择方便、有效的前列腺癌化疗增效方法提供实验依据。
【参考文献】
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[2] Pitti RM,Marsters SA,Ruppert S.Induction of apoptosis by Apo-2ligand,a new member of the tumor necrosis factor receptor family[J].J Biol Chem,1996,271(22):12687-12690.
[3] Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin, 2014,64(1):9-29.
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[5] Ashkenazi A,Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily.[J].Nat Rev Cancer;2002,2(6):420-430.
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[7] Isaacs JT,Lundmo PI,Berges R,et al.Androgen regulation of programmed death of normal and malignant prostatic cells.[J]Androl 1992;13(6):457-464.
[8] Lacour S,Hammann A,Wotawa A,et al.Anticancer agents sensitize tumor cells to tumor necrosis factor-ralated apoptosis inducing ligand mediated caspase-8 activation and apoptosis.[J]Cancer Res,2001,61(4):1645-1651.
论文作者:周珣,谷宇佳
论文发表刊物:《心理医生》2016年24期
论文发表时间:2016/12/6
标签：细胞论文; 作用论文; 和顺论文; 浓度论文; 肿瘤论文; 抑制论文; 药物论文; 《心理医生》2016年24期论文;