燕飞[1]2006年在《hpRNA和pac1基因介导抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究》文中指出在以往的抗BYDV转基因小麦研究中,已经使用的策略有CP基因介导的病毒抗性、复制酶基因介导的病毒抗性、运动蛋白基因介导的抗性,虽然这些抗性手段对BYDV具有延迟发病的抗性作用,但一直没有获得能够达到高度抗性水平的抗BYDV转基因小麦植株。同时,这些抗性手段都具有专一性,只对基因来源病毒表现抗性,对其他病毒没有作用,即不具有广谱性。本文从进一步提高对BYDV的特异抗性和病毒广谱抗性两个方面入手进行小麦转基因研究,希望获得高抗BYDV的转基因小麦植株和具有广谱病毒抗性的转基因小麦。 在提高对BYDV抗性的转基因小麦研究方面,利用BYDV-GPV株系的复制酶基因(Pep)片段和外壳蛋白基因(CP)片段构建成可表达复合发夹RNA(hpRNA)——含有由Rep片段双链(CP双链)RNA构成的茎和反义CP(反义复制酶片断)RNA构成的环——的表达框架,将该框架分别连入含有CaMV 35S启动子和Emu启动子的真核表达载体,通过农杆菌介导法(转35S:CP+/Rep-/CP-结构)、基因枪法(转Emu:Rep+/CP-/Rep-结构)和花粉管通道法(分别转Emu:Rep+/CP-/Rep-和Emu:CP+/Rep-/CP-结构)对小麦进行遗传转化,基于该结构表达的hpRNA诱发植物体内针对病毒基因组不同部位的RNA干扰机制而达到特异性高度抗病毒的目的。实验结果表明:①在农杆菌介导法获得的82株G418抗性植株中有75株PCR结果呈阳性;经过第一次病毒抗性试验,有59株未发病或只有轻微症状:Dot blot检测表明59株抗性植株中有46株整合有外源基因;ELISA结果表明整合有外源基因的植株中有37株能够正常表达外源基因;Southernblot结果表明外源基因在小麦体内多以双拷贝形式存在:第二次病毒抗性试验表明,在Dot blot、ELISA呈阳性的37株再生植株中有14株表现低度抗性,有12株表现中度抗性,有10株表现高度抗性,另外1株在实验过程中死亡。②在基因枪法转化中,因未使用标记基因,故应用改进的叶片快速PCR对再生幼苗在生根阶段进行筛选,共移栽成活64株快速PCR阳性植株;经第一次病毒抗性试验有30株表现抗性,Dot blot结果表明其中21株整合有外源基因:经第二次病毒抗性试验,21株Dot blot阳性植株中有5株表现低度抗性,有8株表现中度抗性,有8株表现高度抗性。③通过花粉管通道法获得转Emu:Rep+/CP-/Rep-结构的种子367粒,获得转Emu:CP+/Rep-/CP-结构的种子545粒:对T1代幼苗进行大田抗病性鉴定结果表明,有2株转Emu:CP+/Rep-/CP-结构小麦植株在接毒40天后仍没有明显发病症状。 在提高病毒抗性谱方面,利用克隆自粟酒酵母的pac1基因通过农杆菌介导法转化小麦。该基因是一种RNA双链分解酶。由于大多数植物病毒为RNA病毒,不管其基因组是单链还是双链,在寄主体内复制过程都会有一个双链RNA中间体阶段,如果通过基因工程手段将pac1基因转入植物体,利用其降解病毒dsRNA的活性而阻断病毒复制过程,就有可能达到抗植物病毒病的目的。并且pac1的作用靶位点只针对RNA双链,对RNA的序列无特殊要求,这就扩大了其对病毒抗性谱。本转化试验共获得41株G418抗性植株;经第一次病毒抗性试验获得30株抗性植株:其中27株PCR和Dot blot结果呈阳性:ELISA和RT-PCR结果表明27株整合有外源基因的再生植株中有25株能够正常表达外源基因;经第二次病毒抗性试验,获得12株低度抗性植株,12
吴茂森[2]2000年在《大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因介导的抗病毒转基因小麦的研究》文中研究说明将已知BYDV-GPV部分序列，与其他黄症病毒序列比较，合成相应的上下游引物，以BYDV-GPV株系病毒RNA为模板，RT-PCR分别扩增了GPV株系的ORF1和ORF2基因片段。经过酶切、连接、转化，将2个基因片段分别插入到pUC19质粒之中，获得了重组质粒pUC19-ORF1和pUC19-ORF2。对基因片段进行序列分析结果表明，ORF1全长1953个核苷酸，可编码651个氨基酸、分子量为71.4kD的蛋白质；ORF2全长1872个核苷酸，可编码624个核苷酸、分子量为70.1kD的蛋白。在ORF1和ORF2之间存在着一较长的重叠区域，达601个核苷酸。与其他黄症病毒的序列比较结果，GPV与RPV的同源性最高，ORF1同源性达66.4％，ORF2达81.7％；推测出的编码氨基酸序列，P_1同源性为55.6％，P_2为81.5％。与PAV的同源性最低，核苷酸同源性分别为ORF1/44％，ORF2/42％，并且仅为部分同源；推测的氨基酸序列几乎没有同源性。 根据测定的基因序列，分别设计合成相应引物，RT-PCR扩增ORF1和ORF2基因片段，将基因片段分别插入到含Emu启动子的质粒pEmu-mcs-N之中，构建成用于小麦转化的植物表达载体pPPI 12（ORF2重组质粒）和pPPI 13（ORF1重组质粒）。利用花粉管通道途径分别转化了小麦品种陕160、陇鉴127及晋麦47、京冬8号。对得到的转化种子经过卡那霉素抗性筛选、田间直接抗病性筛选、Dot blot、PCR检测和Southern分析，最终得到3个阳性的T_1代ORF2转基因系。其中2个为陕160转化后代，1个为陇鉴127转化后代。温室和田间的抗病性鉴定，陕160转基因系表现出具有高度的抗性，在对照植株严重发病时不表现症状或仅出现轻微的叶尖发黄症状；陇鉴127转基因系可达到减轻症状的效果，在对照叶片全部黄化时，仍能保持旗叶不发病或发病面积小于1/3。ORF1基因转化后代中没有检测到Southern阳性中国农业科学院博士学位论文的转化株。 缺失OgyZ基因转化小麦收获的转化种子，经过卡那霉素筛选、PCR检测和 Southern分析，陕 160、晋麦 47和陇鉴 127三个品种的转化材料，仅在晋麦47后代中得到了阳性的转化株，TI代Southern检测中，2个转基因系获得了阳性的结果。转基因材料进行的田间抗病性鉴定结果，表现出椎迟发病减轻症状的效果。
李永丽, 史洪中, 陈利军, 周洲[3]2006年在《转基因小麦抗大麦黄矮病毒研究进展》文中研究指明转基因技术为培育抗黄矮病小麦提供了一条有力的途径,综述国内外在小麦抗BYDV的转基因研究进展。探讨目前主要基于BYDV自身的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因以及蚜虫传毒相关蛋白基因进行的抗BYDV小麦转基因研究现状和成果,并对未来培育抗黄矮病小麦研究进行展望。
许雷[4]2001年在《大麦黄矮病毒GPV株系ORF5基因的克隆、表达载体构建及转基因研究》文中研究指明将已经测定的GPV株系ORF5部分基因序列与RPV株系的序列进行比较，根据ORF5起始区域的核苷酸序列合成上游引物，以RPV ORF5基因框架3’外侧核苷酸及编码氨基酸序列作为参考，设计3’简并引物，以GPV ORF5基因组RNA为模板，RT—PCR扩增GPV ORF5基因片段，用pGEM-T载体克隆扩增片段。对克隆基因片段进行序列分析结果表明，ORF5全长1326个核苷酸，可编码441个氨基酸、分子量为50kD左右的蛋白质。这是首次获得GPV株系ORF5基因完整序列。 与其他黄症病毒ORF5基因核苷酸序列进行比较的结果显示，GPV与RPV的同源性最高，同源性达68.1%；与马铃薯卷叶病毒（PLRV）和甜菜西方黄化病毒（BWYV）的同源性次之，分别为33.6%和39.8%，与PAV、SGV、GAV、MAV的同源性分别为30.2%、28.8%、28.5%和29%。根据核苷酸序列推测出ORF5基因编码的氨基酸序列，对GPV株系与本组其它病毒的氨基酸序列等进行比较，结果显示GPV与RPV的同源性最高，为72.4%，与PLRV、BWYV的同源性次之，分别为31.4%和40.5%，与PAV、SGV、GAV、MAV的同源性最低分别为、25.6%、22.6%、25.1%、26.5%。根据最新的植物病毒分类研究进展，RPV、PLRV和BWYV均属于黄症病毒科的Polerovirus属，根据ORF5基因的序列分析和基因序列同源性比较结果，初步推测分离自中国小麦黄矮病株上的GPV株系在分类上属于黄症病毒科的Polerovirus属。 对由GPV ORF5和RPV ORF5基因核苷酸序列推测出的氨基酸片段进行氨基酸组成、部分理化性质及计算机模拟的蛋白结构模块进行比较。结果显示尽管GPV ORF5与RPV ORF5存在同源性，但两者在氨基酸片段长度、氨基酸组成、部分理化性质及蛋白结构模块的组成和分布上有较大的差异。 大麦黄矮病毒GPV株系Ohs基因的克隆、表达载体构建及转基因研究 根据测定的基因序列，分别设计合成含有酶切位点的ORFS的5’端 （含Xbl和起始密码AUG）和3’端（含K列）引物，通过RTICR方法扩增Ogys基因片段，将基因片段经过Xbopnl双酶切后插入到pGEM—3Z质粒中，兰白斑筛选重组质粒，提取质粒，Hindlll酶切、ienow酶补平、EcoAI二次酶切，切下带粘平端的ORFS基因片段，插入经Ndel酶切冲平／EcoM二次酶切的原核表达载体 pET6 中，筛选重组质粒，完成Ogys基因片段的非融合原核表达载体的构建。重组质粒转化进受体菌 BL21（DE3），IPTG诱导 GPV ORFS基因的非融合表达，SDS—PAGE分离表达产物，发现诱导后产生一个50KD左右的蛋白组份，与根据基因序列推导出的蛋白质分子量相近，western杂交分析表明，该诱导出的蛋白可与GPV发生血清学反应。 RT—PCR扩增的ORFS基因片段用Xbal／Knl双酶切后插入到带相同双酶切位点的含有Emu启动子和Nos终止子的质粒pEmu－mes－N之中，构建成用于小麦转化的植物表达载体 pPPI（ORFS重组质粒人利用花粉管通道方法，与含有Bar基因的质粒pACH—20进行双质粒共转化，转化品种选自我国小麦黄矮病高发区的高产、优质、不抗病的小麦品种陇鉴127、晋麦47，每个品种转化小花数均在1000个以上，收获种子数分别为74粒和sl4粒。 播种转化种子，提取小麦总DNA，进行PCR检测，结果得到3株阳性的 T。代植株，2株为陇鉴 127、l株为晋麦 47。对阳性植株的 DNA进行PCR、PCRSouthem、Southern分析，均获得阳性的杂交结果。表明转基因小麦后代中存在看己整合进染色体的GPV株系ORFS基因。
晋治波[5]2003年在《大麦黄矮病毒GAV基因组全序列分析及运动蛋白基因介导的抗病毒小麦的研究》文中研究说明本研究运用反转录PCR与5’和3’RACE的方法，首次测定了在中国分离得到由麦长管蚜和麦二叉蚜传播的大麦黄矮病毒GAV的基因组核苷酸全序列(GenBank登录号：AY220739)，并与其它相关病毒(分离物)进行了比较。另外，通过RT-PCR、克隆和序列测定，获取大麦黄矮病毒GAV分离物的运动蛋白基因(MP)并经过缺失突变构建了植物表达载体。采用基因枪介导法转化小麦品种扬麦158，初步研究了运动基因介导的抗病性。 根据已报道大麦黄矮病毒MAV-PS1的基因组序列和大麦黄矮病毒GAV的部分序列设计引物，通过RT-PCR获得GAV的ORF1、ORF2、以及ORF1-ORF6各基因之间的序列片段。经过克隆、序列测定和拼接得到GAV基因组RNA大部分核苷酸序列。采用已测定的ORF6上游一段序列和PAV-aus的3’最末端保守序列作为特异引物进行RT-PCR，获得GAVORF6下游大部分序列。最后经过5’RACE和3’末端寡核苷酸锚定PCR完成基因组RNA全序列测定。序列分析表明，该病毒分离物的RNA基因组由5685个核苷酸组成。分子量大小与BYDV-PAV澳大利亚分离物PAV-aus接近。它与MAV美国MAV-PS1分离物基因组序列同源性最高，全基因组为90.4％。基因组所含有的六个开放阅读框架，除ORF5和ORF6核苷酸序列同源性分别为87.4％和72.0％外，其他基因核苷酸序列同源性均大于90％。各基因编码的蛋白氨基酸顺序同源性除P6蛋白和通读蛋白(RTP)分别为67.4％和87.4％，其它均大于90％。其中外壳蛋白(CP)为95.5％。根据GAV和BYDV-MAV的相似性，GAV应是一种与BYDV-MAV类似的病毒，这是有关BYDV-MAV或相似病毒基因组全长序列的首次报道。 通过RT-PCR、克隆和序列测定，获取大麦黄矮病毒GAV分离物的运动蛋白基因。同源性比较显示，它与MAV-PS1分离物运动蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸顺序同源性分别为97.8％和96.8％，而与PAV-aus的同源性仅为78.3％和70.1％。把该片段克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX-4T1上，转化JM109后经IPTG诱导得到强烈表达的目的蛋白。采用谷胱苷肽亲和层析柱纯化表达产物，纯化后的融合表达蛋白经SDS-PAGE电泳检测纯度大于90％。将纯化的表达产物免疫家兔制备抗血清。运用制备的抗血清检测被GAV侵染的燕麦叶片，结果表明在发病燕麦体内含有与抗血清发生特异性作用的22KD蛋白，而对照健康燕麦呈阴性反应。由以上证据可知，抗血 中囚状业科学院博士学位论文一清可以用于转基因植物的检测和运动蛋白的体内定位研究。 分别把运动蛋白（MP）全长基回片段、缺失 N端门个氨基酸的基因片段（So）。缺夫C端19个氨基酸的基因片段臼Q）和缺失两端36个氨基酸的基回片段门3Q入克隆到表达质粕pEmu－mesN上，构建植物表达质粒pEmuMP、pEmu5Q、pEmu3Q和 pEmu臼Q。采用基因枪介导法分牙叫苔三种质粒 pEmuMP。pEmu5Q、pEmu3Q导入小麦品种扬麦158。经草丁膀抗性筛选、PCR。Southern杂交等一系列分子鉴定，分别获得导入 pEmuMP的转基因 TO代小麦 14株，转化率为 0．53％；导入 pEmu3Q的转基因小麦为3株，转化率为0．ZI％；而导入pEmu5Q的愈伤组织没有获得转基因植株。继续对部分盆栽的＊代植株进行分子检测和接种病毒抗病性筛选。转入全长运动蛋白基因的植株表现为发病较快且症状较重，发病时间比对照提前约一周左右。导入缺失突变基因的植株发病延迟，症状相对较轻。
李永丽[6]2004年在《大麦黄矮病毒GPV株系（BYDV-GPV）ORF4基因的原核表达及抗血清的制备》文中研究说明大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus, BYDV）是一种十分重要的禾谷类作物病毒。尽管有研究推测 BYDV 的 ORF4 与病毒在寄主体内的运动有关，但关于病毒在寄主体内的运转机制尚不了解。本研究首次对我国特有的BYDV-GPV株系的ORF4基因进行原核表达，并制备特异性的抗血清，成功用于 BYDV-GPV 侵染后燕麦体内表达的 17kDa 蛋白的检测，为进一步的研究奠定基础。 根据已测定的 BYDV-GPV 的相关序列设计合成含有适宜酶切位点的相应引物，通过 RT-PCR 方法扩增出ORF4 基因片段并将其插入到 pGEM-T Easy 质粒中，获得了重组质粒pGEM-T-O4。对基因片段进行序列分析结果表明，ORF4 全长 456 个核苷酸，可编码 152 个氨基酸，分子量为 17kDa 的蛋白质。pGEM-T-O4 经 Nde I和 BamH I 双酶切后插入到质粒 pET-5a 中获得原核表达载体pET-O4。经 IPTG 诱导基因表达及 SDS-PAGE结果分析，与作为对照的(i)未经诱导的含有pET-O4 质粒的和(ii)诱导的含 pET-5a 质粒的 BL21(DE3)pLysS 相比，诱导后的 pET-O4 中的 ORF4 基因在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中得到了特异性的表达，诱导表达的蛋白质分子量大小约为 17kDa，与通过基因序列推导的大小一致。试验对不同浓度的 IPTG、以及不同时间诱导的蛋白表达水平进行了研究，结果显示，不同浓度的 IPTG 对蛋白的诱导表达影响不大，而不同诱导时间对蛋白的诱导表达量有一定的影响，8h 以前时间越长表达量越高，但 8h 以后表达量的增长不明显。 将 ORF4基因编码的蛋白从聚丙烯酰胺凝胶上切下后，经圆盘电泳进行回收纯化。通过免疫家兔获得了 BYDV-GPV ORF4 基因非融合蛋白的特异性抗血清，用微量滴定法测定抗血清的效价为 1/2048。<WP=7>BYDV-GPV ORF4基因在 E.coli 中表达蛋白的 Western blot 检测结果表明，所制备的抗血清能与诱导的 pET-O4／BL21(DE3)pLysS 及作为阳性对照的 17kDa 蛋白发生特异性反应，而与阴性对照 pET-5a／BL21(DE3)pLysS 无特异性反应。BYDV-GPV 侵染燕麦后的 Westernblot 分析结果表明，所获得的抗血清与接毒１d、２d、３d 和４d 的燕麦叶片中提取的蛋白样品均呈阳性反应，而与未接毒的燕麦叶片中提取的蛋白样品不产生任何阳性反应，并且随着接毒天数的增加反应呈增强趋势。
杨洋[7]2011年在《转基因小麦分子生物学鉴定及对大麦黄矮病毒品系抗性的研究》文中指出小麦黄矮病是一种由蚜虫传播的严重病毒病害,常造成小麦生长发育缓慢,矮化严重,病株抽穗率极低的现象的出现,曾出现小麦严重绝产的情况发生。目前对于小麦黄矮病的防治一直以来停留在化学药剂杀灭蚜虫、杂交选育抗病品种以及调整小麦播期避开介体蚜虫的迁移期等方面,但化学方法给环境带来较大的压力,而杂交育种需要常年的培育,又需要消耗大量人力物力,结果也不是很理想。随着分子生物学的发展,转基因技术越来越多的应用到植物抗病育种方面。本试验在前人试验基础上对小麦黄矮病转基因品系进行了田间抗病性和遗传稳定性的相关调查,还针对转基因生物的生物学安全性进行了调查,得到以下试验结果:(1)本研究通过对成功转大麦黄矮病毒GAV株系的全长CP基因构建成RNAi结构的转基因扬麦品系T4代进行PCR和PCR-southern blot鉴定,证明T4代转基因扬麦品系能过稳定遗传。(2)对不同转基因单株进行人工接毒,表现出明显高于非转基因品种的抗性,在农艺性状某些方面保持了或强于与原品种扬麦158。抗性试验和农艺性状结果表明,转基因T4代植株对BYDV的抗性不同可能受到拷贝数和染色体分离连锁的影响。(3)通过对T4代转基因扬麦品系在田间进行了相关生物安全性的调查,发现T4代转基因小麦对真菌病害以及田间生物杂草有任何影响,也未观察到田间生物群落的结构变异。转基因生物还需一个长时间的田间试验和试验室试验相结合的进行的生物安全性的研究和讨论。(4)采用正反交相结合的方法对T4代转基因小麦和小偃6号、小偃22号和西农979这三个推广品种进行了常规的杂交杂交育种,得到了部分杂交小麦F1代,为下一步继续试验提供了试验材料。
孙文瑜[8]2009年在《具双T-DNA区的大麦黄矮病毒复制酶基因双链RNAi植物表达载体构建》文中认为大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDVs)是单链正义RNA病毒,由蚜虫以循徊型持久传播,病毒粒体在蚜虫体内不增殖,不能通过汁液摩擦接种。禾谷类黄矮病毒病是由大麦黄矮病毒引起的,在小麦、大麦、燕麦和黑麦等多种作物上广为传播的一种毁灭性病毒病害,造成产量损失,同时还劣化谷物品质,它的发病面积和危害程度呈逐年扩大和加重趋势。BYDV-GAV是当前我国流行的病毒株系。由于栽培品种中的抗黄矮病基因极少,因此传统的抗黄矮病育种方法进展缓慢,采用基因工程技术手段研究新的抗黄矮病毒的技术已成为目前抗黄矮病育种工作的关键。本研究是将BYDV-GAV株系的复制酶基因片段GAVpol+(824bp)插入到植物双元表达载体pMBW246的KpnI和EcoRI克隆位点,构建成pMBW246-GAVpol+中间载体;然后将比GAVpol+少217bp碱基的基因片段GAVpol-(607bp)反向插入到中间载体pMBW246-GAVpol+的EcoRI克隆位点,构建编码BYDV-GAV复制酶基因发卡RNA的中间载体pMBW246-hp-GAVpol,其在细胞内能形成RNA发卡结构,进而通过RNA干扰有效抑制病毒复制酶基因表达,从而阻止病毒在寄主体内的繁殖和侵染扩展,获得高水平抗性;最后将pMBW246-hp-GAVpol上包括Ubi启动子、Tm1'终止子和复制酶基因发卡RNA反向重复序列的片段酶切后,克隆到中间表达载体pWBVec8-2B的一个T-DNA区,另一个T-DNA区载有hpt基因,由此构建成具双T-DNA区的BYDV-GAV复制酶基因RNAi载体pWBVec-2B-hpGAVpol。目的基因表达框和选择标记基因表达框置于双边界的T-DNA载体内,易于从分离群体中选择得到剔除选择标记的转基因植株,为进一步通过根癌农杆菌介导的遗传转化,培育无选择标记基因的抗黄矮病转基因作物奠定基础。
谭爱女[9]2012年在《小麦农杆菌转化体系优化及抗黄矮病新种质创制》文中研究表明小麦幼胚是农杆菌转化的最理想材料,然而农杆菌侵染后亦存在愈伤组织褐化、转化效率低等问题,因此对侵染后小麦幼胚愈伤组织进行褐化拯救,以及建立完善高效的小麦幼胚农杆菌转化体系对推动小麦基因工程育种非常重要。小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)引起、由蚜虫介导,侵害小麦的一种毁灭性病毒病,它的发病面积和危害程度呈逐年扩大和加重趋势,因此利用基因工程技术,创制小麦黄矮病抗性品种,成为当务之急。本研究在优化小麦农杆菌转化体系的基础上,将抗黄矮病RNA干扰(RNA interference, RNAi)植物表达载体pWBVec-2B-hpGAVpol导入小麦基因组,能获得对BYDV-GAV表现抗性的小麦品种。主要研究结果如下：1筛选出了适宜小麦胚性愈伤组织培养及分化的潮霉素浓度,分别为30mg/L和50mg/L,为小麦农杆菌转化奠定了基础。以小麦品种CB037成熟胚诱导愈伤,分别在小麦的胚性愈伤组织诱导培养基和分化培养中,设置0mg/L,30mg/L,50mg/L,80mg/L,110mg/L五个梯度浓度的潮霉素筛选处理,分析结果表明30mg/L和50mg/L是愈伤组织培养及其分化再生阶段适宜的潮霉素筛选浓度。2建立了以小麦品种CB037幼胚为外植体的相对稳定高效的农杆菌转化体系,促进了小麦基因工程育种的发展。以小麦品种CB037幼胚为外植体诱导愈伤组织,用携质粒pCAMBIA1303的根癌农杆菌AGL1进行遗传转化,在培养基中共同添加40g/L甘露醇和500mg/L L-半胱氨酸,优化了小麦幼胚农杆菌转化体系,其中GUS基因瞬时表达率94%、胚性愈伤诱导率65.7%、分化率39.1%和转化效率8.2%。且潮霉素抗性检测及PCR鉴定结果吻合率高达92.6%,证明了hpt基因不仅是良好的选择标记基因,同时也可用作报告基因用于小麦农杆菌转化,通过鉴定再生植株离体叶段的潮霉素抗性,对大批量的转基因植株后代进行简便、快速及有效地鉴定。3应用基因沉默技术,创制了小麦抗黄矮病新种质,为小麦抗黄矮病育种提了优良的抗源材料。利用优化的小麦幼胚农杆菌转化体系,将抗黄矮病RNAi表达载体pWBVec-2B-hpGAVpol导入小麦品种科农199,共获得14株转基因阳性植株,转化效率2.1%,且通过To带自交已获得T1带转基因材料。
刘太国, 吴茂森, 张文蔚, 李世访, 成卓敏[10]2005年在《花粉管通道法介导的抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究》文中研究表明构建了大麦黄矮病毒GPV株系串联结构复制酶基因植物表达载体pPPI29,通过花粉管通道法转化了CA8686小麦,对T0代种子进行了分子检测,获得6株转基因小麦,转化率达到0.45%;对获得的T0代转基因小麦进行了田间抗病性鉴定,结果表明4株转基因小麦对GPV株系表现为高抗,可以推迟发病23 d。
参考文献：
[1]. hpRNA和pac1基因介导抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究[D]. 燕飞. 中国农业科学院. 2006
[2]. 大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因介导的抗病毒转基因小麦的研究[D]. 吴茂森. 中国农业科学院. 2000
[3]. 转基因小麦抗大麦黄矮病毒研究进展[J]. 李永丽, 史洪中, 陈利军, 周洲. 安徽农业科学. 2006
[4]. 大麦黄矮病毒GPV株系ORF5基因的克隆、表达载体构建及转基因研究[D]. 许雷. 中国农业科学院. 2001
[5]. 大麦黄矮病毒GAV基因组全序列分析及运动蛋白基因介导的抗病毒小麦的研究[D]. 晋治波. 中国农业科学院. 2003
[6]. 大麦黄矮病毒GPV株系（BYDV-GPV）ORF4基因的原核表达及抗血清的制备[D]. 李永丽. 河南农业大学. 2004
[7]. 转基因小麦分子生物学鉴定及对大麦黄矮病毒品系抗性的研究[D]. 杨洋. 西北农林科技大学. 2011
[8]. 具双T-DNA区的大麦黄矮病毒复制酶基因双链RNAi植物表达载体构建[D]. 孙文瑜. 四川农业大学. 2009
[9]. 小麦农杆菌转化体系优化及抗黄矮病新种质创制[D]. 谭爱女. 四川农业大学. 2012
[10]. 花粉管通道法介导的抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究[J]. 刘太国, 吴茂森, 张文蔚, 李世访, 成卓敏. 植物保护. 2005
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