（自贡市第一人民医院神经内科 四川 自贡 643000）
【摘要】目的：出血性脑损伤不仅存在血肿的占位效应对周围脑组织的直接破坏，继发性损伤也是出血性脑损伤的主要原因之一。细胞凋亡机制参与了脑出血继发性损伤。脑血肿在凝固、溶解、吸收过程中产生大量的生物活性蛋白激活并直接启动凋亡信号传导。细胞凋亡是一个受严格调控的能量依赖性的自杀程序。凋亡过程的启动直接决定了细胞的命运。研究药物对脑细胞凋亡的干预作用，可能有助于临床脑出血的治疗。故本实验拟通过建立脑出血模型，并予以神经节苷酯干预，检测脑出血后血肿周围组织内凋亡调控蛋白Bax蛋白以及Bcl-2蛋白的表达变化，以探讨神经节苷酯对脑细胞的凋亡的影响机制。
【关键词】实验性脑出血；细胞凋亡；神经节苷酯；Bax；Bcl-2
【中图分类号】R743.34 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）20-0145-01
1.方法
实验分组和大鼠模型制备：雄性SD大鼠45只体重均为250～300克，月龄为2月左右，采用随机数字法将其分为3组，第1组为假手术组，第2组为脑出血组（ICH组），第3组神经节苷酯干预组(GM1组)。第2、3组又分别有四个亚组（每组五只），包括出血后6h，24h，3d，7d亚组。其中第3组（GM1组）在术后即刻以神经节苷酯(齐鲁制药)30mg/kg注入大鼠腹腔，脑出血组以及假手术组用等量生理盐水代替。每个亚组在相应时间点处死后检测指标。大鼠模型制备：将第2、3组大鼠以2％戊巴比妥钠常规麻醉消毒备皮后取前囟前0.1mm、中线向右旁开3mm用牙科钻钻一直径lmm的圆孔，深度为到达骨膜。脑立体定向仪垂直位固定微量注射器，缓慢注入50ul自体血液，注射时间以2分钟为宜。注射完毕后，将针留置10分钟，以防血液流出。缓慢将微量注射器针头拔出，然后用医用骨蜡封闭骨孔。观察无出血后，缝合头部皮肤。第1组假手术组只进针不注血。各组在指定时间点处死，断头取脑，制作脑组织切片，TUNEL法结合HE染色法观察细胞凋亡，以免疫组化法测定凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2，并进行分析测定其平均积分光密度值（AIOD）。
2.结果
（1）第1组在各时间点未有明显神经功能障碍症状。第2、3组出现不同程度的肢体无力，行走画圈等症状，但神经节苷酯干预组普遍相对较轻。（2）脑组织切片肉眼观察，第1组见针道未见颅内出血，第2、3组可见血肿形成。（3）TUNEL染色第1组未见明显凋亡细胞。第2、3组出现不同程度的细胞凋亡，均是6h亚组开始出现凋亡细胞，24h亚组明显出现凋亡细胞，3d亚组达到峰值，7d亚组有所下降。但第3组在各个对应时间点亚组凋亡细胞均较第2组为少（P＜0.05）。（4）免疫组化显示，第1组假手术组见极少量Bax，Bcl-2表达。第2、3组各时间点Bax均明显表达，但第3组神经节苷酯干预组的含量均低于第2脑出血组。而Bcl-2蛋白在第2、3组的6h亚组的表达量较高，24h亚组逐渐降低，在3d亚组时降至最低，7d亚组回升明显，其中第3组神经节苷酯干预组在各个时间点的含量均高于第2组脑出血组。各组间和组内各时间点的差异具有统计学意义（P＜0.05）。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆直线相关性分析显示Bax与脑细胞凋亡呈正相关，r=0.568为中度相关，Bcl-2与脑细胞凋亡呈负相关r=-0.666，负相关度较为明显。神经节苷酯有神经保护作用，其机制可能是通过上调抑制凋亡蛋白的表达，下调促凋亡蛋白的表达，使神经细胞凋亡减少，保护神经功能。
本实验结果显示，神经节苷酯干预组在组织水肿，细胞凋亡的程度上都轻于脑出血组。通过免疫组化检测发现，神经节苷酯干预组表达的促凋亡蛋白Bax的平均积分光密度值均低于脑出血组，而抑制细胞凋亡发生的蛋白Bcl-2的平均积分光密度值高于脑出血组。大鼠脑出血后三天细胞凋亡达到高峰，这与促凋亡蛋白Bax的表达变化一致，与抑制凋亡的蛋白Bcl-2的表达变化则与细胞凋亡变化规律相反，呈现负性相关关系。这是因为脑损伤初期术后6h抑制凋亡的蛋白Bcl-2的虽然也开始明显表达，但其表达量不足以对抗Bax蛋白等表达所致的促凋亡作用，所以脑细胞趋于凋亡。在损伤高峰期术后第三天，在各种损伤因素的作用下促凋亡蛋白Bax的含量升至最高，抑制凋亡的蛋白Bcl-2的表达量明显不足，故而细胞凋亡达到峰值。随着时间延长Bcl-2含量逐渐升高，抑制凋亡的作用逐渐明显，神经细胞凋亡趋于减少。经直线相关分析也得出同样结果，蛋白Bax与细胞凋亡存在正相关性，为促进细胞凋亡的蛋白，而Bcl-2蛋白与细胞凋亡呈负相关性，为抑制细胞凋亡发生的蛋白。经神经节苷酯干预后，干预组个时间点促凋亡蛋白Bax的表达量均低于脑出血组，而抑制凋亡发生的蛋白Bcl-2含量各时间点均高于脑出血组。神经节苷酯组的细胞凋亡也低于脑出血组，说明神经节苷酯存在神经保护作用，其保护机制可能是通过上调抑制凋亡基因的Bcl-2蛋白表达，下调促凋亡基因的Bax蛋白表达来实现的。
本实验采用的实验模型为自体全血注入尾状核模型，并以神经节苷酯为干预因素，观察大鼠实验性脑出血后各个时间点的神经功能评分，出血灶周围细胞凋亡的情况以及细胞凋亡调控蛋白的表达情况，并加以比较和分析，得出以下结论：
（1）断尾取血制作大鼠实验性脑出血模型相对简单，尾状核定位准确，动物死亡率低，模型重复性好。
（2）各组大鼠脑出血模型建立后出现不同程度的神经功能损害，神经功能缺损评分在术后三天达到峰值。
（3）神经节苷酯存在神经保护作用，其作用机制可能为上调抑制凋亡发生蛋白的表达，下调促凋亡蛋白的表达，从而表现为抗细胞凋亡保护神经细胞的作用。
3.结论
脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是指原发于脑实质的非外伤性出血，约占全部类型卒中的10％～30％，是一个重要的公共卫生问题，也是神经内科常见病多发病，其病死率致残率均高。脑出血的发病率在我国普遍高于西方国家[6]。脑出血的病理生理机制除了急性期血肿压迫以外，尚存在很多继发性脑损伤，这也是临床上患者病情加重的主要原因之一。对于脑出血后继发性脑损伤机制的研究有着十分的重要性和必要性，目前也是一个研究的热点。
【 参考文献】
[1] Elliott J,Smith M.The acute management of intracerebral hemorrhage:a clinical review [J].Anesth Analg,2010, 110(5):1419-1427.
[2]李建军，孙琦，曹辉，等.神经节苷脂对大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用[J].临床神经病学杂志，2006，19:124-126.
[3]陈新峰，陈春美.神经节苷酯对大鼠脑缺血神经细胞凋亡的影响[J].中国药理学通报，2009，25(8):1064-1067.
论文作者:李红梅,石强
论文发表刊物:《医药前沿》2017年7月第20期
论文发表时间:2017/7/31
标签：凋亡论文; 脑出血论文; 蛋白论文; 细胞论文; 神经节论文; 大鼠论文; 抑制论文; 《医药前沿》2017年7月第20期论文;