李庆富1 薛江楠2（通讯作者）
（1滨州医学院 山东烟台 264003）
（2滨州医学院免疫学教研室 山东烟台 264003）
【摘要】目的：探讨椎间盘源性腰痛患者中聚集蛋白聚糖酶-1（Aggrecanases-1）、金属蛋白酶组织抑制剂3（TIMP-3）以及Ⅱ型胶原的表达与意义。方法：选取聊城市第二人民医院2014年6月至2015年6月收治的18例先天性腰椎管狭窄需行手术治疗患者为对照组，并以同期住院的48例椎间盘源性腰痛手术患者为实验组，其中29例Dallas CT椎间盘造影Ⅱ级患者为实验1组，19例Dallas CT椎间盘造影Ⅲ级患者为实验2组。分别对三组患者开展Aggrecanases-1、TIMP-3以及Ⅱ型胶原等临床检验，观察各组间指标表现差异，并分析相关临床检验的开展价值。结果：三组患者的Aggrecanases-1、Ⅱ型胶原以及TIMP-3细胞因子在正常髓核及纤维环破裂的髓核组织中均表达，且表达存在差异，均具有统计学意义（P<0.05）。结论：Aggrecanases-1、TIMP-3以及Ⅱ型胶原等指标的表达与纤维环不同破裂程度的椎间盘有密切关联，对椎间盘源性腰痛有良好的评估作用。
【关键词】椎间盘源性腰痛；聚集蛋白聚糖酶-1；金属蛋白酶组织抑制剂3；Ⅱ型胶原；纤维环破裂
【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）02-0028-02
【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of -1 (Aggrecanases-1) and tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (TIMP-3) and type II collagen in patients with lumbar back pain. Methods Select the second people's Hospital of Liaocheng City, June 2014 to 2015 June 18 cases of congenital spinal canal stricture underwent surgical operation patients as control group, and at the same time hospitalized 48 cases of intervertebral disc source of low back pain patients as the experimental group, which 29 cases of Dallas CT intervertebral discography grade II patients into experimental group 1, 19 Dallas CT intervertebral discography class III patients as experimental group 2. Three groups of patients with Aggrecanases-1, TIMP-3 and type II collagen and other clinical tests were carried out to observe the differences between the indicators of each group, and to analyze the clinical value of the relevant clinical tests. Results The three groups of patients Aggrecanases-1, type II collagen and TIMP-3 cytokines in normal nucleus pulposus and annulus fibrosus rupture of the nucleus pulposus were expressed, and the expression differences have statistical significance (P < 0.05). Conclusion The expression of Aggrecanases-1, TIMP-3 and type II collagen is closely related to the different rupture degree of the intervertebral disc, which has a good effect on the evaluation of the intervertebral disc source low back pain.
【Key words】Low back pain of lumbar intervertebral disc; Aggregation protein xylanase -1; Tissue inhibitor of metalloproteinase 3; Type II collagen; fiber ring rupture
腰痛是脊柱疾病最常见的临床症状, 引起腰痛的原因主要包括软组织性、神经根性的、结构性以及退变性。上世纪70年代末，国外学者Park等[1]首先提出了腰椎间盘源性腰痛的概念，主要与腰椎间盘髓核退变存在密切关联，其发病机制和临床症状不同于神经根性腰痛。目前，临床已证实在下腰痛患者中椎间盘源性腰痛大约占85%[2]，致使椎间盘源性腰痛已经成为目前的研究焦点。本次研究针对椎间盘源性腰痛患者分别进行Aggrecanases-1、TIMP-3及Ⅱ型胶原等临床检验，旨在进一步明确该疾病患者的发病机制，为盘源性腰痛的靶向治疗提供分子生物学依据。现报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年6月至2015年6月聊城市第二人民医院骨科收治的48例椎间盘源性腰痛手术患者为实验组，并以同期住院的18例先天性腰椎管狭窄需行手术治疗患者为对照组。根据实验组患者的Dallas CT椎间盘造影分级情况来评估纤维环破裂程度，其中29例Dallas Ⅱ级患者为实验1组，19例Dallas Ⅲ级患者为实验2组。对照组患者中男性11例，女性7例，年龄31～52岁，平均（40.7±5.3）岁；实验组患者中男性27例，女性21例，年龄34～54岁，平均（41.8±5.6）岁。三组患者临床一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 方法
1.2.1 HE染色法 将标本石蜡包埋后切片进行常规苏木精-伊红（HE）染色，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜观察细胞形态。可见对照组中流线型纤维环细胞排列，髓核内细胞数量较多，分布稀疏，细胞体积大，细胞质染色较深；而在实验组内，髓核细胞数量明显减少，并被基质分隔，细胞聚集，形成多个细胞岛，细胞外基质分散，而且纤维环裂变断开，纤维排列紊乱；纤维环破裂可见有肉芽组织增生，多数伴有巨噬细胞浸润，并发现有毛细血管生成。
1.2.2免疫组化法 ①实验试剂：二甲苯、苏木素染色剂；30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇；伊红染色剂；3%双氧水；PBS缓冲液（ph7.4）；胰酶（1∶3稀释，福州迈新生物技术开发有限公司）；Aggrecanase 1 兔抗人多克隆一抗；TIMP-3 兔抗人多克隆一抗；Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体；0.05%DAB(大连博瑞得公司)；生物素；返兰液；中性树胶。②实验步骤：63℃烤箱烤片2h；二甲苯脱蜡3次，每次10min；由100%、95%、80%梯度乙醇脱蜡水，每次1min；蒸馏水浸泡3min；3%H2O2避光室温下孵育10min；PBS浸泡3次，每次3min；滴加胰酶至玻片抗原修复25min；PBS浸泡3次，每次3min；滴加Aggrecanase-1一抗或TIMP-3一抗或Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体室温孵育1h；PBS浸泡3次，每次3min；滴加二抗室温孵育15min；PBS浸泡3次，每次3min；显色剂（DAB）显色15min；蒸馏水浸泡10min；生物素衬染5min；蒸馏水浸泡2min；返兰液5s；热水浴（40～50℃）1min；由80%、95%、100%梯度乙醇脱水，每次1min；晾干后树脂封片，镜下观察。
1.3 观察指标
所有染色切片均由同1位富有经验的实验室专职人员在同一条件下采用双盲法用光学显微镜阅片，确定细胞总数及阳性表达的细胞数。聚集蛋白聚糖酶-1和TIMP-3以及Ⅱ型胶原结果判定标准：聚集蛋白聚糖酶1和TIMP-3以及Ⅱ型胶原阳性表达为棕黄色，主要存在于细胞核和细胞浆。采用半定量方法，随机选取5个400倍视野，计算椎间盘髓核细胞中聚集蛋白聚糖酶-1和TIMP-3以及Ⅱ型胶原表达的染色阳性细胞数占总细胞数的百分比(％)。染色细胞<25％，设定为“-”；25～50％，定为“+”；>50%，设定为“++”。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，两两组间比较使用q检验，三组间比较使用单因素方差分析（F检验），P＜0.05表示差异具有统计学意义。采用Spearman等级相关分析方法分析Aggrecanases-1、TIMP-3以及Ⅱ型胶原与纤维环不同破裂程度椎间盘的相关性，P＜0.05表示具有统计学意义。
2.结果
蛋白聚糖酶1和TIMP-3以及Ⅱ型胶原在椎间盘髓核细胞的细胞浆、细胞核均有表达，阳性反应呈棕褐色。对照组显微镜下见髓核细胞似圆形或椭圆形，蛋白聚糖酶1少量阳性表达，TIMP-3中等阳性表达。实验1组和实验2组可见髓核细胞呈团簇状生长，蛋白聚糖酶1和TIMP-3阳性表达均明显增多。三组患者的Aggrecanases-1、Ⅱ型胶原以及TIMP-3阳性率表达比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表1。
Aggrecanases-1、TIMP-3在退变椎间盘组织中随纤维环破裂程度的提高有升高趋势，与Dallas CT椎间盘造影分级成正相关。而Ⅱ型胶原在退变椎间盘组织中随纤维环破裂程度的提高而呈下降趋势，与Dallas CT椎间盘造影分级成负相关。（分别rs=0.573，P<0.05；rs=0.554，P<0.05；rs=-0.777，P<0.05）
3 讨论
椎间盘是人体中最大无血液供应的器官，对它的神经分布到目前才有所了解。正常的椎间盘深层没有神经纤维支配，仅纤维环的外层和后纵韧带由窦椎神经的分支支配，外层纤维环中的神经末梢，在病理状态下释放与疼痛相关的神经肽[3]。而在变性的椎间盘中，神经纤维可随着肉芽组织深入到椎间盘深层，且在病变椎间盘外层纤维环中，神经纤维的密度明显高于正常椎间盘。目前认为椎间盘退变是导致椎间盘源性腰痛的主要原因[4]，阐明细胞因子在椎间盘退变中的病理作用，将会加深人们对上述问题的认识。
综上所述，Aggrecanases-1、TIMP-3以及Ⅱ型胶原等指标的表达与纤维环不同破裂程度的椎间盘存在密切相关性，Aggrecanases-1、TIMP-3在退变椎间盘组织中随纤维环破裂程度的提高有升高趋势。而Ⅱ型胶原在退变椎间盘组织中随纤维环破裂程度的提高而呈下降趋势，对椎间盘源性腰痛有良好的评估作用。
【参考文献】
[1]Park WM, McCall IW, O’Brien JP, et al. Fissuring of the posterior annulus fibrosus in the lumbar spine[J]. Br J Radiol,1979,52(617):382-387.
[2]夏群,梁威.椎间盘源性腰痛的诊治进展[J].天津医药,2015,43(11):1244-1249.
[3]张莉,秦丹霞,张细娇.腹针治疗椎间盘源性腰痛[J].中医正骨,2015,27(10):38-39.
[4]胡涛,朱明双,龚维等.浅谈椎间盘源性下腰痛的诊断与鉴别诊断[J].亚太传统医药,2015,11(23):64-65.
论文作者:李庆富1,薛江楠2（通讯作者）
论文发表刊物:《心理医生》2016年2期
论文发表时间:2016/7/27
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