（2江苏大学 江苏 镇江 212000）
【摘要】 目地：利用超高效液相色谱-质谱联用技术，建立同时测定四君子汤含药血清中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量的分析方法。方法：色谱柱：岛津超高效液相C18柱（150mm×2.1mm,2μm）；流动相：乙腈-水（梯度洗脱）；流速0.3mL·min-1；柱温：20℃；质谱条件为气动辅助电喷雾离子源（ESI），检测方式为正离子多离子反应监测（MRM），用于定量分析的离子为m/zRg1823.6→643.4；Re969.5→789.4；Rb11132.0→364.8。人参皂甘Rg1、Re、Rb1标准曲线的线性范围为0.5～1000ng﹒ml-1，测量标准偏差（RSD）均﹤5%，精密度和准确度等符合生物样品分析的要求。结果：表明该法准确、灵敏、特异，适用于四君子汤含药血清中人参皂苷Rg1、Re、Rb1浓度的同时测定。结论：通过本方法，测定出了四君子汤含药血清中人参皂苷Rg1、Re、Rb的含量，进一步阐明了人参为四君子汤发挥作用的主要物质基础。
【关键词】 超高效液相色谱-质谱联用；四君子汤；人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）29-0043-03
四君子汤为中药传统的健脾基础方，对肝纤维化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的临床疗效。四君子汤组方为人参、甘草、白术、茯苓，其发挥主要功效的为人参。人参皂甘Rg1、Re、Rb1为人参的代表性成分，也是四君子汤含药血清成分测定的目标。本文建立一种专属、灵敏、准确、操作简便的超高效液相色谱-质谱联用方法，用于四君子汤含药血清中人参皂甘Rg1、Re、Rb1的同时测定。
1.实验材料
1.1 药品、对照品与试剂
人参：亳州市京皖中药饮片厂，产地：吉林，批号：161001，中国。
白术：安徽井泉中药股份有限公司，产地：浙江，批号：20170801，中国。
茯苓：安徽惠隆中药饮片有限公司，产地：安徽，批号：20170701，中国。
炙甘草：安徽和济堂中药饮片有限公司，产地：内蒙，批号：20170901，中国。
对照品：人参皂甘Rg1(110704-201726)、人参皂甘Re(110703-201731)、人参皂甘Rb1(110754-201726)，均购自中国药品生物制品检定所。
1.2 实验动物
SPF级SD大鼠，雄性，体重180～200克，由江苏大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2009-0002。
1.3 实验仪器
岛津LCMS-8050三重四级杆质谱仪
岛津DGU-20A高效液相色谱仪
赛多利斯天平Secura 225D-1CEU
2.实验方法
2.1 四君子汤水提物的制备
按四君子汤处方,等比例分别称取人参（9g）、白术（9g）、茯苓（9g）、炙甘草（6g）药材，加水10倍浸泡3h，煎煮2次（第1次8倍量，第2次6倍量），每次１h，分离药渣，保留药液，将所有药液混匀浓缩至0.4g·ml，合并滤液，4℃冰箱储存备用。
2.2 药物血清制备
选择SD大鼠连续灌胃７天（每天２次），对照组给予蒸馏水，给药剂量为临床成人剂量*70*0.018/大鼠体重，在采血前禁食不禁水12h以上，末次给药后2h麻醉心脏取血，静置30min，离心（2000转/分）10min，分离血清。血清用0.2μm微孔滤膜除菌，-70℃冰箱储存备用。
2.3 含药血清的处理
随机取两只大鼠血清，约４ml，加入20ml甲醇快速混匀震荡，密闭超声提取15min，3000转/分离心10min，取得上清液后于40℃恒温条件下减压回收，干燥后残渣以1ml甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤，进样分析。
2.4 分析条件
色谱条件：shim-pack GIST C18色谱柱（150mm×2.1mm,2μm）；流动相Ａ：水，Ｂ：乙腈；流速：0.3mL·min-1；柱温：20℃；样品室温：4℃；进样量：３μl，梯度洗脱条件如表1所示。
表1 梯度洗脱条件
质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；喷雾电压：4KV；负离子检测；鞘气（N2）流速：3L/min；辅助气（N2）流速：10L/min；毛细管温度：300℃。采用全离子扫描方式，扫描范围m/z：100～1200，碰撞气体为氦气。
3.实验结果与讨论
3.1 分析方法的建立
3种皂苷一级质谱丰度最高的离子峰是[M+Na］+，有少量［M+H］+和［M+K］+，子离子扫描质谱图见图1～3，检测方式为正离子多离子反应监测（MRM），用于定量分析的离子为m/zRg1823.6→643.4；Re969.5→789.4；Rb11132.0→364.8；定性分析的离子为m/zRg1823.6→203.2；Re969.5→203.15；Rb11132.0→365.2。所用的色谱条件使被分析的化合物在17～30min内被洗脱出来（图４），人参皂苷Rg1、Re、Rb1的保留时间分别约为17.9、18.0、29.9min，以保留时间和各对离子的响应强度的比例作为定性分析标准，使方法的专属性更强，有效避免了血浆内源性物质对测定的干扰。
3.2 标准曲线
取空白血清0.5ml,加入人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照溶液，配制成浓度为0.5、5、10、25、50、100、1000ng·ml-1系列标准血清样品，按２.1血清制备方法处理后，进样分析，以测得的峰面积Ｙ对血药浓度Ｘ作直线回归，线性关系良好，标准曲线回归方程分别为：Rg1 Ｙ＝15502X+618，r=0.99998；Re Ｙ＝6037X+1194，r=0.99995；Rb1 Ｙ＝65X-605，r=0.9996；定量下限达到0.5ng·ml-1。
3.3 精密度和回收率
取空白血清0.5ml，配制成5、50、1000ng·ml-1浓度的样品血清，按2.1血清制备方法处理后，每个浓度5份样品同时测定，计算其标准偏差RSD%为精密度；将样品血清测得的色谱峰面积与空白血清提取后加入人参皂苷Rg1、Re、Rb1对准品溶液后测得的峰面积相比，考察方法的相对回收率，结果见表2。
表2 精密度和回收率
3.6 讨论
在临床上，四君子汤对肝纤维化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的临床疗效。但四君子汤对肝干细胞的作用机制何在，目前尚未阐明。通过对四君子汤含药血清的研究，检测出其中人参皂苷的三种即Rg1、Re、Rb1，由于它们在紫外区203nm有末端吸收，且血清中杂质也会有干扰，采用普通HPLC法测定灵敏度和专属性较差。本文建立的UPLC/MS/MS方法灵敏度高，结果准确，重现性好，操作简便快速，符合生物样品分析的要求，测定出了四君子汤含药血清中人参皂苷Rg1、Re、Rb的含量，进一步阐明了人参为四君子汤发挥作用的主要物质基础。
图1 人参皂苷Rg1的子离子扫描质谱图
图2 人参皂苷Re的子离子扫描质谱图
图3人参皂苷Rb1的子离子扫描质谱图
【参考文献】
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论文作者:尚如霞1,徐卫东2（通讯作者）,谢超1
论文发表刊物:《医药前沿》2018年29期
论文发表时间:2018/12/3
标签：人参论文; 血清论文; 离子论文; 四君子论文; 色谱论文; 皂苷论文; 质谱论文; 《医药前沿》2018年29期论文;