简华刚[1]2002年在《皮肤创伤愈合相关差异表达基因的克隆、筛选及鉴定》文中研究指明背景及目的：随着现代分子生物学的发展，创伤愈合与组织修复正逐渐成为创伤研究中最具潜力和引人注目的部分。机体防御外界刺激、损伤的第一道屏障为皮肤，因而皮肤创伤愈合是创伤愈合与组织修复中不可缺少的部分。皮肤在发育上是由叁类胚胎细胞分化，由多种类型的细胞(构成表皮和真皮)组成，起到正常的生理功能。皮肤创伤后，由构成皮肤的各种细胞及其细胞外基质参与的一个复杂的皮肤愈合、修复过程，大约有数百种基因表达改变，以协调各种细胞在愈合、修复中的生物学行为。尽管人们在皮肤创伤愈合的研究中，从不同侧面做了大量的研究工作，但离全面了解在皮肤创伤组织愈合过程，尤其是愈合过程中基因表达、调控还有很大距离。本研究的目的在于通过构建人皮肤创伤愈合期与正常皮肤组织差异表达基因消减cDNA文库，筛选、鉴定出在皮肤组织愈合期差异表达基因的cDNA片段，并对其在皮肤组织修复过程中的表达情况做一个初步的探讨。 方法：(1)用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术，以创伤愈合期(伤后5天)人皮肤组织作为检测子(Tester)，以正常人皮肤组织作为驱赶子(Driver)，通过提取创伤愈合期和正常人皮肤组织的mRNA，经逆转录合成第一、二链cDNA；用限制性内切酶Rsa Ⅰ将双链cDNA酶切成小片段，再将Tester cDNA分成两份，分别连上不同的接头，与Driver cDNA进行两轮消减杂交及两轮PCR；最终将特异性扩增的PCR产物通过T/A克隆到T-载体上，构建人皮肤创伤愈合期与正常皮肤组织差异表达基因消减cDNA文库。(2)利用 重庆医科大学博士研究生学位论文 — — a互补原理，经蓝白菌落初步筛选阳性克隆；再用PCR技术对阳性克 隆作进一步筛选，获得真阳性克隆；门）将筛选到的阳性克隆进行杂 交筛选，最后确定的差异表达片段；N）对差异表达的片段进行序列 解析，将序列结果经过NCBI BLASTN信息途径进行同源性检索和比 对，检索的数据库包括GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB非重复数据库 （Non－redundant GenBank＋ EMBL十 DDBJ ＋ PDB Sequences）和 GenBank EST＊重复数据库（Non－redundant Database of GenBank EST Division） K）用Northern杂交的方法验证本研究的可靠性，并比较 了4种筛选出来的差异表达基因伯角蛋白6e、角蛋白6a、connexin 26和这个新知基因片段），在正常、伤后1小时和后5大的人皮肤组织 中的转录表达情况。 结果：（）用SSH技术成功构建了人皮肤创伤愈合期（伤后5天） 与正常皮肤组织差异表达基因消减CDNA文库。门）经蓝白菌落初步 筛选阳性克隆128个，再用PCR技术进一步筛选，获得真阳性克隆70 个。D）阳性克隆经杂交筛选，最后确定的差异表达基因片段38个。 K）38个差异表达的基因片段序列解析证实，37个序列与己知的人 全长基因具有很高的相似性乃7％～100％人 另有 1个和人类的基因 仅仅具有部分相似性，表明它是未被克隆的人基因对应的EST片段， 该片段长665hp，向GenBank的dbEST数据库提交序列，并获得注册 （GenBank登录号：BM499225）。（5）己知基因中角蛋白6e和p－2－ 微球蛋白未见与创伤组织愈合、修复的相关报道。历）Northern杂交 验证发现，验证的4种基因片段在伤后1小时和伤后5大的人皮肤组 织中的表达有显着差异。 结论：（）SSH为筛选差异表达基因的有效方法，利用该方法成 功构建了人皮肤创伤愈合期与正常皮肤组织差异表达基因消减CDNA －2－ 重庆医科大学博士研究生学位论文 一 文库。u）蓝白菌落筛选及PCR技术相结合，可快速准确地筛选阳性 克隆。门）序列解祈证实在38个差异表达片段中，37个序列与己知的 人全长基因具有很高的相似性；另有1个和人类的基因仅仅具有部分 卞似性，该片段长665hp，向GenBank的dbEST数据库提交序列，并，获得注册（GenBank 登录号：BM499225＼ 推测分析该片段是和 beta．Actin具有部分相似性的新基因序列的一段。已知基因中角蛋白6e 和p毛－微球蛋白以前末见与创伤组织愈合、修复的相关报道，但本研 究发现它们也在人皮肤愈合中有差异表达。H）Northern杂交验证发 现，验证的4禾基因片段（巨角蛋白 6e、角蛋白 6a、connexin 26和 这个新知基因片段）在伤后1小时和伤后5天的人皮肤组织中的表达 有显着差异。并初步表明它们在创伤组织愈合、修复的过程中起重要 作用。
司信喜[2]2009年在《胸腺肽β_4的生物制备研究》文中研究指明胸腺肽是胸腺分泌的一种小分子多肽,根据等电点的不同分为α(pI<5.0)、β(5.0<pI<7.0)和γ(pI>7.0)叁个家族,每一族成员按其发现的先后顺序注以相应下标。本课题的研究对象是β类胸腺肽中的第四个成员,因此,命名为胸腺肽β4(Thymosinβ4,Tβ4)。早期的研究表明Tβ4是一种球形肌动蛋白(G-actin)结合肽,能与G-actin单体结合阻断其聚合。随着研究的深入,Tβ4的其他生物学功能相继被发现,如促进血管生成,创伤愈合,角膜修复和抑制炎症以及调控肿瘤转移等,这预示着Tβ4可能是一种多功能药物。Tβ4潜在的临床应用吸引了众多国内外研究者和制药企业的兴趣,这其中美国的雷根内克斯(RegeneRx)制药有限公司已经率先合成出了Tβ4并正在进行临床试验,而国内的一些研究机构和研究小组也在尝试通过生物手段制备Tβ4。一直以来Tβ4的制备都是以动物胸腺提取和化学合成为主,但这两种方法都存在先天不足,动物胸腺提取的Tβ4来源有限,成本高昂,成分不够确切,且免疫原性较高;而化学合成虽说在成分和免疫原性方面有了很大改进,但同样高昂的成本限制了产品的推广和使用。因此,价廉质优的生物制备法成为了首选,但这也并非唾手可得的易事,Tβ4是一个43个氨基酸残基组成的N端乙酰化的小分子多肽,其表达和乙酰化都是生物制备无法回避的困难。本文的目的是要利用基因工程技术制备Tβ4,从而在现有的动物胸腺提取和化学合成外开辟一条新的低成本、低免疫原性、成分更确切的生物制备途径。为了获得Tβ4这种小分子多肽的高表达,本文设计在大肠杆菌表达系统内对其进行融合表达,同时将一种N端乙酰化转移酶与Tβ4融合蛋白共表达,利用该酶在胞内实现Tβ4的N端乙酰化修饰,再进行融合蛋白的切割,释放天然Tβ4。我们设计了两种融合方案,一种是在Tβ4的C末端融合大肠杆菌核糖体亚基蛋白L12,并在两者之间增加一个半胱氨酸残基(Cys),构建了融合蛋白Tβ4-Cys-L12,简称B2。首先,我们利用重迭PCR扩增了B2的编码基因,克隆进pET-22b载体,构建了B2的表达载体pET-B2。然后,我们将N端乙酰化转移酶NAT的基因nat克隆进pET-22b的兼容性质粒pACYCDuet-1中,构建了NAT的表达载体pACYC-nat。将上述两种重组质粒共同转化进BL21(DE3)中诱导表达,获得了N端乙酰化的B2融合蛋白。B2中添加的Cys残基形成了一个特异性化学切割位点,用1-Cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP)介导的化学法在该残基处切除融合伴体得到Tβ4;另一种是在Tβ4的C端融合内含肽(intein),形成Tβ4-intein融合蛋白。我们首先将intein基因克隆进pET-22b载体中,构建重组质粒pET-intein,再通过PCR扩增Tβ4基因tb4,将之克隆进pET-intein载体中,构建了融合蛋白表达载体pET-tb4-intein,并与上述的乙酰转移酶表达载体pACYC-nat共转BL21(DE3),诱导表达获得N端乙酰化的Tβ4-intein融合蛋白。然后利用intein的N端切割能力,在外源DTT诱导下玩完成切割,释放出Tβ4。我们选择了3种intein:Ssp/Mxe/Spl用于融合,并在叁个融合蛋白中筛选出了切割活性最高的一个,研究其切割百分比随时间的变化,制作出切割动力学曲线。为了便于后续对产物Tβ4进行PEG化修饰,我们还对Tβ4进行了修饰,在其C端添加了一个Cys残基,并与上述叁种intein融合,形成Tβ4+C-intein融合蛋白。我们进行了融合蛋白的切割实验,考察intein对修饰后融合蛋白的切割行为,并与Tβ4-intein进行了比较。实验结果表明B2和Tβ4-intein两类融合蛋白在大肠杆菌表达系统内都得到稳定高效的表达,质谱分子量鉴定和N端测序表明其N端都得到了较好的乙酰化。CDAP化学切割法能够在短时间内完成B2的切割,得到的产物经质谱分析与天然Tβ4一致,但切割率不高,只有约66%。3种Tβ4-intein融合蛋白经筛选发现Tβ4-Spl的切割效率最高,在0.2 M DTT诱导下,37℃作用24 h约80%前体蛋白完成了切割,得到的Tβ4经质谱鉴定也与天然Tβ4并无二致。3种Tβ4+C-intein表达过程存在不同程度的体内切割,选择相对稳定的Tβ4+C-Spl进行研究,发现其切割反应趋势与Tβ4-Spl类似,且在反应的前12 h Tβ4+C-Spl比Tβ4-Spl切割效率更高,50%融合蛋白发生切割的时间(T1/2)也更短,前者T1/2为5.5 h,T1/2为7.3 h。通过本课题的研究我们可以得出结论:小分子Tβ4通过基因融合可以实现大量稳定表达,通过共表达N端乙酰转移酶可以在大肠杆菌表达系统内实现蛋白的乙酰化修饰,利用CDAP化学法和intein法都能切割融合蛋白,但intein切割方法优于CDAP法,最终我们通过融合表达和intein切割实现了Tβ4的生物制备。
冯秀萍[3]2009年在《重组人胸腺素β16的表达、纯化和胸腺素β16的应用研究》文中进行了进一步梳理Tβ16作为胸腺素β家族成员之一,可通过抗感染和免疫调节作用、刺激成纤维细胞的增殖、促进上皮细胞角化、刺激内皮细胞移动以及促进血管形成等作用来促进创伤修复。本课题应用基因工程重组技术,设计构建含SUMO-Tβ16融合基因的重组质粒SUMO-Tβ16/pET3c,将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经克隆筛选获得了两株DNA测序完全正确的重组工程菌SUMO-Tβ16/pET3c/BL21。该工程菌连续传代100代,经各项指标检测,遗传稳定性很好。重组SUMO-Tβ16融合工程菌,经0.8mmol/L的IPTG诱导,30℃培养6h后,SDS-PAGE电泳显示为可溶性表达。通过DEAE阴离子交换层析→疏水层析→SUMO蛋白酶(Ulp1)剪切→凝胶过滤层析→获得纯度大于95%、比活性为5.3×105IU/mg的Tβ16。体内外生物学活性实验证明:Tβ16具有促进成纤维细胞增殖;促进兔角膜细胞增殖;促进鸡胚绒毛膜尿囊膜的血管增殖;Tβ16凝胶能够促进家兔皮肤烫伤和碱烧伤的愈合。总之,本课题研究结果表明Tβ16可以通过抗感染、促进成纤维细胞增殖和促进血管的再生等作用对创伤进行修复,初步确定Tβ16有效剂量为5~10μg/克,研究结果为Tβ16药物的开发提供实验依据。
佚名[4]2004年在《作者索引》文中认为Vamla B抗BACP1抗体的制备及鉴定(1):30-33 Wernig A人源性成肌细胞和肌管细胞中β-Tubulin Ⅲ的表达(13):1157-1161 A 阿明长春瑞宾+顺铂治疗非小细胞肺癌48例(8):743 结肠镜诊断大肠癌632例(11):1024 沙培林+顺铂治疗恶性胸腔积液43例(12):1133 艾国平植入贫铀片大鼠血液和肝肾功能的变化(2):182-185 吸入贫铀粉尘和/或嵌入贫铀片大鼠体内铀的分布(6):503- 506
屈纪富, 史春梦, 郑怀恩, 郝利, 程天民[5]2005年在《创伤早期伤口液作用真皮多能干细胞差异表达cDNA文库的构建》文中指出目的：研究创伤早期伤口液作用前后真皮多能干细胞基因表达的变化,探讨真皮多能干细胞参与创伤修复启动的分子机制。方法：取伤后1d伤口液作为创伤修复启动微环境,刺激真皮多能干细胞,24h后提取总RNA为实验方(tester),未予刺激的真皮多能干细胞总RNA为驱动方(driver)。实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA方法合成cDNA,然后用抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物。消减杂交产物克隆到T载体构建消减文库。对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果：消减杂交文库挑取615个克隆进行PCR扩增,阳性率约为97%。取其中48个克隆进行反向Northern杂交,获得5个差异表达基因。经Genebank检索,这些差异表达基因与已知序列有较高同源性,其中大多为与创伤修复相关的基因。结论：我们成功构建了创伤早期伤口液刺激前后大鼠真皮多能干细胞差异表达cDNA文库,并筛选、克隆出部分与真皮多能干细胞参与创伤修复相关的差异表达基因。
佚名[6]2003年在《作者索引》文中进行了进一步梳理第四军医大学学报(J Fourth Milit Med Unsv)2003年24卷索引AAdrian T.TINGB细胞成熟抗原BCMA在细胞内诱导NF-KB的活化(19):1729一1732CClaus H.Schroder慢性乙肝病毒感染的诊断和治疗
丁静[7]2012年在《人抗菌肽LL-37的原核表达及其抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染活性的初步研究》文中研究指明LL-37是人体内发现的抗菌肽Cathelicidin家族的唯一成员，由37个氨基酸残基组成，因其N端前两个氨基酸残基为亮氨酸（L）而得名。LL-37抗菌谱广，体外研究显示对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒均发挥抑制作用，特别是对部分临床耐药菌及临床易感菌株也有较强的抑菌活性，因此有很好的应用前景。本文采用原核表达系统实现小分子抗菌多肽LL-37的可溶表达，并研究其在皮肤创伤感染中发挥的活性作用。本课题将LL-37连接入pET32a载体中进行可溶表达，通过考察表达诱导因素获得高产量的LL-37，体外实验验证其抗菌活性，最后研究LL-37对于小鼠深Ⅱ度烫伤创面耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的预防治疗作用，并从抗细菌生物膜方面探讨其作用机制。研究目的：本文主要是采用pET32a表达载体实现LL-37的可溶表达，同时还探讨了LL-37对于小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）创伤感染模型的预防治疗作用，并对其机制进行初步研究，为小分子抗菌肽的基因工程表达提供参考，也为LL-37的深入研究和开发应用提供实验依据。研究方法：1.融合蛋白Trx-LL-37的生物信息学分析及表达载体构建：运用相关生物信息学软件对融合蛋白Trx-LL-37氨基酸序列进行分析预测，初步了解融合蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构以及可溶表达概率。参考GenBank中已发表的LL-37全长cDNA基因序列（No.：CAA46115）以及pET32a（+）多克隆位点序列，设计两条特异性引物，PCR扩增出含有LL-37成熟肽的基因序列，引入KpnⅠ、SacⅠ酶切位点以及甲酸裂解位点。通过KpnⅠ、SacⅠ双酶切反应，将含有LL-37的小片段连接入pET32a表达载体中，进行菌落PCR、双酶切以及质粒测序鉴定。2. LL-37的原核表达、纯化及鉴定：将构建好的表达载体pET32a-LL-37转化入BL21（DE3）中进行表达，采用SDS-PAGE、WesternBlot对表达产物进行鉴定。以融合蛋白Trx-LL-37的可溶蛋白表达水平为指标，通过诱导条件及表达条件的单因素优化，确定最佳表达参数。通过Ni2+亲和层析色谱法纯化融合蛋白Trx-LL-37，甲酸裂解去除标签蛋白，再次采用Ni2+亲和层析色谱法纯化目标蛋白LL-37。3. LL-37抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA创伤感染活性初步研究：选取金黄色葡萄球菌S.aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌S.epidermidis、大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等临床常见感染菌种作为实验对象，采用琼脂孔穴扩散法及微量肉汤稀释法，验证纯化产物LL-37的抑菌活性。建立小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌创伤感染模型，以生理盐水为阴性对照、庆大霉素为阳性对照，通过统计分析体重变化、组织菌负荷、感染愈合时间、创面愈合率等指标探讨了LL-37的治疗效果。4. LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究：采过96孔板法，以金黄色葡萄球菌作为阳性菌对照，探讨了MRSA的体外成膜能力。然后结合激光共聚焦实验研究了LL-37对MRSA生物膜形成的影响以及对已形成的MRSA生物膜的破坏作用。结果：1.融合蛋白Trx-LL-37生物信息学分析及表达载体构建：经过生物信息学软件预测分析，融合蛋白Trx-LL-37基因编码蛋白含有195个氨基酸，分子量为21.5kDa，理论等电点为6.3，热稳定性好、半衰期长，属于稳定类蛋白；融合蛋白二级结构简单，主要包含α-螺旋、无规则卷曲；根据两个参数模型预测显示，重组融合蛋白具有可溶性表达的倾向，可采用基因工程技术进行表达。特异性引物PCR扩增出含有LL-37成熟肽的基因序列，引入特异性酶切位点以及甲酸裂解位点。经KpnⅠ、SacⅠ双酶切后连接入pET32a表达载体，进行菌落PCR、双酶切以及质粒测序鉴定，片段大小以及氨基酸序列均与GeneBank公布一致。2. LL-37的原核表达、纯化及鉴定：构建的表达菌BL21（DE3）/pET32a-LL-37经诱导表达，SDS-PAGE、WesternBlot对表达产物鉴定结果显示，IPTG诱导后的菌体蛋白在21.5kDa附近存在目标蛋白（Trx-LL-37）条带，而未诱导的未出现相应大小的条带。诱导表达条件经过优化，种子菌180rpm37℃培养2.5h，加入终浓度0.05mM IPTG，于17℃低温诱导，培养24h，此时融合蛋白Trx-LL-37表达量最高，重组蛋白在总可溶蛋白中的比例也最高，达到45%以上。融合蛋白Trx-LL-37经Ni2+亲和层析色谱法一次纯化，甲酸裂解去除标签蛋白，Ni2+亲和层析色谱法二次纯化，最终获得目标蛋白LL-37。终产量为每升发酵液得到目标蛋白LL-37约3mg。经RP-HPLC色谱分析，峰面积结果显示，目标蛋白纯度在90%以上。3. LL-37抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA创伤感染活性初步研究：琼脂孔穴扩散法及微量肉汤稀释法实验结果显示，产物LL-37对于临床常见感染菌种具有抑菌活性，并且其MICs以及MBCs与经典文献一致。本实验建立小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌创伤感染模型，观察LL-37对创面感染的影响，以生理盐水为阴性对照、庆大霉素为阳性对照，进行比较。每日观察发现，治疗组小鼠精神状态正常，进食、休息等活动均未受到影响，体重正常增长；生理盐水组小鼠精神萎靡，毛发无光泽，体重水平一直处于治疗组小鼠之下。具体结果显示， LL-37组第3d创面即干燥结痂，痂下湿润，渗出物相比对照组明显减少，局部组织菌负荷比对照组低了约3.5~Log（CEU/g tissue），差异有统计学意义（P＜0.05），说明LL-37有效降低了局部组织菌负荷，能够及时抑制早期烫伤创面细菌的定植与增长，预防控制感染的发展。第9d，LL-37组创面明显缩小，痂下肉芽组织生长迅速，愈合率与庆大霉素组无统计学差异（P>0.05）。9d HE病理切片还发现，生理盐水组创面正下方皮下组织分布有脓细胞碎片，可见炎症细胞浸润，而治疗组均无；除此，LL-37皮下出现大量成纤维母细胞及新生血管，修复状况明显优于对照组。从另一方面说明，LL-37对模型小鼠烫伤创面具有促愈合修复作用。综上，LL-37对小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染创伤模型具有一定效果。4. LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究：96孔板法联合结晶紫染色结果显示，MRSA与阳性质控菌株S.aureus（ATCC25923）相比，两者成膜能力相当，在统计学意义上无显着差异（P＞0.05）。然后，本实验选取6.25、3.13、0.625、0.0625μM4个亚抑菌浓度，研究LL-37对于MRSA体外生物膜形成的影响，发现LL-37不仅作用于生物膜形成的初始阶段——细菌的附着，还对已成型的生物膜具有杀伤破坏作用。结果显示，LL-37在1/20MIC浓度对生物膜形成的抑制作用即有统计学意义，1/4MIC3.13μM条件下对生物膜形成的抑制率达63%；在激光共聚焦显微镜下可观察到，1/4MIC LL-37作用48h后，MRSA生物膜内组成细菌数目明显减少，成形的菌斑结构疏松，无信号区居多，生物膜较薄，平均厚度仅为未加药组的1/4。结论：本研究通过原核系统可溶表达得到融合蛋白Trx-LL-37；融合蛋白经甲酸裂解、两步Ni柱纯化获得目标蛋白LL-37，体外抑菌试验证明其具有抑菌活性。通过对小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染创面治疗发现，LL-37能够抑制感染创面细菌的定植与生长，预防感染，促进创面愈合。体外96孔板法研究显示，MRSA具有强大的生物膜形成能力；LL-37具有抗生物膜活性，在1/20MIC亚抑菌浓度条件下，即可抑制MRSA生物膜的形成，且有统计学意义。细菌生物膜的形成是许多慢性感染创面延迟不愈的主要原因，也是许多细菌产生耐药性的原因，LL-37不仅预防控制MRSA感染，还能抑制MRSA生物膜的形成，由此表明，LL-37对于耐药菌造成的感染具有一定的效果。
李玉香[8]2007年在《人肝细胞再生因子表达载体构建及抗肝纤维化作用》文中指出各种因素所致的慢性肝脏损伤,都可能发生肝细胞炎症、坏死,进而发展成为肝纤维化或肝硬化,治疗上目前尚无理想的治疗方法。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor HGF)作为一种多功能生长因子,是由肝脏的储脂细胞生成的一种具有强烈有丝分裂原活性的蛋白质,它不仅能够刺激原代鼠肝细胞DNA的合成,参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生,对多种成熟的器官/组织有营养修复作用,促进肝、肾、肺等损伤器官的再生,而且对各种因素引起的肝纤维化具有良好的拮抗和治疗作用。因此,应用HGF治疗各种慢性肝损伤、肝纤维化也是明智的选择。虽已应用于临床,其来源主要是从人血浆、胎盘、或动物的胎肝中提取纯化,是单链pro-HGF与异二聚体HGF的混合物,费时、费力、活性差、成本昂贵、体内半衰期短,需要反复应用才维持体内血药浓度,采用基因治疗的方法或利用基因工程表达重组人HGF是大量获取具有生物学活性HGF的有效途径。为此,我们构建了携带人HGF全长基因片断的真核表达质粒,建立了转染PCI-new-HGF/HL-7702细胞、转染PCI-new-HGF/CFSC-2G细胞模型和大鼠肝纤维化模型,测定其转染肝细胞后的生物学效应。并在建立大鼠肝纤维化模型上观察其在体内的作用,为进一步证实HGF的生物学效应提供了理论依据和实验依据。有研究报道HGF可抑制转移生长因子β(Transforming growth factor TGF-β)基因的转录水平,促进肝细胞增殖和细胞增殖核抗原(PCNA)的表达,从而抑制星状细胞的激活,降低肌成纤维细胞α-肌动蛋白(α-smooth muscle actinα-SMA)的表达,但目前尚没有HGF对肝细胞凋亡、肝星状细胞凋亡的研究,为探讨HGF对肝细胞、HSC的作用及机制,我们还用PCI-neo-HGF转染了人正常肝细胞株(HL-7702)、大鼠星状细胞株(CFSC-2G)。采用CCl4诱导HL-7702细胞的凋亡,刺激CFSC-2G细胞株,观察HL-7702细胞、CFSC-2G细胞的caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表达,结果显示CCl4损伤后转染PCI-new-HGF的HL-7702细胞后,caspase-3蛋白表达量较CCl4损伤/HL-7702细胞、PCI-neo/HL-7702细胞明显降低,caspase-8、caspase-9没有变化;转染PCI-neo-HGF/CFSC-2G细胞caspase-3蛋白表达量较CCl4诱导的CGFS-2G增加,且检测到caspase-9,提示PCI-neo-HGF转染HL-7702细胞后,能够对抗CCl4损伤人肝细胞(HL-7702)的凋亡。而拮抗CCl4诱导的HL-7702细胞的凋亡的作用很可能是通过下调caspase-3蛋白表达途径实现的;PCI-neo-HGF促进大鼠CFSC-2G细胞的凋亡,其可能的作用机制与上调caspase-3、-9蛋白表达有关。应用HGF基因对模型鼠进行抗纤维化的体内研究,结果显示经过PCI-neo-HGF质粒转染的实验鼠治疗组,预防给药组、治疗1组,纤维组织增生较模型对照组减轻,假小叶形成率低,且程度轻,未见典型的假小叶,肝细胞脂肪变性也较模型对照组减轻,炎性细胞浸润较空载质粒组明显减轻,预防给药组、治疗1组的部分大鼠肝病理变化不明显,接近正常肝组织,接近丹参治疗组。相比较治疗1组而言,预防给药组纤维组织增生较少,局限于汇管区,以肝细胞脂肪变性为主,假小叶形成率较低,且全部成活。提示经过PCI-neo-HGF质粒转染对有一定的保护肝细胞、抗肝纤维化的治疗作用,值得进一步研究。为进一步的临床使用提供了重要的理论基础、技术路线和实验方法。
袁顺宗[9]2005年在《P311相互作用蛋白的初步研究》文中认为深度烧伤创面愈合后常伴随有增生性瘢痕形成,但是对参与增生性瘢痕发生发展的基因及其调控机制目前尚未完全清楚。我们曾经利用基因芯片技术筛选烧伤后早期增生性瘢痕组织与同体正常皮肤组织的差异表达基因研究,找出了97条相关基因。对这些相关基因利用生物信息学一一分析后发现Genebank ID hsu36189的代表基因p311在早期增生性瘢痕组织中呈显着的差异表达,而p311基因的表达在成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中起着重要作用。那么,该基因的编码蛋白P311在纤维化形成、瘢痕发生发展过程中的作用是什么,其作用靶点是什么?这些问题鲜见文献报道。为此,我们结合蛋白组学研究内容与技术,利用酵母双杂交系统,以融合Gal4 DNA结合区(DNA binding domain, DBD)的P311为诱饵蛋白,筛选了成人肝cDNA文库,以期得到与P311相互作用蛋白的编码基因序列,为进一步的工作奠定基础。主要内容和研究结果如下:1.诱饵基因的验证p311经PCR扩增、纯化后连接至T载体pTZ57R/T,转化DH5α进行蓝白斑筛选阳性菌落并扩增、抽提质粒测序鉴定p311序列正确。2.诱饵重组质粒构建与转化以NdeⅠ?BamHⅠ同时双酶切p311 PCR产物和含BD结合域的质粒pGBKT7,回收产物并连接,转化DH5α通过抗性筛选获得阳性细菌克隆,对其进行扩增、提取质粒并利用PCR、酶切和测序鉴定pGBKT7-p311构建成功后,采取醋酸锂法转化感受态酵母菌株AH109,通过缺陷型培养基SD/-Trp筛选阳性克隆,并经PCR再次鉴定正确后保存菌种备用。3.文库筛选按照Clontech公司的操作手册通过酵母交配实验从预转的成人肝cDNA文库中筛选能够与P311相互作用的阳性克隆。筛选前以pGBKT7空载体作为对照质粒,完成pGBKT7-p311的毒性实验、自激活实验。然后将含有pGBKT7-p311的酵母菌株AH109与含有肝cDNA文库的酵母菌株Y187进行交配后在缺陷型培养基上逐步完成四轮筛选,共获取阳性克隆98个。对98个阳性克隆利用BD、AD载体引物进行PCR鉴定后,得到同时含有诱饵和文库序列的阳性克隆55个。最终从55个阳性克隆中成功提取出40个阳性文库质粒。经转化DH5α、抗性筛选、提取质粒并测序、分类整理后,确认所有阳性克隆均无自激活作用,并与pGBKT7-p311互换宿主
参考文献：
[1]. 皮肤创伤愈合相关差异表达基因的克隆、筛选及鉴定[D]. 简华刚. 重庆医科大学. 2002
[2]. 胸腺肽β_4的生物制备研究[D]. 司信喜. 中国人民解放军军事医学科学院. 2009
[3]. 重组人胸腺素β16的表达、纯化和胸腺素β16的应用研究[D]. 冯秀萍. 吉林大学. 2009
[4]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2004
[5]. 创伤早期伤口液作用真皮多能干细胞差异表达cDNA文库的构建[J]. 屈纪富, 史春梦, 郑怀恩, 郝利, 程天民. 感染.炎症.修复. 2005
[6]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2003
[7]. 人抗菌肽LL-37的原核表达及其抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染活性的初步研究[D]. 丁静. 广东药学院. 2012
[8]. 人肝细胞再生因子表达载体构建及抗肝纤维化作用[D]. 李玉香. 吉林大学. 2007
[9]. P311相互作用蛋白的初步研究[D]. 袁顺宗. 第叁军医大学. 2005