张海生[1] 魏巍[2] 周尚清2 韩峰[3] 张再兴[4] 邓艳丽[4] 戴建军[4]
（1.唐山市妇幼保健院耳鼻咽喉科 河北 唐山 063000
2.华北理工大学研究生学院 河北 唐山 063000
3.石家庄市长安区建北社区卫生服务中心 河北 石家庄 050011
4.华北理工大学附属医院耳鼻咽喉科 河北 唐山 063000）
基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划（ZD-20140214）；唐山市科学技术研究与发展计划项目(13130254z)
张海生、魏巍为共同第一作者
通讯作者： 张再兴
摘要：目的：研究喉癌前病变的形态学及细胞内核酸代谢变化，为该病变的早期诊断及监测提供参考。方法：采用病理学方法观察喉癌前病变的组织形态学变化，同时应用流式细胞术监测DNA倍体、增值指数的变化。结果：病理学观察显示：喉癌前病变组织可出现不同程度的异型细胞，表现为不同程度的不典型增生。流式细胞检测显示： 喉癌前病变组织中出现异倍体机率升高，细胞增殖指数升高，与正常组比较有统计学差异（P＜0.01）。结论：形态学观察结合流式细胞检测，在喉癌前病变的诊断及监测中发挥重要作用。
关键词：喉肿瘤；癌前病变；病理学；流式细胞术；DNA倍体；增殖指数
[中图分类号] R739.6[文献标识码]A文章编号：
喉癌前病变（laryngeal precancerous lesion, LPL）包括喉角化症、喉乳头状瘤、慢性肥厚性喉炎及喉粘膜中重度不典型增生，其特点是存在不同程度的癌变率。因此，我们应充分认识喉癌前病变的特征，以便早期诊断该病，并密切监测该病的发展[2]。病理学检查是进行形态学观察的重要方法，而流式细胞术是一种集细胞生物化学技术、激光技术、计算机技术等理论于一体的现代分析技术，它能够对细胞的生化及分子生物学性状进行定量检测。有研究证实：细胞核DNA含量改变可能早于形态学变化，细胞癌变早期虽然形态学变化不明显，但是细胞内核酸代谢已经发生变化，细胞周期变化是肿瘤迅速增长的物质基础。在组织学上还没有表现为恶性特征时，增殖期细胞增多意味着恶变的开始。本研究采用病理学方法对喉癌前病变组织进行形态学观察，应用流式细胞术检测DNA倍体、增值指数，探讨两种方法在喉癌前病变的早起诊断及病变监测中的作用。
1.资料与方法
1.1研究对象
收集1996年2月至2015年2月在华北理工大学附属医院耳鼻喉头颈外科行手术治疗并经病理检查证实的喉癌前病变患者的32例手术切除标本，其中喉白斑10例，喉乳头状瘤9例，慢性肥厚性喉炎6例，喉部粘膜中重度不典型增生7例，另选同期收治的30例声带息肉及45例喉癌作为对照组。用甲醛固定所有标本，包埋于石蜡中，将组织切片（4μm厚），HE染色观察，并由两位以上的病理学专家来证实所有的待检标本。同时应用流式细胞术测定组织中DNA倍体及细胞增殖指数变化。
1.2研究方法
主要仪器：电热恒温培养箱、766-12型远红外快速干燥箱、病理组织切片机、冷藏冰箱、载玻片、盖玻片、不锈钢耐高温切片架等。日本OLYMPUS生产的光学显微镜。美国B.D公司生产的FACS420型流式细胞仪，300目尼龙网、氩离子激光器、ND-64多道脉冲高度分析仪。
主要试剂：1%盐酸酒精、3%过氧化氢水溶液、苏木素、伊红、二甲苯、酒精、4%多聚甲醛以及石蜡。PH为1.5的0.5％胃蛋白酶、70%乙醇、溴化乙锭、生理盐水等。
HE染色：将石蜡以4μm厚切片，56℃烤箱烘烤12h，脱蜡后湿化；苏木素染色；清洗后在0.5%盐酸酒精分化液中分化，光学显微镜观察；清洗后伊红染色；清洗后于梯度乙醇中脱水；透明、封片；光镜下对喉癌前病变组织的形态学变化进行详细观察。
流式细胞染色：应用溴化乙啶荧光染色方法，将制备好的单细胞悬液调整到每1ml的细胞数约106个。染色过程在4℃恒温冰箱进行，染色30分钟后再进行过滤一次，使样品成为合格的单细胞悬液，检测重叠细胞数量少于总量的千分之三，而后进行流式细胞检测。
1.3 结果判定与计算
1.3.1 DNA倍体判定 应用DNA指数（DNA Index, DI）判断细胞的倍体变化。
DI= 正常对照G0G1峰均道值
样品G0G1峰均道值
DI＝0.9～1.0为二倍体，DI＞1.0或DI＜0.9为异倍体。
1.3.2增殖指数（Proliferative Index, PI）
PI= S+G2M ×100%
G0G1+S+G2M
1.4统计学方法
本研究中的数据均采用SPSS17.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）形式表示，计量资料以率表示，分别比较采用t检验及χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1病理学观察
HE染色：光镜下观察喉癌组织出现病理性核分裂，部分高分化鳞癌可见角化珠（图1）。喉乳头状瘤中可见空泡样细胞及乳头状增生组织（图2），重度不典型增生可见异型细胞（图3）。声带息肉组织中可见粘膜水肿（图4）。
2.2流式细胞检测结果
图5-8分别为流式细胞术检测喉癌、喉部粘膜不典型增生、喉乳头状瘤及声带息肉组织的DNA倍体结果，高分化鳞癌可见异倍体，喉乳头状瘤可出现四倍体。30例对照组未出现异倍体，32例喉癌前病变发现异倍体8例，45例喉癌出现异倍体34例，可见喉癌前病变组织中异倍体出现机率升高，两组比较差异有显著性意义（χ2=18.17 P＜0.01）。喉癌前病变增殖指数高于正常组，且有统计学差异（P＜0.05）（见表1）。
3.讨论
喉粘膜上皮组织由增生开始发展到恶性肿瘤，一般要经历漫长的基因调控过程，喉癌前病变是喉部一大类比正常粘膜更容易发生癌变的疾病，其病理学变化主要是喉粘膜上皮的增生，细胞出现角化现象及粘膜下组织增生，部分增生的结缔组织形成乳头状突起[2]。有学者应用组织学方法研究喉癌前病变，揭示了重度非典型增生具有转变为原位癌的潜能，应更多的关注重度非典型增生。本研究应用病理学方法观察喉癌前病变显示：喉癌前病变组织可出现不同程度的异型细胞，角化细胞或不同程度的非典型增生，为临床提供了有益的参考。因此，如何早期诊断癌前病变，以及如何监测癌前病变的发展变化，具有重要临床价值。
近年来，随着流式细胞仪性能的逐步改进，使得流式细胞技术在临床医学科学研究中有着广泛的应用。流式细胞术可用于测定肿瘤细胞的DNA倍体、细胞周期等，可鉴别良恶性肿瘤。也有学者应用流式细胞术检测骨髓瘤微小残留病变，认为是该肿瘤重要的预后检测方法。总之，流式细胞术为临床提供了一种非常有用的工具。Bergshoeff等研究表明：喉癌前病变进展与染色体不稳定有关,该结论为喉癌前病的研究变指明了方向。而流式细胞为检测染色体的质和量提供了基础，我们应用流式细胞术检测了DNA倍体及细胞增殖情况。流式检测的DNA倍体的判断标准为：二倍体肿瘤只有单一的G1峰，如果直方图中还有额外的G1峰，则确定为异倍体。本研究显示：喉癌前病变组织中出现异倍体机率升高，较对照组及喉癌组有显著性差异，证实了喉癌前病变的DNA倍体的异常。同时，根据肿瘤细胞DNA倍体直方图的变化可了解细胞动力学变化。喉癌前病变的细胞增殖指数升高，与其它两组组间差异有统计学意义，说明流式细胞术在监测喉癌前病变中发挥重要作用。这与Pavlovic等研究结果一致，他们证实喉癌前病变中Ki-67明显升高，在单纯过度增生的细胞可出现12%的Ki-67阳性细胞。本研究中应用流式细胞术测定各组喉病变组织的细胞周期，并在此基础上计算出细胞的增殖指数，理论上讲具有与Ki-67基本一致的临床价值。Gültekin等研究表明：增值指数是头颈部癌前病变独立的预后因子。本研究证实了喉癌前病变的增殖指数升高，与相关研究基本一致。由此可见，监测喉癌前病变的DNA倍体及细胞增殖有十分重要的作用。
总之，传统的病理学检查有利于细胞形态观察，而流式细胞术能够对细胞内DNA倍体及增殖状况进行定量分析，二者在肿瘤早期诊断及病情监测过程中发挥重要作用。但是，有关喉部癌前病变的分子机制，还需要结合其它检测方法进一步评估。
参考文献：
[1]Nankivell P,Weller M,McConkey C, et al. Biomarkers inlaryngealdysplasia: a systematic review [J]. Head Neck,2011,33(8):1170-6.
[2]Bartlett RS,Heckman WW,Isenberg J, et al. Genetic characterization of vocal fold lesions:leukoplakiaand carcinoma[J]. Laryngoscope,2012 ,122(2):336-42.
论文作者:张海生 魏巍 周尚清 韩峰
论文发表刊物:《健康文摘》2015年11期
论文发表时间:2016/4/27
标签：细胞论文; 喉癌论文; 流式论文; 病理学论文; 组织论文; 形态学论文; 粘膜论文; 《健康文摘》2015年11期论文;