罗 波 蒋益泽 魏 东
成都中医药大学附属医院 四川 成都 ６１００７２ 作者简介:罗波,男,(１９８０－),硕士研究生,主治医师,主要研究方向:肝胆外科疾病研究.
【摘要】 目的 探索miR－２１在大鼠急性胰腺炎早期的变化及其临床意义.方法３６只SD大鼠分为３组,A 组(出血坏死性胰腺炎组)、B组(水肿性胰腺炎组)和C组(对照组),用１％和５％的牛黄胆酸钠沿胰胆管逆行注射,构建大鼠水肿性和出血坏死性胰腺炎模型.检测三组大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、IL－１ 和IL－６的变化,并做胰腺病理评分.用RT－PCR法检测三组大鼠血浆中的miR－２１的含量,用免疫组织化学法检测胰腺中的PTEN 的表达.结果A 组和B 组的血清淀粉酶、脂肪酶、IL－１、IL－６水平高于C组,差异有统计学意义(P＜０．０５);胰腺病理评分A 组高于B组和C组,差异有统计学意义(P＜０．０５);miR－２１在A 组的表达低于B组和C组,差异有统计学意义(P＜０．０５);PTEN 表达在A 组高于B组和C组,差异有统计学意义(P＜０．０５).结论miR－２１可能成为急性出血坏死性胰腺炎早期病情预测的指标,PTEN 在急性胰腺炎炎症的调控方面可能发挥了重要作用. 【关键词】 急性胰腺炎;胰腺炎模型;miR－２１;PTEN 蛋白StudyonChangesandFunctionofmiR－２１inSerumofRatsinEarlyStageofAcutePancreatitis LuoBo,JiangYize,WeiDong (TheAffiliated HospitalofChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu６１００７２,Sichuan,China)【Abstract】Objective:ToexplorethechangesofmiR－２１inratswithacutepancreatitisattheearlystageanditsclinicalsignificance．Methods:３６SDratsweredividedrandomizedlyintothreegroups．GroupAwerehemorrhagenecrotizingpancreatitisgroup．GroupBwereedematouspancreatitisgroup．GroupCwerethecontrolgroup．Theedematousandnecrotizingpancreatitismodelinratwasmadewith１％and５％sodiumtaurocholatealongtheretrogradepancreaticductinＧjection．Thecontrolgroupwasblankcontrol．Thelevelofamylase,lipase,IL－１andIL－６weretestedandthepancreaspathologicalscorewasassessed．ThelevelofmiR－２１wastestedbyRT－PCRandthePTENproteininpancreaswastestedbyimmunohistochemistry．Results:Theleavelofamylase,lipase,IL－１andIL－６ingroupAandBwerehigherthangroupC,thedifferencewasstatisticallysignificant(P＜０．０５)．ThepathologicalscoreofpancreasinAgroupwashigherthanthatinBgroupandCgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P＜０．０５)．TheleavelofmiR－２１ingroupAwaslowerthangroupBandgroupC(P＜０．０５)．TheleavelofPTENproteiningroupAwashigherthangroupBandgroupC(P＜０．０５)．Conclusion:MiR－２１maybeaindicatorofacutehemorrhageneＧcrotizingpancreatitisintheearlystage．PTENproteinmayplayanimportantroleintheregulationofinflammationinacutepancreatitis．【Keywords】Acutepancreatitis;Pancreatitismodel;miR－２１;PTENprotein 【中图分类号】R７３５【文献标识码】A 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０８９９－０３
急性胰腺炎(acutepancreatitis,AP)是消化系统常见的一种急性病变,依据最新的亚特兰大标准[１],可分为轻度(mildacutepancreatitis,MAP)、中重度(moderately severe acute pancreatitis,MSAP)和重度(severe acutepancreatitis,SAP).MAP病情较轻,病理变化常为胰腺充血水肿,呈自限性,预后较好.SAP病情变化大,常有胰腺的出血坏死,伴有一个或多个器官的功能衰竭,预后差,病死率高达３６％~５０％,如果伴有感染,死亡率更高[１].AP 不同的分型,其治疗策略差别也较大,所以AP病情的早期预测对于为其准确分型和采取相应的治疗措施有重要意义.目前用于AP早期预测的评分系统较公认的有:急性生理和慢性健康状况评分(acutephysiologyandchronichealthevaluationⅡ,APACHE Ⅱ)、Ranson评分、AP严重程度床边指数评分(bedsideindexforseverityinacutepancreatitis,BISAP)与CTSI评分等.这些评分系统对AP早期病情的评估有较大帮助,但他们各自的局限性也不能忽略.如APACHE Ⅱ评分项目太过复杂,临床运用有一定局限性;Ranson评分需入院后４８小时才能完成,可能会错过干预治疗的黄金时机;BISAP评分系统简便易行,但其推导过程中病因方面的信息有限,可能会限制其广泛应用[２];CTSI评分则依赖于设备,同时某些患者对造影剂过敏也影响其在临床上的运用.
因此,如何对AP 病情进行早期预测是众多医务工作者关注的问题.microRNA 是一类长为１８~２２nt的非编码RNA,参与了生物体内的许多生理过程,在细胞的生长、增殖和凋亡中发挥了重要的调控作用[３],可通过对mRNA 进行切割、降解和甲基化等方式来调节mRNA 的表达[４].microRNA 与许多疾病有关,可作为某些疾病的生物学标记物[５－６].miR－２１作为被研究较为广泛和深入的microRNA,被证明与炎症疾病有较大的关系.本文通过实验,观测miR－２１在急性胰腺炎早期的变化,对不同程度胰腺炎血清中miR－２１表达量进行比较,观察其是否有成为AP早期病情预测标记物的可能,通过对其可能的作用靶点的研究,初步探索其参与调控AP炎症的机制.
２ 材料与方法２．１ 模型的建立及分组 选用SPF级的８周龄雄性大鼠３６只(简阳达硕动物科技公司,SCXK(川)２００４),通过随机数字表法随机分为A 组(出血坏死性胰腺炎组)、B组(水肿性胰腺炎组)和C组(对照组),每组１２只.大鼠术前禁食１２h,用１．５％戊巴比妥钠０．２５ml/１００g(上海国药集团化学试剂公司)麻醉大鼠后,做腹部正中切口开腹,找到胰腺后,用一次性静脉输液针(山东威高公司)从胰胆管自十二指肠开口处逆行穿刺进入胰胆管,用微量注射泵(浙江浙大医疗设备有限公司)注射不同浓度的牛黄胆酸钠(北京索莱宝科技有限公司),A 组注射浓度为５％,B组注射浓度为１％.C组开腹后仅翻动胰腺,不注射药物.手术后６小时禁食水. ２．２ 标本的采集 分别于手术后１２小时、２４小时两个时相点对三组大鼠采血并处死大鼠,取其胰腺.采血后３０００转/分离心５分钟,取上清液,－８０℃冰箱冻存.胰腺用生理盐水简单清洗后固定于１０％中性甲醛内. ２．３ 血清学指标的检测 取三组大鼠的血清标本,大鼠血清的淀粉酶和脂肪酶采用全自动生化分析仪检测(Olympus２AU２７００)测定.试剂盒购于北京九强生物技术有限公司.采用ELISA 法检测大鼠血清中的IL－１及IL－６,试剂盒购于美国R&D公司.
２．４ 大鼠胰腺HE染色、病理评分及PTEN 蛋白的检测 于１０％中性甲醛中取出大鼠胰腺组织,通过全自动脱水机(美国Thermo公司)充分脱水后,石蜡包埋,４um 厚度切片,依次过二甲苯２次、梯度酒精,苏木素染色、分化、反蓝、伊红复染、过梯度酒精、二甲苯、中性树脂封片.光镜下进行观察,并做病理评分.切片制作完成后进行抗原的热修复,按说明书加入一抗,４℃过夜,标记二抗,DAB显色后苏木素复染,中性树脂封片,光镜下观察切片,细胞内出现棕黄色颗粒或团块为阳性细胞. ２．５ RT－PCR 测定miR－２１的表达水平 取上述冻存的血液标本,使用TRIzol法提取血浆中的总RNA,RNA 质量的检测用紫外吸收测定法、变性琼脂糖凝胶电泳.用提取的RNA 合成cDNA 后,进行实时定量PCR.RTPCR的反应体系为:２×MasterMix５ul、１０um 的PCR特异引物F０．５ul、１０um 的PCR特异引物R０．５ul、加水至总体积为８ul.反应条件为:９５℃,１０min;９５℃,１０sec;６０℃,６０sec,进行４０个PCR 循环.miR－２１和内参(miR－４８４)分别进行RealtimePCR反应.数据采用２－ △△ CT法进行分析.miR－２１ 和内参(miR－４８４)的引物序列详见表１.表１ miR－２１和内参(miR－４８４)的引物序列
注:GSP是对应miRNA 的特异引物,R是与RT引物相匹配的引物. ２．６ 统计学方法 采用SPSS１７．０做统计学分析,计量资料采用±,采用单因素方差分析对各组指标进行比较,采用LSD法进行组间两两比较.３ 结果３．１ 三组大鼠的淀粉酶和脂肪酶的比较 通过单因素方差分析,在造模后１２ 小时和２４小时,三组大鼠的血清淀粉酶水平差异有统计学意义(F＝１５．８３２、２２．６６８,P＜０．０５);通过LSD两两比较,A 组和B组的淀粉酶均高于C组,差异有统计学意义(P＜０．０５);A 组淀粉酶高于B组,但差异没有统计学意义(P＞０．０５).三组大鼠的血清脂肪酶水平差异有统计学意义(F＝５６．８８、７１．４,P＜０．０５);通过LSD两两比较,A 组和B组的脂肪酶均高于C组,差异有统计学意义(P＜０．０５),A 组脂肪酶高于B组,差异有统计学意义(P＜０．０５).详细结果见表２.表２ 各组大鼠淀粉酶、脂肪酶比较
注:a与C组相比P＜０．０５;b与B组相比P＜０．０５.４ 讨论AP是消化系统的一种常见的急性炎症,因为其分型的不同,预后的差别较大,干预和治疗的措施也不同,所以早期对AP病情的预测显得非常重要.目前对miR－２１的研究较为广泛,MarinoAL [７]等通过临床的回顾性研究,发现miR－２１乳腺癌转移的生物标志物;MishraS[８]等发现在前列腺癌中miR－２１可以通过下调抑癌基因P５７来参与前列腺癌的发生;UozakiH [９]等的研究表明miR－２１与胃部肿瘤的进展密切相关.MiR－２１不仅仅与肿瘤的发生、发展、预后等相关,许多研究也表明miR－２１与炎症性疾病有关.WuF[１０]等通过动物实验,发现miR－２１在大鼠结肠的炎症中发挥重要的调控作用;还有研究[１１]也表明miR－２１与缺血再灌注有重要的关系.基于许多miR－２１与炎症的相关研究和前期的预实验,我们选取了miR－２１为研究对象.在本研究中,血清学的指标淀粉酶和脂肪酶在A 组明显高于B组和C组,
炎性细胞因子IL－１、IL－６和胰腺的病理评分也是A 组高于B组和C组,说明A 组和B组模型的制造是成功的.通过RT－PCR检测各组miR－２１的表达情况发现,miR－２１在A 组的表达低于B组和C组,差异有统计学意义,而B组和C组miR－２１的表达差异没有统计学意义,这说明miR－２１在A 组中表达有一定特异性.miR－２１对于AP的病情有一定的预测作用.第１０号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen,PTEN)是PI３K信号通路中最重要的一个负性调节因子,同时PTEN 也是一个重要的抑癌基因[１２].PTEN 基因在哺乳动物早期胚胎中广泛表达,在机体内许多生理过程中发挥着重要的作用[１３].在肿瘤的发病过程中,PTEN 的功能往往因为体细胞突变、基因沉默等减少或丢失,与肿瘤相关的基因突变几乎发生在所有PTEN 域,提示其与肿瘤的发生和发展有关[１２].PTEN 与炎症的发生也有关系.有研究报道PTEN/PI３K信号通路参与巨噬细胞表型和功能分化的调节,在敲除PTEN 基因的动物模型中发现了更多不同类型巨噬细胞如库夫细胞的激活,从而使缺血再灌注的动物得到有效的保护[１４－１５].
在本研究中,我们通过查阅相关的文献发现PTEN 基因是miR－２１的下游靶基因[１６－１７].我们设想,miR－２１会不会通过下调PTEN 来参与炎症的调控? 因此我们对不同组别的大鼠胰腺的PTEN 蛋白表达通过免疫组化做了检测,发现,在A 组,PTEN 表达较高,而在B组及C组,PTEN 的表达较低.在本研究中PTEN 表达较高的大鼠中,血浆中的miR－２１含量较少,而当血浆中的miR－２１表达量增加时,PTEN 蛋白的表达量往往较少,此时炎症的严重程度也较低.这说明miR－２１可能是通过下调PTEN,从而使炎症反应减轻.本研究选择大鼠作为研究对象,而没有做临床的实验,因为大鼠的遗传背景较临床病人较容易控制,均一性较好.实验用大鼠取其胰腺观察其胰腺炎的病理状况较为直观,且通过对胰腺病理的评分,可以较准确地反映其发生胰腺炎的严重程度,达到量化的目的.通过观察A 组、B组和C组大鼠胰腺病理的严重程度和他们相应组大鼠外周血中几种miRNA 的表达状况,可以找出相关的miRNA 与胰腺炎严重程度的关系,从侧面反映某些miRNA 对于胰腺炎严重程度的预测作用.在本实验中,我们采用的病理学分组,在动物实验中直接使用临床的AP 分级诊断可能会造成一定误差,毕竟动物模型与人体疾病有一定差异,另外某些评估的指标测量存在一定困难.
本研究也存在一些缺陷和不足,由于本实验是动物实验,因此,由于大鼠与人体的基因存在一定的差异,所以本实验的结论要用于人体或临床,还需要进一步的临床实验来验证.总的来说,miR－２１可能成为急性出血坏死性胰腺炎早期病情预测的指标,同时,可能是通过影响PTEN 的表达来参与炎症的调控.
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论文作者:罗波 蒋益泽 魏东
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/9
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