沈永泉[1]1997年在《人白细胞介素-15cDNA克隆和表达及IL-15 cDNA转染肺癌细胞所诱导的抗肿瘤效应》文中研究说明IL—15是一种新近发现的细胞因子，具有同IL—2相似的生物学功能。IL—15对T细胞、NK细胞和B细胞均能够产生促增殖促分化的作用，并能够诱导淋巴细胞产生IFN-γ、TNF-α。在胸腺微环境和骨髓微环境中，IL—15对NK前体细胞的发育、分化、增殖及成熟具有重要的作用。IL—15通过增加CD18分子和穿孔素分子的表达而诱导较强的NK／LAK／CTL活性，在体外同等的条件下，其诱导的细胞毒效应比IL—2诱导的高2～3倍。动物实验结果显示，在体内，IL—15诱导的特异性杀伤效应只有IL—2的1／3，但是它诱导的NK杀伤活性比IL—2诱导的高3～4倍；而且IL—15产生的血管渗漏综合症等毒副作用时所需的剂量是IL—2的6倍，其治疗系数至少比IL—2高三倍以上。上述的这些结果表明，IL—15具有明显的抗肿瘤效应。因此，IL—15基因转染的肿瘤细胞可望作为肿瘤疫苗发挥平抗肿瘤作用。 近年来，细胞因子基因治疗肿瘤的研究取得了很大的进展，动物实验研究结果证实，细胞因子基因转染的肿瘤细胞疫苗可以大大提高肿瘤细胞的免疫原性，诱发机体产生局部和／或全身的抗肿瘤免疫应答。许多细胞因子基因(包括IL—2、IL—4、IL—6、IL—7、IL—12、GM—CSF、TNF-α、IFN-γ)被RAC／FDA批准试用于临床，进入Ⅰ、Ⅱ期临床前研究。目前，国内外有关人IL—15基因转染肿瘤细胞诱导抗肿瘤生长及转移的研究工作尚未见报道。本研究在人IL—15基因克隆、表达及其基因转染肿瘤细胞诱导抗肿瘤作用方面作了探讨，以期为IL—15的深入理论研究和临床应用提供依据。 本研究采用逆转录PCR方法，从脂多糖刺激活化的人外周血粘附性单核细胞中克隆了人IL—15cDNA，经序列分析证实，它除了包括编码IL—15成熟蛋白及信号肽的全部核苷酸之外，还包括5'非翻译区及3'非翻译区的部分核苷酸，其序列与文献报道一致。在此基础上再次使用PCR方法扩增出编码IL—15成熟蛋白的cDNA，将其于BamH I位点正向插入原核表达载体pGEX—2T，完成了重组质粒pGEX—2T—IL—15的构建。然后将pGEX—2T—IL—15转化大肠杆菌JM109，在1mM IPTG的诱导下表达了GST—IL—15融合蛋白，SDS—PAGE分析显示其分子量大约为44Kd，其表达量约占菌体总蛋白的8·8％，Western Blot证实，它能够与抗IL—15的多克隆抗体发生特异性结合。至此，我们完成了人IL—15基因的克隆并在大肠杆菌中获得了表达。
潘泓[2]2007年在《非小细胞肺癌术后化疗相关基因的临床与基础研究》文中认为研究背景恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重疾病之一。近二十年全国性死亡原因调查显示,死亡率上升幅度最大的是肺癌。目前肺癌的治疗一般采用手术、化疗、放疗、免疫治疗等综合措施,其中化疗作为全身性治疗手段,在恶性肿瘤的治疗中具有手术和放疗不能替代的地位。经过长期的临床经验总结和一些大规模临床随机对照研究,已经达成共识,对完全性切除术后的晚期非小细胞肺癌给予以铂为主的术后辅助化疗能够提高患者的生存率,但对于早期的非小细胞肺癌是否给予术后辅助化疗尚存在争议。一些研究认为对于早期的非小细胞肺癌给予术后辅助化疗可以使3年生存率提高3%,使5年生存率提高5%,建议对完全性切除术后的早期非小细胞肺癌给予以铂为主的术后辅助化疗。而另外一些研究发现对完全性切除术后的早期非小细胞肺癌给予术后辅助化疗,不能提高患者的生存率,反而增加了毒性反应和经济负担。我们认为影响非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的原因是患者本身的分子机制不同所致。本研究重心是寻找影响非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的分子标志物,建立一个判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的分子模型以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗。并且针对一个有意义的分子指标进行深入研究,探索其作为非小细胞肺癌靶向治疗的潜能。本研究许多内容在国内尚未有相关报道,为探索性实验,本研究主要由5部分组成。研究内容第一部分非小细胞肺癌术后辅助化疗的疗效观察目的:通过本院近10年的临床资料,分析术后辅助化疗在完全性切除术后的非小细胞肺癌中的意义,并用循证医学方法了解术后辅助化疗在完全性切除术后的早期非小细胞肺癌中的意义。方法:回顾性分析近10年在本院行根治性切除的542例非小细胞肺癌的临床资料,其中268例是Ⅲ期NSCLC,274例是Ⅰ、Ⅱ期NSCLC。通过Medline、CNKI、VIP数据库查找关于早期NSCLC行术后辅助化疗临床随机对照研究,用Review Manager4.2软件进行统计学分析。结果:从本院资料分析显示:对切除术后Ⅲ期NSCLC患者进行3～4周期,以顺铂为基础的化疗方案的辅助化疗,可以提高长期生存率;对根治切除术后Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者不需常规进行辅助化疗。Meta分析显示:共16项研究纳入分析,早期NSCLC完全切除术后加用含铂的辅助化疗方案,不能显著提高患者的生存率。结论:寻找分子标志物以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗是一个有意义且亟待解决的研究课题。第二部分多基因蛋白表达判断早期非小细胞肺癌术后化疗疗效的探讨目的:目前研究认为与癌症化疗相关的基因有以下六类:(1)药物动力学相关基因;(2)各种生物酶相关基因;(3)DNA损伤与修复相关基因;(4)凋亡相关基因;(5)致癌、抑癌基因;(6)细胞增殖、转移相关基因等,本部分是分析其中的30个基因在早期NSCLC中表达情况,寻找与早期NSCLC术后化疗效果密切相关的基因,通过Logistic回归分析获得一组分子指标以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗。方法:利用组织芯片(tissue microarray,TMA)技术和免疫组织化学二步法,对86例行术后辅助化疗的早期非小细胞肺癌标本进行Caspase-3、Fas、Bax、Bcl-2、Survivin、PCNA、Ki67、MGMT、P53、P63、P73、P16、P27、VEGF、nm23、P-gp、MRP、LRP、GST-π、TopoⅡ、C-myc、Cyclin-D1、Her-2、Cox-2、Ku70、Ku80、DNA-PKcs、ERCC1、MSH2、BCRP30种化疗相关蛋白检测。结果:30种化疗相关蛋白在肺癌组织中表达的阳性率为27.9%至91.9%不等。经过单因素分析,与早期NSCLC术后化疗效果密切相关的基因有8个,Survivin、P-gp、LRP、Ki67、P53、ERCC1高表达,NSCLC术后化疗效果差;Bax、VEGF低表达,NSCLC术后化疗效果差。通过Logistic回归分析ERCC1、Survivin、Bax、VEGF4个因子进入方程,方程分类能力达69.8%;方程有效性经卡方检验X~2=29.15,P=0.000。结论:在单因素分析中ERCC1是判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果最敏感的指标,可以进一步深入研究。通过多因素分析ERCC1、Survivin、Bax and VEGF是一组判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果,指导早期非小细胞肺癌的术后治疗的分子指标。对于其可靠性有待于扩大病例进一步研究。第三部分ERCC1基因在肺癌组织及肺癌细胞系中表达分析目的:ERCC1是判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果最敏感的指标,本部分首先观察ERCC1基因在肺癌细胞系、肺癌组织与癌旁正常肺组织中表达情况,对ERCC1基因的表达特性有一定了解。然后通过耐药细胞系与亲本细胞系中ERCC1mRNA差别及分析单独行化疗的肺癌中ERCC1基因表达情况,进一步证实ERCC1基因表达与肺癌化疗的关系。方法:首先应用半定量RT-PCR方法检测6株肺癌细胞及30例肺癌组织与癌旁正常肺组织中表达情况。第二使用高浓度反复间歇诱导法建立了对多种化疗药物耐药的细胞系A549/DDP,并用RT-PCR方法检测耐药的细胞系和亲本细胞系中ERCC1表达差别。最后利用免疫组织化学法检测65例单独行化疗的NSCLC中ERCC1表达。结果:与癌旁正常肺组织相比ERCC1在肺癌组织表达明显降低。成功建立了肺癌耐药的细胞系A549/DDP,与亲本细胞A549相比其对常规化疗药物的耐药指数增加了4-5倍,ERCC1在A549/DDP表达明显高于A549细胞。在单独行化疗的NSCLC中,ERCC1表达阳性患者的化疗效果明显差于ERCC1表达阴性患者。结论:ERCC1表达降低可能与肺癌的发生有一定联系,体外细胞实验和体内临床病理分析证实ERCC1基因表达与肺癌化疗密切相关,ERCC1基因表达增高,化疗效果不佳。第四部分ERCC1基因的初步功能分析目的:ERCC1是与肺癌化疗密切相关的基因,本部分主要通过基因克隆,细胞转染的技术进一步了解ERCC1基因的生物学功能并初步探讨其引起癌细胞化疗耐受的机制。方法:首先采用基因克隆的方法构建ERCC1基因真核表达载体,用脂质体将载体转染致肺癌细胞H1299中,用G418筛选稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-Blot技术证实ERCC1基因转染成功。第二采用细胞生长曲线,克隆形成实验,细胞侵袭实验,流式细胞仪分析细胞生长周期等方法了解ERCC1基因转染对以上细胞生物学行为的影响。第三采用MTT法检测ERCC1基因转染对各种化疗药物毒性反应的影响。最后利用流式细胞术检测细胞膜蛋白P-gp、MRP的表达,利用高效液相色谱仪检测细胞内药物浓度,探讨ERCC1基因转染引起癌细胞化疗耐受的机制。结果:成功构建ERCC1基因真核表达载体PCDNA3.1/ERCC1,通过筛选建立了稳定转染细胞系H1299/ERCC1和H1299/Vecter。生长曲线、克隆形成实验、细胞侵袭实验、流式细胞仪分析细胞生长周期等实验显示:H1299/ERCC1和H1299/Vecter在以上实验中无差别。化疗药物毒性反应实验显示H1299/ERCC1较H1299/Vecter对顺铂的耐药指数增加4.23倍。流式细胞术检测细胞膜蛋白P-gp、MRP的表达及高效液相色谱仪检测细胞内药物浓度结果显示H1299/ERCC1和H1299/Vecter无明显差异。结论:ERCC1表达与细胞增殖、细胞侵袭、细胞周期失调等特性关系不大。ERCC1基因表达增高,细胞可以出现化疗耐药,初步研究显示ERCC1基因导致的化疗耐药并非传统的耐药机制(如膜转运蛋白表达差异)使药物摄入减少及外排增加引起,可能与DNA损伤与修复机制改变有关。第五部分RNA干扰抑制肺癌细胞ERCC1基因表达的初步功能分析目的:ERCC1基因在肺癌细胞的各种生物学行为中并不扮演重要角色,其改变主要是引起细胞对化疗药物的敏感性改变,是功能比较单一的基因,可能是提高非小细胞肺癌化疗疗效的一个有潜质的新靶点。本部分主要通过RNA干扰技术抑制肺癌细胞ERCC1基因表达,进行初步功能实验。方法:首先通过构建ERCC1基因及β-actin基因的克隆载体作为标准品,建立ERCC1基因荧光实时定量PCR检测平台。第二构建针对ERCC1基因的SiRNA真核表达载体,瞬时转染肺癌细胞A549,采用RT-PCR和Western-Blot技术证实转染细胞中ERCC1基因沉默效果良好。最后采用MTT法检测构建真核表达载体转染细胞对顺铂药物毒性反应的影响。结果:荧光实时定量PCR能够准确检测样本中ERCC1基因的mRNA表达水平。成功构建针对ERCC1基因的SiRNA真核表达载体,将其转染肺癌细胞A549,可以抑制细胞中ERCC1基因表达。RNA干扰的A549细胞较亲本细胞对顺铂的耐药指数降低了2.93倍。结论:RNA干扰是一种沉默ERCC1表达的理想方法。沉默ERCC1表达可以提高肺癌细胞的化疗敏感性,它可能是一种有潜质的肺癌辅助治疗新方法。
连海[3]2006年在《新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因抗肿瘤作用及其信号传导机制》文中研究指明本研究通过细胞生物学和分子生物学手段,揭示了新城疫病毒HN基因和鸡贫血病毒Apoptin基因对人肺癌细胞SPC-A1的作用与细胞内线粒体途径的关系。评价了Apoptin和IL-18重组子以及重组鸡痘病毒vFVHN和vFVVP3对C57BL/6小鼠Lewis肺癌肿瘤模型的治疗效果。结果显示,Apoptin和IL-18联合治疗不但显著抑制小鼠肿瘤生长,且能够提高治疗小鼠的存活率。IL-18在小鼠体内发挥了免疫佐剂的作用,诱导强的NK和LLC特异性的CTL反应,并促使免疫反应趋向Th1优势。本研究又利用表达谱芯片结合生物信息学软件,综合分析了KEGG、BioCarta、GenMAPP三大数据库信息,证明了一些重要的信号传导通路以及关键的激酶调控蛋白与HN基因和Apoptin基因的抗肿瘤作用密切相关。对于肺癌细胞HN基因主要作用于线粒体,激活Caspase-3;对于结直肠癌细胞它主要通过抑制BFAR和NFκβ1双重调控细胞内和细胞外的凋亡途径;而对于肝癌细胞的作用机制可能与p38MAPK途径相关。上述研究为进一步阐明新城疫病毒HN基因和鸡贫血病毒Apoptin基因的抗肿瘤机制奠定了基础。
张叔人, 王盛典, 张友会[4]1997年在《人白细胞介素15cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达》文中研究表明白细胞介素15(IL-15)是近几年新发现的细胞因子,为了深入研究该因子,找们从人单核细胞中克隆了IL-15的cDNA,构建了原核表达质粒,并成功地制备了高纯度基因重
孙启峰[5]2016年在《CK19基因重组腺病毒转染树突状细胞在Lewis肺癌免疫治疗中作用的研究》文中指出当前无论在恶性肿瘤的发病率还是死亡率中,肺部恶性肿瘤均居首位。在临床工作中手术、化疗、放疗仍是其主要的治疗手段,但治疗后的生存率和预后仍很不理想。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前体内的抗原呈递能力最强大的细胞,具有诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte CTL)生成的能力。有研究表明恶性肿瘤的发生、发展及预后均与树突状细胞有一定关系。自身免疫逃逸是恶性肿瘤的发生的重要机制之一,其主要原因是因为DC细胞数量在瘤内及瘤旁组织中减少从而导致DC无法递呈肿瘤相关抗原、激活细胞毒性T淋巴细胞,诱导特异性免疫反应杀伤肿瘤细胞。因此我们认为,DC细胞在肺恶性肿瘤细胞的免疫逃逸机制中亦起到关键作用。肿瘤疫苗或肿瘤免疫治疗的基本原理是通过体外或体内给予患者肿瘤抗原来激发患者的被动或主动的免疫反应,从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。疫苗具备治疗特异性强,且在一定时间段内具有记忆性等优点,可以有效的预防肿瘤的复发或转移。当前,以DC细胞为载体制备的肿瘤疫苗,从而诱导精准的抗肿瘤的免疫治疗已成为肿瘤治疗的研究热点。同时,细胞免疫治疗较常规的放化疗的毒副作用小,对正常细胞及器官损伤降到最低。而细胞免疫治疗的关键是其精准地靶向治疗,既通过肿瘤特异性的抗原作为信号,从而诱发CTL效应。作为外来抗原肿瘤抗原具有免疫原性低的特点,但其识别是特异性细胞免疫治疗的基础。所以选择适合的肿瘤相关抗原成为精准肿瘤免疫治疗的关键。细胞角蛋白(Cytokeratin, CK)广泛存在于上皮癌的细胞中,为细胞骨架的组分之一。CK分子具有至少20个不同的亚型(CK1～CK20),其中CK19蛋白在上皮性癌细胞的表达最为特异,细胞角蛋白19(CK19)片段在恶性肿瘤诊断中最为重要,这也使得CK19成为肿瘤检测及细胞免疫治疗的可能靶点。在第一部分中我们通过实验证实CK19蛋白在Lewis肺癌细胞中表达增高,说明CK19蛋白在肺癌的发生中起到重要作用,CK19蛋白可以作为肿瘤细胞免疫治疗的靶向抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向性免疫治疗的细胞,其可用于体内和体外研究。因此我们选择CK19作为肺癌细胞免疫治疗的靶点具有十分良好的前景。目前于体外获取和培养DC细胞的技术口趋成熟,于体外通过将肿瘤抗原相关基因或抗原转入DC细胞中,从而制备肿瘤特异性疫苗越来越受到人们的关注和认可。通过重组腺病毒载体将目的基因转入DC细胞中是当前制备肿瘤免疫疫苗的最有效的方法,而构建含有靶向基因的重组腺病毒是转染DC细胞制备疫苗的前提条件。AdMax系统是目前制备重组腺病毒最为高效的方法之一,在我们实验设计的第二部分中,我们即利用通过AdMax系统构建携带肺癌靶向基因CK19的重组腺病毒。经过测序鉴定成功构建重组腺病毒后,在实验的第三及第四部分分别将含有肿瘤靶向基因CK19基因的重组腺病毒(rAd-CK19)转染DC细胞后,检测DCs细胞表型变化,及CK19蛋白表达情况,确定制备成功rAd-CK19-DCs疫苗。在转染成功后将DC疫苗免疫接种到Lewis肺癌小鼠模型中,通过检测肿瘤体积及重量的变化来评价人工肿瘤免疫疫苗在抗Lewis肺癌中的治疗效果。第一部分检测小鼠Lewis肺癌细胞中CK19的表达[研究目的]第一部分拟通过实验证实CK19mRNA及蛋白可以作为细胞免疫治疗的靶向基因或抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向免疫治疗的实验细胞。[研究方法]通过PCR法检测Lewis肺癌细胞CK19 mRNA的表达,证明CK19在肺癌细胞中高表达；Western-blot法检测Lewis肺癌细胞CK19蛋白的表达,并使用免疫荧光检测CK19蛋白在Lewis肺癌细胞中的表达及定位。[结果]Lewis肺癌细胞CK19 mRNA阳性表达,且通过荧光染色显示CK19蛋白在其细胞膜上广泛表达,提示CK19蛋白可以作为免疫治疗的目标靶点。同时DC细胞CK19蛋白阴性表达,显然Lewis肺癌细胞中CK19蛋白表达水平明显高于DC细胞。[结论]第一部分实验采用Real-time PCR、Western-blot、免疫荧光的方法检测了Lewis肺癌细胞CK19显著表达。CK19蛋白可以作为肿瘤细胞免疫治疗的靶向抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向性免疫治疗的细胞,用于体内和体外细胞免疫治疗的研究。第二部分利用AdMax系统构建重组腺病毒rAd-CK19载体[研究目的]利用AdMax系统构建携带人CK19基因的重组腺病毒(rAd-CK19)载体,为下一步转染DC细胞制备肿瘤免疫疫苗做好准备。[研究方法]重组腺病毒(rAd)转移质粒载体pTR-UF5为基础构建CK19表达载体pTR-UF5/CK19。利用AdMax包装系统,首先以质粒PTR-EGFP-CK19为模板,通过PCR扩增人CK19基因cDNA片段,然后将所得的穿梭质粒pDC316-CK19和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre利用CaCL2方法共转染入293细胞(293细胞因其容易转染的特点,是目前研究外源基因最为常用的细胞株)中,得到重组腺病毒Ad/CK19。然后使用Cs CL梯度法离心和纯化重组成功的腺病毒,以及TCID50法来测定重组腺病毒的滴度。[结果]结果显示,通过双酶切法来检测腺病毒穿梭质粒pDC316-cmv-EGFP-CK19片断大小,根据测序插入的目的基因与Gene Bank中报告的CK19cDNA进行对比,完全符合CK19基因表达。然后,通过AdMax系统,利用构建好的穿梭质粒和辅助质粒构建了重组腺病毒rAd-CK19。[结论]我们成功构建了含有肺癌相关抗原基因CK19的重组腺病毒载体Ad/CK19。经过RT-PCR检测符合预期(138bp)大小的片断,从而证实重组病毒构建成功。为下一步重组腺病毒Ad/CK19转染DCs细胞制备肺癌免疫疫苗治疗肺癌打下了基础。第三部分CK19基因修饰重组腺病毒转染树突状细胞后CK19表达分析及其表型改变[研究目的]在这一部分实验中我们将利用已构建成功的重组腺病毒rAd-CK19载体,将肿瘤靶向基因CK19通过重组病毒转入DCs细胞中,并检测转染后DCs细胞的表型变化,确定是否转染成功,从而制备为CK19基因修饰的DCs免疫疫苗。[研究方法]在该实验中,于转染的24h前将DC细胞接种于培养板,并加入不含抗生素的完全培养基。将pTR-UF5/CK19载体或pTR-UF5载体稀释于无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。在不含有抗生素和血清的培养液中加入Lipofectamine2000并稀释,然后缓慢摇匀后,于室温下进行孵育。然后使用PBS溶液清洗培养基内细胞。将清洗后的细胞复合物置入培养孔内均匀摇动以使其分布均匀。感染2小时后,收集感染细胞更换为含GM-CSF和IL-4的RMPI1640培养基,继续培养2天。转染后使用Real-time PCR、Western-blot、免疫荧光方法检测转染后DCs细胞中CK19的表达水平。另通过流式细胞仪检测DCs细胞在修饰后的表型(CD80,CD86, MHC-Ⅱ)改变。[结果]DCs细胞中CK19基因很弱的阳性表达,转染带有CK19基因腺病毒载体后CK19基因成高阳性表达,而空腺病毒载体对DCs细胞CK19基因表达没有影响。DCs细胞中CK19蛋白很弱的阳性表达,转染带有CK19基因腺病毒载体后CK19蛋白成高阳性表达,而空腺病毒载体对DCs细胞CK19蛋白表达没有影响(M0I200)。DCs细胞转染CK19以后DCs表面的CD80, CD86, MHC-Ⅱ均比转染前表达高。结果显示转染CK19有明显的促进DC细胞成熟的作用。[结论]本实验中利用同源重组原理构建CK19的重组腺病毒载体并纯化,为以CK19基因作为靶基因。然后,将携带Ad/CK19基因的合成腺病毒转染树突状细胞(DC),合成肺癌免疫疫苗rAd-CK19-DCs。为下一步体内实验利用DC细胞诱导特异性的细胞毒性T细胞(CTL)免疫反应治疗肺癌打下基础。第四部分转染CK19基因的DCs肿瘤疫苗在鼠体内抗瘤活性的研究[研究目的]根据《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》和《抗肿瘤药物药效学指导原则》的要求,评估在实验第三部分中制备的肿瘤免疫疫苗(rAd-DC-CK19)对接种Lewis肺癌细胞的小鼠的治疗作用。[研究方法]通过体外应用携带CK19基因的rAd-CK19感染DCs细胞制成的特异性疫苗(rAd-CK19-DCs),继而免疫接种Lewis小鼠肺癌,来观察瘤体生长速度(测量肿瘤体积),评估其对小鼠肺癌肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。通过实验证实rAd-CK19-DCs疫苗可以有效抑制肺肿瘤的生长。[结果]结果显示：接种了特异性肿瘤疫苗(DC-CK19)后,实验制备的DC疫苗对肿瘤细胞的生长有着明显的抑制作用,在小鼠体内的肿瘤生长也明显延缓；rAd-CK19-DCs治疗组肿瘤体积也小于对照组(rAd-c DCs组或DCs组)的肿瘤体积。通过体内实验证实制备的rAd-CK19-DCs疫苗能诱导出小鼠CK19表位的肿瘤特异性免疫反应,并在小鼠体内产生明显的抗肺癌细胞生长的反应。[结论]实验证明我们制备的肿瘤疫苗(rAd-CK19-DCs)能够明显地抑制肺癌细胞在小鼠体内的生长。这一实验结果说明利用肿瘤特异抗原或基因为靶点,制备特异性肿瘤疫苗的方法将成为肺部恶性肿瘤精准治疗的有力武器。
张蕾[6]2008年在《CIK细胞毒活性增强的机理及穿孔素N端肽段放射诱导表达研究》文中进行了进一步梳理细胞毒T细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)是体内参加抗肿瘤免疫的主要效应细胞,直接释放细胞毒颗粒是这两种细胞杀伤靶细胞的主要机制。细胞毒颗粒主要由效应分子穿孔素(PFN)、颗粒溶素(GNLY)和颗粒酶组成。CIK细胞(cytokine-induced killer)是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外用多种细胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α)诱导培养后获得的一群异质细胞。CIK对肿瘤细胞具有很强的杀伤活性,病人自体细胞诱导后回输CIK辅助治疗肿瘤的方法已经在临床上得到应用。但CIK细胞毒活性增强的分子机理尚不明了。我们测定了健康人和肿瘤患者PBMC以及CIK细胞的抗肿瘤活性,同时也检测了两种细胞中PFN和GNLY蛋白的表达情况,初步分析研究CIK细胞活性增强的分子机理。进行了PFN-N端真核放射诱导表达载体的构建和在肺癌细胞中表达,进一步验证了通过X射线的方法来控制细胞中与癌症相关的外源基因表达的可行性。一、CIK细胞毒活性增强的机理研究1.健康人和肿瘤患者PBMC细胞毒活力及细胞毒效应分子的测定。采集4名健康人和10名恶性肿瘤患者外周血10ml,分离PBMC细胞,一部分用直接荧光标记法分析细胞毒效应分子PFN和GNLY的表达,一部分用LDH释放法进行PBMC细胞对K562的杀伤活性测定。还有部分细胞用于诱导培养形成CIK细胞。2.健康人和肿瘤病人CIK细胞毒活力及细胞毒效应分子的测定。将上述PBMC用诱导培养基培养7～10天获得CIK细胞,同上方法进行CIK细胞内两种蛋白的表达测定及对K562的杀伤活性测定。将诱导后的两组实验结果进行比较,并分别将健康人和肿瘤病人细胞诱导前与诱导后的实验结果进行比较。结果显示,肿瘤病人PBMC对K562细胞的杀伤活力显著低于健康人(P＜0.05),而且细胞毒效应分子PFN、GNLY表达水平也低于健康人;诱导培养后,肿瘤患者和健康人的CIK对K562的杀伤活力都比PBMC有大幅度的提高,且肿瘤病人为显著提高(P＜0.01);细胞毒效应分子在二组CIK细胞中的表达量发生分歧:健康人和肿瘤患者CIK细胞GNLY表达量都较PBMC增高,肿瘤患者实验组增高显著(P＜0.01),但PFN表达都显著降低(P＜0.05)。结果表明,肿瘤病人CIK细胞杀伤活性提高与GNLY基因的表达量升高具有正相关性。而PFN基因表达量却有所降低,这一现象可能与淋巴细胞某种自我反馈调节途径相关。二、人穿孔素N末端肽段的放射诱导表达研究早期生长反应因子1(early growth response-1,Egr-1)基因启动子区含有6个高度保守的CC(A+T)_6GG基序(motif),可在电离辐射产生的氧自由基刺激下诱导下游基因的表达,从而实现对目的基因表达的时空调控。穿孔素(perforin,PFN)在肿瘤免疫中发挥着重要作用,而且第一部分的研究结果证实了,很多肿瘤患者的外周血淋巴细胞中PFN的表达量低于健康人,这与肿瘤的发生发展有着不可忽略的联系。因此,我们拟采用真核表达系统表达PFN生物学活性片段,以期在体外研究PFN片段蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用。我们利用上述Egr-1启动子的特性,将人穿孔素氨基端片段连接到Egr-1启动子下游,构建成真核表达载体,对其进行放射诱导表达研究。1.构建人PFN-N肽段的真核放射诱导表达载体。以克隆有hPFN全长cDNA序列的载体pcDNA3.1(+)/hPFN为模板,设计PFN-N基因的上下游引物,用PCR扩增hPFN-N,经Nhe I、Kpn I双酶切后,将该基因片断克隆到含放射诱导启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Egr-1中,重组质粒转入大肠杆菌JM109进行阳性克隆筛选,并通过PCR和双酶切法鉴定为所需重组质粒。2.PFN-N端基因在肺癌细胞SPC-Al中的放射诱导表达。在脂质体作用下将重组质粒转染SPC-Al细胞,经过X射线的放射诱导后,应用RT-PCR、细胞免疫化学法检测hPFN-N蛋白的表达,用MTT法测定该蛋白对靶细胞的杀伤活性。结果显示,成功构建了真核放射诱导表达载体pcDNA3.1(+)/Egr-hPFN-N。以重组体转染SPC-Al细胞后,用RT-PCR检测到hPFN-N mRNA的表达。细胞免疫化学法检测结果呈阳性反应,MTT法检测结果为rhPFN-N对靶细胞的杀伤活力为29.2%。本实验成功的构建了PFN-N端的真核放射诱导表达载体,实现了人PFN-N在肺癌细胞中的表达,并证明了该基因的表达可受X射线的时空调控,并且基因产物对靶细胞具有一定的杀伤作用。
白华[7]2009年在《NK4真核表达载体的构建及转染子宫颈癌细胞的相关研究》文中提出前言肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)最早是从部分肝切除的大鼠血清中分离得到的,是一种很强的刺激肝细胞增殖的分裂原。成熟的HGF分子由α链(69kD)和β链(34kD)通过二硫键连接组成异二聚体。α链有4个Kringle区,其N端有一个发夹样结构,α链N端的发夹样结构与前两个Kringle区结构为HGF发挥生物学效应所必需;β链具有丝氨酸蛋白酶样结构,但由于其激活部位的两个氨基酸发生了替换,所以没有蛋白酶的催化活性。HGF主要通过细胞膜上的特异性受体c-Met发挥其生物学效应。HGF-c-Met信号传导通路广泛存在于各种细胞中,对多种组织器官的生长发育具有重要的生理调节功能。但当细胞过表达HGF或c-Met时,常常导致细胞发生癌变,而且对多种肿瘤细胞的生长、侵袭和转移能力等具有重要作用。1997年Date等通过对重组人HGF进行消化裂解发现了一种新的HGF拮抗剂,它由HGFα链N末端的447个氨基酸和4个Kringle区域所组成,故命名为NK4,分子量为50kD。其结构与血管抑制剂——血管抑素具有显著的相似性。NK4可以与c-Met结合,竞争性地完全抑制HGF和c-Met的相互作用,影响HGF/c-Met系统的信号转导,从而抑制HGF所诱导的细胞的增殖、运动和形态形成等,但其本身不能诱导c-Met的酪氨酸磷酸化。体外研究证实N K4可抑制HGF诱导包括人的胆囊癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等细胞的运动和侵袭。宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一,严重威胁着妇女的健康与生命。随着社会的发展,一些肿瘤的流行病学因素也在不断地发生变化,如伴随人乳头瘤病毒感染的蔓延和播散,宫颈癌的发病年龄已经出现明显的年轻化趋势,因此,对妇科恶性肿瘤的治疗显得由为重要。新近的研究证实,NK4阻断HGF-c-Met途径和肿瘤血管形成的双重作用可成为抗肿瘤治疗的策略之一。在对肿瘤组织进行病理学分析时发现,N K4可显著抑制肿瘤组织中微血管的形成,抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。最近Saga等将含有N K4基因的表达质粒导入卵巢癌细胞系HRA中,结果发现N K4可显著抑制HRA细胞的迁移;明显抑制小鼠肿瘤的生长和腹水的形成,延长小鼠的生存期。因此,N K4不仅是HGF的拮抗剂,同时也是微血管形成的抑制剂。N K4在抗肿瘤的生长和侵袭转移治疗中可能具有重要作用,但有关其在妇科肿瘤中如子宫颈癌中的作用目前国外少见相关研究报道,国内未见报道。为此本课题的提出,旨在通过构建pBudCE4.1-EGFP/NK4真核细胞表达载体并进行子宫颈癌细胞系转染表达研究,及其对生长及转移的影响。为下一步建立动物移植瘤模型探讨NK4在动物体内的抗肿瘤作用提供依据。使N K4的基因转导成为肿瘤治疗的一条有效的新途径,从而进一步提高肿瘤综合治疗的临床疗效。实验材料和方法一、实验材料试剂RNA抽提试剂盒,RT-PCR试剂盒,琼脂糖凝胶回收试剂盒,限制性内切酶KpnⅠ,BglⅡ,Xbal-Ⅰ和HindⅢ,T4 DNA连接酶均购自Takara公司,感受态细胞Machl-T1,克隆载体pEasy-Blunt Simple载体购自北京全式金公司,pEGFP-N1质粒,pBudCE4.1载体,大肠杆菌DH5α,质粒抽提试剂盒,TaqDNA聚合酶Lipofectamine2000为广州泰康生物公司提供。Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(B620033,BIPEC BIOPHARMA,U.S.A)。基因测序由上海英骏公司完成。二、主要研究方法从人胎肝中抽提出总RNA,并以此为模板,利用人工合成的一对引物,采用RT-PCR技术获得NK4基因的cDNA,并引入酶切位点,先转入感受态质粒,再转化大肠杆菌进行扩增,筛选阳性克隆菌落,经酶切及测序,证实NK4基因已转入,并与构建好的pBudCE4.1-EGFP载体连接,制备出标记GFP(荧光)的双基因载体。酶切鉴定构建成功后,脂质体法将NK4质粒(选上述实验构建)转染至子宫颈癌细胞中。筛选阳性克隆进行指标检测:转染细胞NK4基因mRNA水平,蛋白表达的检测,及对Hela细胞生长,转移抑制研究。1、根据NK4的cDNA序列设计一对引物2、RT-PCR,产物1.0%琼脂糖凝胶电泳凝胶成像分析系统分析测定3、克隆NK4目的片段并鉴定4、重组质粒载体的构建与鉴定:获得pBudCE4.1-EGFP/HGF双基因表达载体。5、细胞培养及细胞转染脂质体法NK4质粒(上述实验构建成功)转染至子宫颈癌Hela细胞中。6、筛选阳性克隆进行指标检测:转染细胞NK4基因mRNA水平表达的检测(实时荧光定量PCR法);转染细胞NK4基因蛋白表达的检测(Western blot法)7、转染细胞荧光显微镜观察及生长曲线的测定细胞分组:正常对照组,空白载体转染组,NK4稳定转染组8、细胞凋亡检测:流式细胞仪FCM测定,用CELLQuest软件分析细胞凋亡,结果以凋亡细胞的百分率表示。9、转染NK4基因对Hela细胞运动转移抑制研究:采用Transwell小室法观察转染Hela细胞运动和转移的影响;通过实时荧光定量PCR法检测转染Hela细胞中的FN,MMP-2,MMP-9的表达。结果1、合成并克隆NK4基因片段并鉴定:凝胶电泳观察到约1326bp的NK4片段,构建含有NK4基因的真核表达载体(荧光标记)pBudCE4.1-e GFP/NK4质粒,NK4基因PCR扩增结果及重组质粒酶切的鉴定结果,切出约1326bp的片段,表明NK4片段插入pBudCE4.1-EGFP载体中,最终获得pBudCE4.1-EGFP/NK4载体。基因序列测序结果与Genebank序列一致。2、脂质体法NK4质粒转染子宫颈癌Hela细胞系中,转染细胞NK4基因mRNA水平可见阳性表达,且平均表达量为对照组的3.84倍;Western blot检测NK4基因蛋白水平的检测结果显示在培养液上清中可检测到一特异性条带,大小约50 Kd,与NK4蛋白预期分子量大小一致,证明重组质粒能有效介导目的基因NK4的表达。3、转染细胞生长曲线的变化通过直接计数法检测NK4基因转染前后的细胞生长情况,Hela细胞在前5天和10天的群体倍增时间分别为22h和24h,自第三天起进入对数生长期,与空载体组无显著差别。Hela/NK4细胞在前5天和10天的群体倍增时间为30h和28.2h,第3天进入对数生长期,至第10天最大细胞数为1.9×10~6,稍低于非转染细胞的2.5×10~6二者比较没有显著性差异(P＞0.05)。细胞凋亡检测:转染细胞组72h细胞凋亡率为30.4%,高于空载体组的22.1%和对照组的11.4%。Hela/NK4细胞组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。4、转染NK4基因对Hela细胞运动转移的发现:在不加HGF的情况下,转染空载体或NK4基因对Hela细胞的运动和转移没有影响(P＞0.05);与不加HGF的空白对照组相比加HGF的Hela细胞组和转染空载体组细胞的运动和转移指数显著高于空白对照组(P＜0.05);而转染NK4基因可显著抑制HGF所诱导的Hela细胞的运动和转移(P＜0.01),转染空载体组则无此作用(P＞0.05)。结果显示转染NK4的Hela细胞细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和-9表达减低,尤其MMP-9相对降低明显,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.05)。结论1、构建pBudCE4.1-EGFP/NK4真核表达载体并鉴定。2、转染子宫颈癌细胞系成功,转染细胞NK4基因mRNA水平及蛋白表达水平表达阳性,确认NK4的Hela细胞生长及促进其凋亡的结论。3、转染NK4基因可抑制Hela细胞的运动和转移,在子宫颈癌抗转移治疗中可能具有重要作用。为进一步建立动物移植瘤模型,探讨NK4在动物体内的抗肿瘤作用提供实验依据。为妇科恶性肿瘤的基因治疗提供依据。
刘现芳[8]2014年在《CDH1调控EGFR和DIRAS3表达及功能的机制研究》文中认为研究背景和目的癌症已经成为人类最主要的致死疾病之一,严重威胁人们的寿命,大多数恶性肿瘤患者死于肿瘤的扩散转移。可见,肿瘤转移的研究对肿瘤治疗有着重要的意义。EGFR属于受体酪氨酸蛋白激酶家族。一旦激活,EGFR细胞内酪氨酸激酶结构域发生磷酸化后激活PI3K, STAT, MAPK, Src等下游信号通路,调控细胞的增殖,存活,迁移和分化等多个生物学过程。EGFR的高表达和过度活化在肿瘤发生及转移中普遍存在。上皮型钙粘素(CDH1/E-cadherin)是介导同型细胞连接的钙依赖的粘附分子,CDH1表达下调通过打破细胞间粘附以及改变基因的转录表达促进癌症的转移。同时,CDH1的缺失参与肿瘤转移的重要步骤EMT的发生。从而,低水平的CDH1与肿瘤的转移,病人的不良预后密切相关。因此,EGFR和CDH1已经成为近年来肿瘤转移研究的热点分子。研究表明CDH1与EGFR这间存在相互调控,两者之间的相互作用影响多种癌症的发生发展。EGFR通过上调CDH1转录抑制因子Twist和Slug的表达,下调CDH1进而促进癌症细胞的EMT转换能力。另外,CDH1介导的细胞连接和其胞外结构域与EGFR的相互作用影响EGFR的活化及下游信号转导。然而,CDH1对EGFR表达影响的研究较少。最近的一项研究表明,在头颈癌细胞中CDH1表达下调能够转录激活EGFR的表达,最终促进头颈癌细胞的增殖。但是,在肺癌细胞中CDH1表达下调影响EGFR表达的分子机制并不清楚。YBXl作为一种癌蛋白不仅在包括肺癌在内的多种肿瘤细胞中过表达而且作为肺癌进展的标志性分子受到人们的广泛关注。研究表明,YBX1与EGFR的表达调控密切相关。在乳腺癌细胞中,YBX1能够与EGFR的启动子直接结合进而促进EGFR的转录表达,而这一表达调控依赖于YBX1S102的磷酸化。AKT作为丝氨酸苏氨酸激酶能够磷酸化YBX1第102位丝氨酸,使YBX1发生核转位进而促进其行使转录因子的功能。以上研究报道提示我们CDH1表达下调所引起的EGFR表达上调可能通过AKT信号通路活化YBX1进而调控EGFR的表达。DIRAS3是GTP结合Ras样蛋白,它作为肿瘤抑制基因在卵巢癌和乳腺癌细胞中表达下调。同时,DIRAS3的过表达能够削弱卵巢癌和乳腺癌细胞的增殖、自噬、凋亡和迁移。在我们的研究中发现CDH1表达下调促进乳腺癌细胞中DIRAS3的转录表达,但是其具体的调控机制并不清楚。综上所述,目前对肿瘤细胞中CDH1调控EGFR和DIRAS3表达的精细分子机制还不清楚,因而,有必要对这一问题进行研究。在本论文中我们利用细胞生物学和分子生物学的方法,研究肿瘤细胞中CDH1调控EGFR和DIRAS3表达的分子机制以及功能机制,期望以此了解肿瘤细胞转移过程中关键分子的调控网络,为开发具有高度特异性、更加高效的抗肿瘤药物提供新的靶标和肿瘤治疗策略。研究内容及研究成果1.CDH1表达下调诱导EGFR表达的分子机制研究在人的非小细胞肺癌细胞中,利用siRNA干扰抑制CDH1的表达或通过病毒感染稳定沉默CDH1的表达发现,短期或长期沉默CDH1都能够上调EGFR的表达。并且,瞬时过表达CDH1或通过病毒感染稳定表达CDH1后,EGFR的表达水平明显降低。进一步的RT-PCR结果显示,抑制CDH1的表达能够显著上调EGFR转录水平的表达。从而表明CDH1表达下调在转录水平诱导EGFR的表达。随后探究转录因子YBX1是否参与CDH1调控EGFR表达的过程。在稳定抑制CDH1表达的A549shCDH1和HI650shCDH1细胞中检测p-YBX1的水平,发现YBX1的磷酸化水平升高。并且,瞬时过表达CDH1或通过病毒感染稳定表达CDH1后, YBX1的磷酸化水平降低,表明CDH1表达下调能够激活YBX1。为了进一步检测CDH1表达下调所引起的EGFR表达上调是否依赖于YBX1的活化,我们利用siRNA干扰技术抑制CDH1表达的同时沉默YBX1的表达,发现抑制YBX1的表达能够削弱由CDH1沉默所引起的EGFR的表达上调。这些实验数据表明,CDH1表达下调所诱导的EGFR的表达依赖于转录因子YBX1的激活。接下来的实验进一步探究磷酸化的YBX1能否直接结合到EGFR启动子上调控EGFR的表达。利用包含不同突变形式的EGFR1kb启动子的荧光素酶报告质粒进行实验发现,与野生型的EGFR启动子相比,1b和2a两个YRE位点的突变削弱了由CDH1沉默所引起的EGFR启动子的活性的增强。同时,利用YBX1的相应抗体进行ChIP实验,结果显示沉默CDH1表达后,YBX1与EGFR启动子区的结合明显增加。以上实验表明,在人的非小细胞肺癌细胞中抑制CDH1的表达能够磷酸化YBX1,并且通过引起YBX1与EGFR启动子区结合的增加上调EGFR的转录表达。研究表明AKT信号通路能够诱导YBX1第102位丝氨酸的磷酸化,使其发生核转位进而调控基因的转录表达。但是CDH1表达下调能否激活AKT信号通路并不清楚。在稳定抑制CDH1表达的A549shCDH1和H1650shCDH1细胞中检测p-AKT的水平发现与对照细胞相比AKT的磷酸化水平升高。并且,瞬时过表达CDH1或通过病毒感染稳定表达CDH1后,AKT的磷酸化水平降低,表明CDH1表达下调能够激活AKT信号通路。为了进一步确定AKT信号通路在CDHl表达下调所引起的YBX1诱导EGFR表达中的作用,我们利用siRNA干扰技术抑制AKT的表达后发现,YBX1的磷酸化水平明显降低并且伴随着EGFR表达的下调。综上所述,CDH1表达下调能够激活AKT信号通路进而磷酸化YBX1,最终上调EGFR的表达。2.CDH1表达下调诱导EGFR表达的功能研究EGFR作为受体酪氨酸蛋白激酶家族的重要成员,在胞外信号向胞内传递的过程中发挥重要作用。EGFR受体过表达时,能够导致EGFR配体非依赖的激活。而CDH1表达下调能够诱导EGFR蛋白水平的表达,因此我们检测CDH1表达下调后EGFR下游信号通路的活化情况。实验发现不管短时沉默CDH1的表达(12h和24h),还是长时抑制CDH1的表达(72h),都能够活化c-Jun、ERK口Sre,激活EGFR下游信号通路。利用siRNA干扰技术抑制CDH1的表达或通过病毒感染稳定沉默CDH1表达后,一方面进行细胞增殖实验,发现抑制CDHl的表达能够显著增强肺癌细胞的增殖；另一方面进行细胞划痕实验和细胞侵袭实验,发现CDH1表达下调能够促进肺癌细胞的迁移和侵袭。我们的数据表明,CDH1表达下调也许通过调控YBX1和(?)EGFR促进肿瘤进展和转移。因此,我们进一步探究靶向抑制YBX1和EGFR的表达对CDH1表达下调所引起的肺癌细胞的高增殖和高转移能力的影响。在肺癌细胞中抑制CDH1表达的同时,分别抑制YBX1和EGFR的表达。通过细胞增殖实验,细胞划痕实验和细胞侵袭实验发现,沉默YBX1和EGFR的表达能够削弱CDH1下调所引起的肺癌细胞增殖,迁移和侵袭能力的增强。并且,在稳定抑制CDH1表达的A549shCDH1细胞中进行相同的实验,我们得到了相同的实验结果。3.CDHl表达下调诱导DIRAS3表达的分子机制研究沉默CDH1的表达后进行基因芯片分析发现,CDH1表达下调促进DIRAS3基因的转录表达。为了验证这一发现,我们在MCF7细胞中转染CDH1siRNA, RT-PCR结果显示MCF7细胞中沉默CDH1的表达可以显著上调DIRAS3转录水平的表达。基于CDH1通过YBX1调控EGFR的实验结果,我们推测在MCF7细胞中CDH1表达下调是否同样通过激活转录因子YBX1调控DIRAS3的表达。首先,在MCF7细胞中沉默CDH1的表达后,检测发现YBX1的磷酸化水平和DIRAS3的表达明显增加。随后,在MCF7和MDA-MB-231细胞中过表达YBX1,发现YBX1过表达能够增加DIRAS3转录水平和蛋白水平的表达。同时,抑制MCF7和MDA-MB-231细胞中YBX1的表达能够降低DIRAS3的表达。这些实验数据表明,CDH1表达下调所诱导的DIRAS3的表达上调依赖于转录因子YBX1。接下来,进一步探究YBX1作为转录因子能否与DIRAS3的启动子结合。利用YBX1的相应抗体进行ChIP实验发现,加入YBX1抗体的实验组中YBX1与D1RAS3启动子区YREs的结合明显增加。随后,在MCF7细胞中转染CDH1siRNA12小时后进行ChIP实验。结果显示沉默CDH1表达后,YBX1与DIRAS3启动子区3个YREs位点的结合增加,分别是-218360,-809——907和-984——1173。以上数据表明,在乳腺癌细胞中抑制CDH1的表达能够磷酸化YBX1,并且能够引起YBX1与DIRAS3启动子区结合的增加进而上调DIRAS3的转录表达。综上所述,在乳腺癌细胞中,CDH1表达下调能够激活转录因子YBX1,进而上调DIRAS3的转录表达。结论1.在肺癌细胞中,CDH1表达下调能够激活AKT信号通路进而磷酸化YBX1,最终在转录水平上调EGFR的表达。2.CDH1表达下调引起EGFR表达增加后激活EGFR下游信号通路,并且CDH1表达下调能够促进肺癌细胞的增殖和转移。3.靶向抑制YBX1和EGFR能够削弱CDH1表达下调所引起的肺癌细胞的高增殖和高转移能力。4.在乳腺癌细胞中,CDH1表达下调能够激活转录因子YBX1,进而上调DIRAS3的表达。
佚名[9]2010年在《肿瘤免疫》文中研究表明免疫系统对肿瘤化疗的系列反应现象刘辉吴晓鑫大连医科大学临床免疫学教研室,大连116044肿瘤的发生发展及其转归与特定的机体免疫状态及免疫应答能力密切相关,而且肿瘤的免疫疗法亦是当前治疗恶性肿瘤最有希望的方法之一。但目前治疗肿瘤化疗方法仍占主要地位,由于各种化疗药物多是细胞毒性物质,因而大多数人推测化疗药物对机体免疫系统一定有不同程度的抑制作用,而对肿瘤患者化疗时机体免疫功能状态的检测并没有系统的实验评估,对化疗病人各阶段的免疫状况亦缺乏较全面的认识。
欧阳雯[10]2014年在《死亡受体DR4/DR5的膜转运水平在肺癌细胞TRAIL耐受中的作用研究》文中提出第一部分原发性TRAIL耐受机制的研究目的：验证两种肺癌细胞A549与H460对TRAIL敏感性的差异,分析A549和H460细胞死亡受体的表达水平与TRAIL敏感性的关系,探讨DR4的基因表达抑制对A549细胞TRAIL敏感性的影响,检测两种肺癌细胞TRAIL所诱导的死亡受体向膜脂筏区重分布水平的差异,验证死亡受体向膜脂筏区聚集的功能与肺癌细胞的TRAIL敏感性有关。方法：MTT法分别检测TRAIL对A549与H460细胞的药物毒性,流式细胞学方法检测TRAIL所诱导的细胞凋亡水平。RT-PCR与western blot分别检测A549与H460细胞中死亡受体DR4与DR5的表达水平。根据DR4序列设计相应的siRNA,转染至A549细胞内,RT-PCR与western blot验证DR4的基因表达抑制。MTT法与流式细胞学方法分别检测DR4基因表达抑制的A549细胞的TRAIL敏感性。免疫荧光染色结合流式细胞术检测TRAIL所诱导的死亡受体膜聚集水平。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,通过western blot检测TRAIL所诱导的DR4、DR5,以及pro-caspase8在两种肺癌细胞中向脂筏区重分布水平的差异。制霉菌素预处理TRAIL敏感的H460细胞,干扰其脂筏功能,反向验证死亡受体向膜脂筏区转运的功能与TRAIL敏感性相关。结果：MTT法与流式细胞学方法均验证了A549为原发性TRAIL耐受的肺癌细胞,H460为TRAIL敏感的肺癌细胞。RT-PCR与western blot检测发现：两种细胞的DR5表达水平相似,原发性TRAIL耐受的A549细胞反而具有更高的DR4表达水平。DR4-siRNA的转染成功抑制了A549细胞的DR4基因的表达。但MTT与流式细胞学结果显示：DR4基因的表达抑制对A549的TRAIL敏感性并未产生明显影响。免疫荧光染色结合流式细胞术发现：随着TRAIL诱导时间的延长,H460细胞膜表面含TRAIL的免疫复合物水平明显升高,而A549细胞无类似现象。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,caveolin-1被检测位于条带4、5处,证实该处为脂筏所在的位置,H460细胞经TRAIL处理后,死亡受体DR4与DR5,以及pro-caspase8向脂筏区移动,而A549细胞无此趋势。制霉菌素有效地抑制了死亡受体向膜脂筏聚集,导致了原来敏感的H460细胞对TRAIL所诱导的凋亡水平明显下降。结论：非小细胞肺癌A549细胞为TRAIL原发性耐受细胞,H460细胞为TRAIL敏感细胞。死亡受体的表达水平与肺癌细胞的TRAIL敏感性无明显正相关性,且DR4的表达水平在A549细胞的TRAIL原发性耐受中无关键作用。TRAIL所诱导的死亡受体向膜脂筏区的转运调节功能与肺癌细胞的TRAIL敏感性密切相关,A549细胞的原发性TRAIL耐受可能与死亡受体向脂筏区重分布的功能缺陷有关。第二部分获得性TRAIL耐受细胞株H460R的建立与鉴定目的：建立获得性TRAIL耐受的非小细胞肺癌细胞株H460R,验证亲本株H460细胞与耐药株H460R细胞的TRAIL敏感性的不同,检测H460R细胞对顺铂的治疗反应性是否发生变化。方法：我们以TRAIL敏感的非小细胞肺癌H460细胞为基础,通过无限稀释克隆形成实验和低浓度TRAIL诱导,建立获得性TRAIL耐受细胞模型H460R；使用含不同浓度rhTRAIL的完全培养基分别对H460与H460R细胞进行孵育,显微镜下直接观察细胞形态、CCK-8法检测药物对细胞的毒性、流式细胞术检测药物所诱导的细胞凋亡水平,验证H460R细胞的TRAIL耐药性；并采用CCK-8法检测两种细胞的顺铂剂量存活曲线。结果：成功建立了获得性TRAIL耐受的非小细胞肺癌细胞株H460R。光学显微镜下观察：未经任何因素处理的H460R细胞与H460细胞具有相同的细胞形态；经不同浓度的TRAIL处理后,H460细胞表现为TRAIL敏感细胞,而H460R细胞表现为TRAIL耐药。CCK-8试验检测TRAIL对两种细胞的毒性：随着TRAIL处理浓度的上升,H460与H460R细胞的存活率呈剂量依赖性均有所下降,但H460细胞的下降幅度更大,其中,H460的IC50约为50ng/ml,而H460R的IC50约为250ng/ml。同时,H460与H460R未经TRAIL处理时,其凋亡率无明显差异；给予50ng/ml TRAIL处理4小时后,H460的凋亡率明显高于H460R,并具有统计学意义。说明H460R获得性耐药细胞模型建立成功。最后,H460与H460R细胞经不同浓度的顺铂处理后,其细胞存活率相似,两者的剂量存活曲线几乎重合。结论：成功建立了获得性TRAIL耐受的非小细胞肺癌细胞株H460R；从形态学上验证了H460与H460R细胞具有相同的遗传背景；鉴定H460R为获得性TRAIL耐受细胞株；验证了H460R细胞仅对TRAIL耐受,对直接作用于细胞DNA的化疗药物顺铂未发生同样的耐药。第三部分获得性TRAIL耐受机制的研究目的：探讨获得性TRAIL耐受的H460R细胞死亡受体的表达水平与其亲本株H460细胞相比是否发生变化,分析死亡受体DR4与DR5表达水平的变化对H460与H460R细胞的TRAIL敏感性的影响,检测TRAIL所诱导H460与H460R细胞的死亡受体向膜脂筏区重分布水平的差异,验证死亡受体向膜脂筏区聚集功能的缺陷与肺癌细胞发生获得性TRAIL耐受有关。方法：RT-PCR与western blot分别检测H460与H460R细胞中死亡受体DR4与DR5的表达水平。根据DR4/DR5序列构建相应的过表达重组质粒、根据DR4/DR5序列设计相应的siRNA,并分别转染至H460与H460R细胞中,RT-PCR法验证基因的过表达或沉默效率,CCK-8与流式细胞学方法检测其TRAIL敏感性的变化。间接免疫荧光染色法结合流式细胞术检测TRAIL所诱导的死亡受体膜聚集水平在H460R及其亲本株H460细胞中的差异。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后,通过western blot检测TRAIL所诱导的DR4/DR5,以及pro-caspase8在脂筏区重分布的差异。免疫荧光双染色后共聚焦显微镜下观察TRAIL处理前后死亡受体在H460与H460R细胞中的定位与分布。制霉菌素预处理TRAIL敏感的H460细胞,干扰其脂筏功能,验证死亡受体在膜脂筏区转运功能的缺陷与获得性TRAIL耐受之间的相关性。结果：获得性TRAIL耐受的H460R细胞与H460细胞死亡受体的mRNA与总蛋白的表达水平相同,且TRAIL预处理并不影响死亡受体的mRNA与总蛋白的表达水平。CCK-8与流式细胞学结果显示：死亡受体过表达的H460与H460R细胞,TRAIL敏感性上升,反之,死亡受体表达沉默的细胞,TRAIL敏感性下降。间接免疫荧光染色结合流式细胞术发现：随着TRAIL诱导时间的延长,H460细胞的死亡受体的膜表达升高,而获得性TRAIL耐受的H460R细胞无类似现象。密度梯度超速离心法分离脂筏与非脂筏成分后：caveolin-1被检测位于条带4、5处,证实该处为脂筏所在的位置,H460细胞经TRAIL处理后,死亡受体DR4与DR5,以及pro-caspase8向脂筏区移动,而获得性TRAIL耐受的H460R细胞无此趋势。共聚焦显微镜下直接观察死亡受体在膜脂筏区的定位情况再次验证了前面的结果。最后,制霉菌素有效地抑制了死亡受体向膜脂筏聚集,导致了原来敏感的H460细胞对TRAIL所诱导的凋亡水平明显下降。结论：获得性TRAIL耐受的H460R细胞与其亲本株H460细胞具有相同的死亡受体表达水平,且TRAIL预处理不影响两种细胞死亡受体的表达水平。死亡受体的过表达与沉默试验验证了其表达水平是TRAIL所诱导的细胞凋亡的必要条件。死亡受体向膜脂筏区转运调节的功能与肺癌细胞的TRAIL敏感性密切相关,H460R细胞发生获得性TRAIL耐受可能与死亡受体向脂筏区重分布功能的缺陷有关。
参考文献：
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[10]. 死亡受体DR4/DR5的膜转运水平在肺癌细胞TRAIL耐受中的作用研究[D]. 欧阳雯. 武汉大学. 2014
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