湖南中医药高等专科学校附属第一医院 412000
【摘 要】目的：探讨gax基因过表达对自体移植静脉平滑肌细胞增殖的抑制作用，探索治疗移植静脉再狭窄的方法。方法：选用wistar大鼠40只，按照处理方法的不同，平均分成研究组和对照组。对照组在移植静脉后做空白凝胶处理，研究组则是做重组腺介导gax凝胶涂布处理，观察两组大鼠的mRNA表达、gax蛋白表达情况和平滑肌细胞表型的变化情况。结果：研究组中的mRNA表达和gax蛋白表达指标均有增高，且显著高于对照组；研究组PCNA表达明显减弱且低于对照组；研究组合成表型和过渡型VSMC数量明显减少，而收缩表型VSMC数量明显高于对照组，两组综合比较，差异显著P＜0.05。结论：血管内膜过度增生和平滑肌细胞的合成表型有密切的联系，gax基因过表达状态下，其可以明显诱使增殖型平滑肌细胞数量减少，在很大程度上抑制了增殖型平滑肌细胞向内迁移的作用，同时减少了细胞外基质的合成。
【关键词】gax基因；移植静脉；平滑肌细胞增殖；抑制作用
社会的老龄化和人们饮食结构的变化，使得动脉缺血性疾病和冠心病的发病概率每年都在增长。医学技术的发展，采用静脉移植的治疗方式在临床上的使用频率越来越高。采用静脉移植手术其有一定的局限性，即在早期静脉阻塞的概率有5%-26%，在晚期则达40%之高，发生静脉阻塞的因素主要是血管内膜增生和粥样硬化而使血管狭窄[1]。因此，本文对40只wistar大鼠进行研究，探讨gax基因过表达对平滑肌细胞增殖的影响，现将报告整理如下。
1.资料与方法
1.1一般资料
选用wistar大鼠40只，按照处理方法的不同，平均分成研究组和对照组，各20只。其中，研究组中，雌鼠10只，雄鼠10只，平均体重为（240±50）g；对照组中，雌鼠9只，雄鼠11只，平均体重为（245±55）g；所有大鼠均行自体颈内静脉-颈总动脉移植术。两组大鼠的一般资料差异比较P＞0.05，存在可比性。
1.2方法
1.2.1治疗方法
对照组在移植静脉后做空白凝胶处理，研究组则是做重组腺介导gax凝胶涂布处理，具体处理方法是：行自体颈内静脉-颈总动脉移植术后，在移植动脉和周围吻合的地方涂抹剂量为2×1011v·g/ml的rAVV-Gax和浓度为30%的凝胶[2]。
1.2.2检测方法
免疫组织化学方法：PCNA抗体染色，采用3%双氧水、50μl免疫动物血清和50μl过氧货物酶阻断液进行15-20分钟的卵育；
蛋白印迹方法：电泳缓冲液由14.1g氨基乙酸和3.01g Tris两者进行水溶。转印液由11.1g氨基乙酸和2.3g Tris两者进行水溶。取100mg的组织加入溶解缓冲液，操作流程是电泳-转印-封闭-1抗孵育-2抗孵育-检测结果[3]。
反转录酶链式反应方法：提取RNA，并对其浓度和纯度进行测定，进行反转录酶链式反应，检测PCR产物。
电镜分析法：采用H-600型透射电镜观察VSMC的超微结构。取移植静脉6块，用浓度为2.5%的戊二醛进行固定，并用不同浓度的酒精逐级脱水之后切成薄片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色后观察[4]。
1.3观察指标
观察两组大鼠的mRNA表达、gax蛋白表达情况和平滑肌细胞表型的变化情况。
1.4统计学方法
采用SPSS19.0软件对数据进行统计和分析，用均属差（X±S）表示计量资料，若（P＜0.05）则差异比较具有统计学意义。
2.结果
2.1两组大鼠mRNA表达和gax蛋白表达指标对比情况
通过反转录酶链式反应方法，研究组中的mRNA表达和gax蛋白表达指标均有增高，且显著高于对照组P＜0.05，数据见表1。
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表1 两组大鼠移植静脉后mRNA表达和gax蛋白表达指标比较
分组 mRNA表达 gax蛋白表达
研究组 33.76±13.41 13.71±3.41
对照组 54.31±11.47 4.3±2.21
2.2两组大鼠PCNA指标对比情况
通过免疫组织化学方法，研究组PCNA表达值为（107.1±37.9）明显减弱且低于对照组的（51.2±26.2）P＜0.05。
2.3两组大鼠VSMC表型的检测结果对比情况
通过电子显微镜，研究组合成表型和过渡型VSMC（平滑肌细胞）数量明显减少，而收缩表型VSMC数量明显高于对照组，两组比较差异显著P＜0.05，数据见表2。
表2 两组大鼠VSMC增殖状态检测结比较
分组VSMC
收缩表型 过渡型 合成表型
研究组 67.6±9.8 9.1±1.6 22.2±5.1
对照组51.6±11.9 11.1±2.3 37.4±8.1
3.讨论
临床上多数是采用静脉移植治疗冠心病和动脉缺血性疾病，应其自身的局限性，多表现为静脉阻塞的并发症。组成血管壁的主要细胞成分就是平滑肌细胞，其也是形成移植静脉后血管再狭窄使得血管内膜增生的细胞。PCNA是一种核糖蛋白，也是细胞复制DNA的必要成分，其分子量为36KD，临床上也称其为周期蛋白。PCNA量与DNA的合成水平成正比关系，所以，PCNA量在一定程度上可以反映平滑肌细胞增殖的分布和数量[5]。早期胚胎发育过程中主要表现为合成型，其细胞活动表现为合成、增殖、迁移等。在一些病理情况下，收缩表型平滑肌细胞可以转化成合成表型。VSMC的过度增殖影响过度的血管内膜增生转化状态。gax基因是一种抑制性转录因子，是一种可抑制VSMC从收缩型向合成型转化的核基因，有明显抑制细胞增殖的作用。gax基因通常是在心血管组织中表达，在收缩或静止的VSMC中有更高的表达，其抑制机制主要是抑制转录因子直接作用于增殖期细胞，使该细胞在G1细胞周期即刻终止，使其表达水平出现过性下调趋势，从而引起细胞凋亡[6]。
在本文研究中，研究组中的mRNA表达和gax蛋白表达指标均有增高，且显著高于对照组；研究组PCNA表达明显减弱且低于对照组；研究组合成表型和过渡型VSMC（平滑肌细胞）数量明显减少，而收缩表型VSMC数量明显高于对照组，两组综合比较，差异显著P＜0.05。
总而言之，血管内膜过度增生和平滑肌细胞的合成表型有密切的联系，gax基因过表达状态下，其可以明显诱使增殖型平滑肌细胞数量减少，在很大程度上抑制了增殖型平滑肌细胞向内迁移的作用，同时减少了细胞外基质的合成。
参考文献：
[1]郑辉，薛松，连锋，胡振雷，汪永义.人Gax基因转染对血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响[J].中国病理生理杂志.2012，8（13）：706-708.
[2]吴海卫，许飚，王军，沈中华，景华，李德闽，董国华.C-myc siRNA抑制大鼠自体移植静脉再狭窄的研究[J].医学研究生学报.2012，09（07）：106-107.
[3]夏世金，吴俊珍，万文斌，孙涛，彭正羽，吴金峰，胡明冬，钱桂生.Gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞增殖与ET-1、VEGF和eNOS蛋白表达的影响[J].中国老年学杂志.2013，33（17）：88-90.
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[5]亓明，王新文，罗英伟，秦岭峰，马文锋，张强，辛世杰，段志泉.CDK2、CDK4基因与自体移植静脉内膜增殖的关系[J].大连医科大学学报.2012，13（22）：159-160.
[6]魏立春，侯培勇，李祺熠，苏奕明，郑毅.自体移植静脉再狭窄基因水平的研究进展[J].中国普通外科杂志.2013，10（11）：278-279.
论文作者:李文韬,陆辉辉,邢军
论文发表刊物:《航空军医》2015年7期
论文发表时间:2015/10/16
标签：平滑肌论文; 细胞论文; 表型论文; 静脉论文; 对照组论文; 基因论文; 大鼠论文; 《航空军医》2015年7期论文;