（昆明医科大学暨云南省天然药物药理重点实验室 云南 昆明 650031）
【摘要】 本文对血管生成在肿瘤发生发展中的重要作用加以阐述，针对近年来肿瘤血管新生抑制剂的体内外筛选模型研究方法进行了整理归纳，为进一步探索临床用药提供可靠的实验依据。
【关键词】 肿瘤；血管新生；抑制剂；筛选模型
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）23-0011-02
The research progress of tumor angiogenesis inhibitor screening model SuQian, QingChen.
Yunnan key Laboratory of Pharmacology for Natural Products,Kunming Medical University,Yunnan Province, Kunming 650031,China
【Abstract】Inthis paper, its important role in the development of angiogenesis in tumor are discussed. In recent years, we observe some methods of the screening model in vivo and in vitro studies which is targeting tumor angiogenesis inhibitorsin order to provide more reliable experimental basis for clinical medication.
【Key words】The tumor; Angiogenesis; Inhibitor; Screening model
1.引言
自1971年Folkman首次提出肿瘤生长具有血管依赖性的假设以来，抑制肿瘤血管新生作为抗肿瘤治疗的新途径日益受到重视[1]。通过阻断肿瘤的营养供应、抑制肿瘤血管生成，达到控制肿瘤生长和转移的目的，对于实体肿瘤的治疗具有重大意义。
人体肿瘤大部分是实体瘤，实体肿瘤组织主要由肿瘤细胞和间质构成，间质主要包括血管、淋巴管、结缔组织及细胞外基质等，起到营养和支持肿瘤细胞的作用[2]。当实体瘤生长超过1～2mm?时（约1×106个肿瘤细胞），通过被动扩散提供的营养和氧气已不能满足其生长的需要，此时必须有新生血管的介入才能维持肿瘤组织的存活并支持其生长，否则将引起肿瘤细胞的死亡或使其进入休眠状态[3]。
肿瘤组织内的新生血管是通过血管生成来实现的，恶性肿瘤的生长、侵袭和转移均依赖于肿瘤血管的生成[4]。肿瘤新生血管在结构上存在缺陷，呈现无序的分布方式，亦无完整的微循环功能，与宿主正常组织的血管存在较大差异，属于未分化成熟的血管[5]。由于肿瘤基因组不稳定及高度异质性等特点，干预肿瘤血管内皮细胞、肿瘤细胞与其微环境间的信号网络应比直接攻击肿瘤细胞取得更好的效果，因此肿瘤血管新生抑制剂在治疗实体瘤方面具有高效、低毒、不易产生耐药性的优点，从而使得抗血管生成疗法在临床治疗中具有广阔的应用前景[6]。但由于临床用肿瘤血管新生抑制剂在特异体质、特殊疾病的患者中仍存在治疗风险，故继续寻找和发现新的抗肿瘤血管新生抑制剂有望改善和提高实体瘤临床化疗疗效。要达到此目的，用于筛选和发现肿瘤血管新生抑制剂的体内外模型研究是其重要基础。本文就临床前肿瘤血管新生抑制剂筛选和研究的实验模型及相关方法作简要介绍。
2.体外肿瘤血管新生抑制剂筛选模型
2.1.血管内皮细胞增殖检测方法
血管内皮细胞一般呈单层生长，有接触抑制现象，呈典型的铺路石状，电镜下可以看到Weibel-Palade小体。在培养条件下可形成管形，像原始血管形成或损伤后的血管再生，这被认为是血管内皮细胞独有的特征。
血管内皮细胞增殖是血管发生的重要步骤[7]。目前已有多种成熟的细胞增殖测定方法：如四氮唑盐还原法和[3H]-胸腺嘧啶掺入法。
2.1.1四氮唑盐还原法(又称MTT 比色法) 是一种最常用的检测细胞存活和生长的方法[8]。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。其结晶形成量与活细胞数成正比，由此判定细胞的存活与增殖状况。
2.1.2[3H]-胸腺嘧啶掺入法 是另一种测定细胞增殖的方法。将同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)作为DNA合成前体掺入增殖细胞中，通过测定细胞内放射性物质的相对量可反映细胞增殖情况[9]。
2.2 血管内皮迁移检测方法
目前关于血管内皮细胞迁移的检测方法已有很多种[10]，其中以改良的Boyden Chamber 或Transwell法最常用。这两种方法均是通过观测穿过一定孔径(多为8μm) 硝酸纤维素薄膜的细胞数量来确定细胞的迁移能力。
2.2.1 Boyden Chamber实验 Boyden室由两层组成，两层间为胶原包被的多孔多聚碳酸盐滤膜；血管内皮细胞置上层，同时加入待测药物，共同培养后去上层细胞，下层细胞甲醇固定、HE染色，镜下计算下层内皮细胞数。
此法优点是对药物浓度梯度差异敏感，不足之处在于对实验技术要求较高且计数方法不同可能造成统计结果误差较大，因此有必要建立严格的计数标准以减少因方法不同产生的误差[11]。
2.2.2 Transwell实验 将Transwell小室放入培养板，小室内为上室，培养板内为下室，上室内盛上层培养液，下室内盛下层培养液，上下层间以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种于上室，由于聚碳酸酯膜具有通透性，下层培养液中的成分可影响上室内细胞，从而可研究下层培养液成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经不同处理的聚碳酸酯膜可进行共培养，开展细胞趋化、迁移、侵袭等多方面的研究[12]。
2.3 划痕损伤实验
其实验思路是用移液器滴头或刀片在单层血管内皮细胞培养皿上划痕，目的是为边缘内皮细胞迁移提供一裸露区域。经创伤处理后，边缘单层内皮细胞可迁移至创伤区域，并重新形成新的单层内皮细胞层。光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数和迁移的相对距离、并计算出细胞的实际迁移距离[7]。
2.4 小管形成实验
小管形成实验能模拟人体内毛细血管生成的过程，包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤，接近人体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、胶原等基质上培养能形成网状结构，用电镜分析小管间的紧密连接，从而定量血管生成情况。
2.5 器官培养测定实验
器官血管形成测定法包括鼠主动脉环、鸡主动脉弓、猪颈动脉、胎鼠骨移植测定法等。这些方法很相似，其中以鼠主动脉环测定最为广泛[13]。
器官培养实验极大地推进了对血管形成的检测。动脉环取材范围广泛，观察方法简单，可从器官分子观察血管生长并推测其调控机制，是一个较好的体外血管生成检测模型。
3.体内肿瘤血管新生抑制剂筛选模型
3.1 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验
该实验模型可用于检测受试物对CAM血管的影响，用于分析血管生成促进、抑制因子的活性和作用。CAM实验方法简便且成本低，设备条件要求不高；易操作，便于推广[14]；可进行大样本研究，广泛应用于影响血管生成因素或药物的筛选及体内评价。
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3.2 角膜微囊实验
选择4～6周龄雄性裸小鼠，手术显微镜下于裸鼠角膜建立1.5mm×0.8mm大小微囊。将肿瘤组织切成0.3mm?小块接种微囊中，建立角膜微囊移植模型，可进行角膜新生血管的观察与定量研究。于术后不同时间用体视显微镜动态观察角膜微囊内肿瘤诱导的血管生成情况，显微数码摄像系统记录观察结果[15]。角膜微囊实验中脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization，CNV)动物模型的建立是根据新生血管的数目及生长速度来确定新生血管的活性。
3.3 海绵植入实验
1987年有人提出将待测药物注入无菌聚酯海绵，再将海绵植入大鼠皮下，即海绵植入实验模型[16]。海绵植入后测定其中的血流，可评价血管新生，也可通过局部注射促进或抑制血管生成物，再收集渗出液做生化分析。
海绵植入实验可模仿肿瘤缺氧微环境，也适用于肿瘤血管生成研究。但也存在缺点，如海绵植入会引起非特异性炎症反应。
3.4 基质胶栓实验
1992年首次建立基质胶栓模型，通过此法研究血管内皮细胞在基质胶上形成管腔样结构的能力[17]。将碱性成纤维生长因子（bFGF）与基质胶混匀后注射到小鼠皮下，基质胶在体温下形成胶栓，内皮细胞等迁移入胶栓内形成血管样结构。1～3周后取出胶栓及包围在周边的肉芽组织，再定量胶栓内血管[18]。近来有报道通过注射荧光素标记的高分子量葡聚糖来定量新生血管。
3.5 斑马鱼实验模型
1999年有学者用斑马鱼来筛选影响血管生成的小分子物质。
斑马鱼是热带淡水鱼，具有以下优点：（1）斑马鱼是脊椎动物，具有独立的组织器官，其器官与人器官在结构、生理、分子水平等方面惊人地相似；（2）个体小，喂养费用低廉，所需空间场地不大；
（3）胚胎透明，从完整的活体可以观察到所有内部器官和结构，避免杀死或解剖动物，从而可多角度观察动力学过程。
斑马鱼血管生成与其它脊椎动物相似，非常适合体内血管细胞生物学研究。与其它模型相比，斑马鱼模型实验周期短；容易喂养，药物需要量少，单剂量给药一次可以筛选较多化合物且适合于量效关系研究。另外该模型可以快速鉴定血管生成中新的候选疾病基因及具有潜在治疗效应的化合物[19]。
3.6爪蟾蝌蚪实验模型
蟾蜍发育很快，受精后4天用显微成像技术能观察到完整发育和功能性脉管系统。蟾蜍胚胎是可应用于血管生成研究的有用模型[20]。蟾蜍与其他脊椎动物的血管类似，但蟾蜍不同于其他的是淋巴系统发达，可用于淋巴管生成的研究。
3.7 肿瘤模型
肿瘤模型可专门用于研究药物潜在的抗血管生成活性。它可在同一个实验中研究药物的摄取、分布及效应，也可检测药物是否具有抗血管生成作用[21]。如果药物有抗血管生成作用，就会阻止或大大减少肿瘤新生血管的数量。但要注意，实验性肿瘤特别是皮下注射形成瘤的局部环境与自发生长肿瘤不同，动物肿瘤模型与人体内肿瘤生长环境还有一定差别，因此动物实验不能完全等同于人体实验。
4.问题与展望
体内外血管生成模型各有其优缺点：体外模型能较好地控制和监测实验过程，操作相对简单、实验费用较低，但条件难标准化，实验结果不能完全反映体内情况，需要体内实验来验证；体内模型实验条件较接近体内环境，但操作繁琐耗时、价格昂贵、结果不易定量且易变性大[22-23]。
迄今为止血管生成研究模型尚无统一的评价标准。理想的血管生成实验模型应方法可靠、操作简便、定量容易，更重要的是与人体过程相关性好。但由于血管生成过程中细胞及分子调控网络复杂，单独一种模型不可能满足以上所有条件，因此不同模型的结果应相互印证。同时许多实验模型还有待进一步的研究和完善。只有借助趋近完善的模型我们才能更好地筛选肿瘤血管生成抑制剂，从而得到更客观、真实及全面的信息。
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论文作者:苏倩（综述） 卿晨(审校)
论文发表刊物:《医药前沿》2016年8月第23期
论文发表时间:2016/8/8
标签：血管论文; 肿瘤论文; 细胞论文; 内皮论文; 模型论文; 新生论文; 抑制剂论文; 《医药前沿》2016年8月第23期论文;